基于術(shù)前人B-淋巴細(xì)胞趨化因子1檢測的肝細(xì)胞癌患者肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測模型的構(gòu)建及分析

李明蔚， 高 見， 翟相威， 錢相君， 文夏杰， 姚明解， 段昭君， 趙二江， 張 玲， 魯鳳民，

1 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病學(xué)教研室， 鄭州 450001； 2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院， 上海市腫瘤研究所， 癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032； 3 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 a.病原生物學(xué)系暨感染病中心， b.人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系， 北京 100191； 4中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系，北京 100005； 5 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 a.病案室， b.肝膽胰外科， 鄭州 450008

肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)占全球癌癥發(fā)病率的第5位、男性癌癥死亡率的第2位[1]以及我國癌癥發(fā)病率的第4位，嚴(yán)重危害人民的生命與健康。近年來，隨著射頻消融、經(jīng)肝動脈化學(xué)栓塞等非手術(shù)治療技術(shù)的引入，肝癌的臨床治療手段有了一定的進(jìn)展?；颊叩男g(shù)后復(fù)發(fā)與多種因素相關(guān)，已有研究者[2]將腫瘤因素、肝功能狀態(tài)、手術(shù)方式等納入肝癌復(fù)發(fā)模型。目前，姑息性手術(shù)切除仍是中晚期肝癌的選項之一，但由于患者術(shù)后復(fù)發(fā)時間短、預(yù)后差，對部分患者是否應(yīng)行姑息手術(shù)存在爭議。本研究對接受肝切除術(shù)的患者進(jìn)行分析，試圖從術(shù)前的血清學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)的指標(biāo)，以便在術(shù)前對患者預(yù)后進(jìn)行評估。人B-淋巴細(xì)胞趨化因子1(C-X-C Motif Chemokine Ligand 13，CXCL13)是趨化因子家族中的一員，主要與人體細(xì)胞表面的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合，主要分布在肝臟、淋巴結(jié)等器官組織中。CXCL13作為CXCR5(C-X-C chemokine receptor type 5)的唯一配體，是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分[3]，其在腫瘤患者中的水平高于健康人群和慢性乙型肝炎患者[4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，在低分化的腫瘤組中，CXCL13和CXCR5在腫瘤組織中高于癌旁組織，并且證實(shí)了CXCL13水平與無復(fù)發(fā)生存相關(guān)而與總生存無關(guān)。也有研究[6]報道CXCL13基因缺失的大腸癌患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險。但是，CXCL13對術(shù)后肝癌患者預(yù)后的意義并不清楚。本研究對接受肝切除術(shù)后的肝細(xì)胞癌患者的術(shù)前血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析，嘗試建立可用于術(shù)前評估患者能否從姑息性肝切除中獲益的評價體系，為開展個體化的治療選擇提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性納入2009年2月22日—2013年7月13日在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行肝切除術(shù)且完成隨訪的111例患者，隊列失訪率為11.81%，其基本信息已在實(shí)驗(yàn)室前期文章匯總進(jìn)行描述[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：接受肝切除術(shù)并最終病理診斷為肝細(xì)胞癌的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料缺失嚴(yán)重；(2)肝切除術(shù)前接受其他方式治療。對符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者采用門診查詢、電話咨詢等方式進(jìn)行隨訪。出院3個月后患者復(fù)查時進(jìn)行首次門診查詢，未復(fù)查者進(jìn)行電話咨詢，出院后1年內(nèi)每3個月隨訪1次，2～3年內(nèi)每6個月隨訪1次，4～5年內(nèi)每年隨訪1次，詢問其生存狀態(tài)，復(fù)發(fā)情況。肝癌復(fù)發(fā)定義為影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤灶。隨訪至2014年7月25日，在隨訪期間內(nèi)，當(dāng)患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或死亡時，記錄其無復(fù)發(fā)生存時間及復(fù)發(fā)狀態(tài)。

1.2 研究方法 從電子病歷中收集患者的基本狀況：性別、年齡、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小、肝硬化情況、Child分級、BCLC分期以及術(shù)前最后1次血清學(xué)檢測數(shù)據(jù)[AFP、總膽汁酸(TBA)、TBil、ALT、AST、前白蛋白(PA)、RBC、Alb、Glo、白球比(A/G)、ALP、GGT、淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比值(LMR)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(NLR)、PLT、PT、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)、纖維蛋白原(FIB)等]。患者手術(shù)麻醉前抽取血液，1500 r/min離心5 min，收集血清，凍存至-80 ℃，轉(zhuǎn)運(yùn)過程中使用干冰運(yùn)輸。2014年于北京大學(xué)采用ProcartaPlexTMMultiplex Immunoassays (Affymetrix，圣地亞哥，加州，美國)試劑盒檢測患者血清CXCL13水平。根據(jù)2011年原發(fā)性肝癌診療規(guī)范[7]中根治性切除的Ⅲ級標(biāo)準(zhǔn)，將患者的手術(shù)方式分為姑息性切除和根治性切除。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批號：IRB00001052-12088，所有參加者均獲得書面知情同意。

陳凱等[13]根據(jù)腫瘤因素建立了肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)風(fēng)險的模型，包含腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、血管侵犯和肝外侵犯。周正等[2]則將手術(shù)方式、腫瘤因素和肝功能狀態(tài)一同考慮，將手術(shù)器械、肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度等一同構(gòu)建模型，其AUC為0.74，特異度為85.3%，靈敏度為52.3%。Pan等[14]將HBsAg同腫瘤數(shù)目、癌栓、分化程度、血管浸潤等構(gòu)建了列線圖，并在驗(yàn)證隊列中得到證實(shí)。葉穎劍等[15]在血清AFP陰性的肝細(xì)胞癌患者中發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑、腫瘤包膜和血管侵襲性與患者的復(fù)發(fā)相關(guān)。肝癌的復(fù)發(fā)與機(jī)體狀態(tài)、腫瘤因素及手術(shù)因素等多種因素相關(guān)[2,15-17]。不同于以往研究，本研究主要是基于CXCL13及其他術(shù)前血清學(xué)指標(biāo)對患者的復(fù)發(fā)情況進(jìn)行分析，具有簡單易行的特點(diǎn)；特別是針對行肝癌姑息性切除的患者，可以從一定程度上提示術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，對0～3個月姑息手術(shù)切除患者的靈敏度高達(dá)93.75%，有助于臨床醫(yī)師進(jìn)行臨床診療決策。原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)[18]的根治性切除界定是根據(jù)術(shù)中和術(shù)后的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的，不再有姑息性切除的描述。但術(shù)前基于血清學(xué)指標(biāo)對預(yù)后的判定，對是否選擇外科手術(shù)治療仍有價值。但本研究也存在著一定局限性，如僅基于血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析的可靠性問題及樣本量較小等，仍需大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析及驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.5 Cox模型對姑息和根治術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測效能的比較 進(jìn)一步將患者按照姑息性切除和根治性切除分組，分別分析模型在姑息性切除和根治性切除后不同時間段的預(yù)測效能。結(jié)果顯示該模型在各個時間段內(nèi)對姑息性切除的預(yù)測效能均優(yōu)于對根治性切除的預(yù)測效能(表5)。該模型對姑息性切除0～3個月的AUC最高為0.87，其靈敏度和特異度分別為93.75%和70.00%。

表1 肝切除術(shù)后未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組患者術(shù)前指標(biāo)比較

2.2 不同水平的指標(biāo)對術(shù)后復(fù)發(fā)的影響 將連續(xù)性變量按照中位數(shù)分為高值組和低值組，AFP、FIB、ALP、GGT、CXCL13、BCLC分期不同分組之間的中位復(fù)發(fā)時間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。Kaplan-Meier曲線顯示AFP、ALP、GGT、FIB低值組及CXCL13高值組的中位復(fù)發(fā)時間更長，而隨著BCLC分期的進(jìn)展，中位復(fù)發(fā)時間縮短(圖1)。

2.3 與術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)聯(lián)的因素及預(yù)后模型構(gòu)建 將單因素分析中有差異的變量納入多因素Cox回歸分析，顯示AFP、GGT、CXCL13為復(fù)發(fā)的獨(dú)立因素[風(fēng)險比(HR)(95%CI)分別為1.69(1.03～2.79)、1.89(1.14～3.14)、0.540(0.33～0.89)，P值分別為0.039、0.014、0.015](模型系數(shù)Omnibus檢驗(yàn)，χ2=4.323，P<0.001)(表3)。以此3個參數(shù)構(gòu)建復(fù)發(fā)模型的風(fēng)險函數(shù)表達(dá)式為h(t)=h0texp(0.526×AFP+0.637×GGT-0.616×CXCL13),預(yù)后指數(shù)(Prognostic Index，PI)為：PI=0.526×AFP+0.637×GGT-0.616×CXCL13。PI最低值為-0.62，最高值為1.16，在全部患者中的中位數(shù)為0.53(0.00～0.55)。

有研究[4,8-9]報道，隨著肝癌臨床分期的進(jìn)展，患者血清CXCL13的濃度逐漸升高，且CXCL13水平與ALT、腫瘤大小、Child評分呈正相關(guān)。血清CXCL13水平在肝癌患者中高于健康人群，在低分化組的肝癌組織中高于高分化組，CXCL13可以募集CXCR5陽性的濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)IL-21和IL-12的分泌，對腫瘤產(chǎn)生抑制作用[5,9]，也可以誘發(fā)外周器官中的次級淋巴組織形成，參與機(jī)體的免疫[10-11]。本研究中顯示高水平的CXCL13患者擁有更好的預(yù)后，這可能與CXCL13作為免疫趨化因子參與機(jī)體的抗腫瘤免疫相關(guān)。

圖1 兩組的Kaplan-Meier曲線圖

太湖流域是一個不可分割的有機(jī)整體，上述水問題不是單獨(dú)、孤立的，許多是經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展過程中出現(xiàn)的新情況、新問題，這些問題相互關(guān)聯(lián)，互為因果，各種水問題之間存在著不可分割的聯(lián)系。鑒于太湖流域的水問題是流域性綜合性水問題，《太湖流域管理條例》的內(nèi)容涉及防洪，供水，水資源配置、保護(hù)和水污染防治等諸多方面，為綜合性行政法規(guī)，重點(diǎn)將國家水資源管理與保護(hù)、水污染防治的法律制度在太湖流域具體化，對水環(huán)境實(shí)施綜合管理與治理，實(shí)行比其他流域更加嚴(yán)格的水資源管理、保護(hù)和水污染防治制度。

表3 與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的單因素分析

總之，本研究證實(shí)通過檢測簡單易行的術(shù)前血清學(xué)指標(biāo)可以對肝細(xì)胞癌姑息性切除術(shù)后患者的早期復(fù)發(fā)情況進(jìn)行較為準(zhǔn)確的預(yù)測，對于早期復(fù)發(fā)風(fēng)險較高的患者，在選擇相關(guān)手術(shù)治療時應(yīng)更為審慎，可嘗試采用其他聯(lián)合或代替治療的療法。

表4 Cox模型預(yù)測不同時間段復(fù)發(fā)情況的AUC、靈敏度及特異度

圖2 Cox模型預(yù)測3、6、12、24個月復(fù)發(fā)情況的ROC曲線

2.1 肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)和術(shù)后未復(fù)發(fā)患者的術(shù)前指標(biāo)對比 111例患者在隨訪期間發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)71例(復(fù)發(fā)組)，未復(fù)發(fā)40例(未復(fù)發(fā)組)，隨訪人年為69.29年。復(fù)發(fā)組的術(shù)前AFP、TBil、GGT的水平高于未復(fù)發(fā)組，BCLC分期存在差異(P值均<0.05)(表1)。

表5 Cox模型預(yù)測姑息性切除和根治性切除不同時間段復(fù)發(fā)情況的AUC、靈敏度及特異度

3 討論

本研究對111例肝細(xì)胞癌肝切除術(shù)后隨訪患者的術(shù)前血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行Cox多因素分析，最終發(fā)現(xiàn)AFP、GGT、CXCL13是肝切除術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素，其中AFP、GGT為獨(dú)立危險因素，CXCL13為獨(dú)立保護(hù)因素。這3個指標(biāo)分別從腫瘤標(biāo)志物、炎癥和宿主固有免疫3個方面預(yù)示著肝切除術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險。利用Cox建立復(fù)發(fā)預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)其對姑息性切除術(shù)后短期復(fù)發(fā)(0～3個月)預(yù)測的AUC最高，可幫助臨床醫(yī)師在一定程度上評估患者能否從姑息性切除術(shù)中獲益。

5.6.3 屈肘功能鍛煉 術(shù)后4～6周囑患者自然下垂患肩，健側(cè)手掌托著患肢前段，將肘關(guān)節(jié)上舉屈曲至110°，必須在深吸氣的同時上抬患肢前臂至屈肘位，開始時每天早晚訓(xùn)練20次，每天鍛煉2次，以后逐漸增多，直到每天能達(dá)數(shù)千次。主要作用是加強(qiáng)膈神經(jīng)對肌皮神經(jīng)的支配，鍛煉肱二頭肌隨呼吸作屈肘動作，由練習(xí)摸嘴、摸頸到后來的摸腰部，逐步過渡到自主屈肘鍛煉。對尚未開始訓(xùn)練的關(guān)節(jié)嚴(yán)格制動。

肝癌的復(fù)發(fā)分為早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā)，通常以術(shù)后2年為截止點(diǎn)[12]。本研究結(jié)果顯示，其預(yù)測肝癌切除術(shù)后3個月內(nèi)復(fù)發(fā)的效能最高，隨著手術(shù)后生存時間的延長，該模型的預(yù)測能力下降。而考慮到接受姑息性切除的肝癌患者術(shù)后短期復(fù)發(fā)的患者可能更多，因此，根據(jù)患者的手術(shù)切除方式將其進(jìn)一步分為姑息性切除和根治性切除，分別對該預(yù)測模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示該模型在不同時間段內(nèi)預(yù)測姑息性切除復(fù)發(fā)的效果均優(yōu)于根治性切除，同時對0～3個月復(fù)發(fā)預(yù)測的靈敏度最高，由此可見，該預(yù)測模型對術(shù)后短期復(fù)發(fā)的預(yù)測能力最佳，可用于預(yù)測姑息性切除術(shù)后的早期復(fù)發(fā)情況。

對RS碼進(jìn)行盲識別，就是在僅知道v(x)的情況下，估計編碼參數(shù)進(jìn)而還原出信息序列.若假定通過幀同步處理已經(jīng)獲得(n,k)RS碼的起始位置，則需要識別的編碼參數(shù)包括碼長n，信息分組長度k和生成多項式g(x).

2.4 預(yù)測模型的ROC曲線 本隨訪研究隊列患者肝切除術(shù)后3～24個月的復(fù)發(fā)率為30.63%～60.36%。經(jīng)ROC曲線評估上述Cox的預(yù)測模型的生存分析函數(shù)(表4)，結(jié)果顯示該模型對3個月復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測效能最高，AUC為0.82，靈敏度和特異度分別為91.18%和63.64%(圖2)。

據(jù)外媒報道，日本NHK(放送協(xié)會)電視臺從當(dāng)?shù)貢r間12月1日上午10點(diǎn)開始，正式開始通過衛(wèi)星播送4K、8K電視信號。即使經(jīng)過了數(shù)年測試，NHK仍是目前唯一提供8K、22.2聲道內(nèi)容的電視臺。本次上線的電影是庫布里克的科幻經(jīng)典《2001：太空漫游》，華納基于70mm底片進(jìn)行了4K/8K重制。NHK之所以如此激進(jìn)，可能與籌備2020年東京奧運(yùn)會有關(guān)。

志謝：感謝所有參與本研究的患者及其家人的理解和支持，感謝姬旭慧、劉媛、謝霄夢等參與采集樣本及隨訪的研究生同學(xué)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

在回歸模型Y=g(X)+ε中，當(dāng)g(X)=E(Y|X)時，有GMC(Y|X)=R2。但R2主要用于回歸分析，GMC則可以用來測度隨機(jī)變量間的解釋方差。

作者貢獻(xiàn)聲明：李明蔚負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；高見、姚明解、段昭君、趙二江參與收集及分析數(shù)據(jù)，修改論文；翟相威、錢相君、文夏杰參與資料分析與解釋；張玲、魯鳳民指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。