陳 銳， 王志鑫， 樊海寧， 王海久

青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 青海省包蟲病重點實驗室， 西寧 810001

在過去的數(shù)十年中，免疫療法獲得飛速發(fā)展，在傳染性疾病與晚期惡性腫瘤的治療中取得巨大突破。在這些療法中，免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)療法被認(rèn)作是最有前途也是當(dāng)前研究最為深入的療法之一[1-2]。目前，基于細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)與程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡配體1(PD-L1)靶點的抑制劑已實現(xiàn)由實驗室到較大規(guī)模臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)變。然而，在應(yīng)用過程中卻暴露出一系列問題：部分患者雖有PD-1/PD-L1和/或CTLA-4的陽性表達，卻對藥物無應(yīng)答，更有甚者，出現(xiàn)病情超進展(hyperprogressive disease，HPD)，病情迅速惡化；越來越多早期對治療有反應(yīng)的患者最終結(jié)局為病情進展，表現(xiàn)為原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥；患者總體的應(yīng)答率與設(shè)想存在較大差距，治療結(jié)果尚不能令人滿意[3-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，治療過程額外的檢查點分子上調(diào)是產(chǎn)生低應(yīng)答率與耐藥性的重要機制之一。因此，尋找額外的免疫檢查點克服當(dāng)前存在的問題引發(fā)學(xué)界關(guān)注。據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)多種新型靶點，如淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)[7]、淋巴細胞衰減子[8]以及唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素15[9]等。其中LAG-3作為潛在靶點在機體免疫中發(fā)揮了重要作用而引發(fā)廣泛關(guān)注[7]。肝臟是機體重要的消化器官，其獨特的免疫環(huán)境及血流供應(yīng)成為病毒、腫瘤、自身抗體以及寄生蟲主要侵犯的靶器官，相關(guān)疾病嚴(yán)重威脅患者生命健康安全。因此探索LAG-3在肝臟相關(guān)疾病中的作用成為當(dāng)下研究熱點。目前關(guān)于LAG-3參與肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展缺乏系統(tǒng)認(rèn)識，本文就LAG-3在肝臟相關(guān)疾病中的研究進展進行綜述。

1 生物學(xué)特性

1.1 LAG-3的結(jié)構(gòu) LAG-3，又稱CD223，最早由Triebel等[10]發(fā)現(xiàn)，是免疫球蛋白超家族成員的一種膜蛋白。分子量為70 kD，定位于人12 號染色體短臂末端(12p13.3)。在發(fā)現(xiàn)之初也將LAG-3定義為CD4樣(CD4-like)的膜蛋白[11-12]。LAG-3 編碼基因包含8個外顯子，其對應(yīng)的cDNA 編碼一類含有498個氨基酸的Ⅰ型穿膜蛋白，該膜蛋白由胞外區(qū)、穿膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)由4個免疫球蛋白超家族(IgSF)結(jié)構(gòu)域 D1、D2、D3 和 D4 組成。D1屬于V系免疫球蛋白超家族,而D2、D3和D4屬于C2系免疫球蛋白超家族。其中D1與D3、D2與D4之間具有高度同源性,推斷可能是由2個IgSF區(qū)域基因復(fù)制而成的4個區(qū)域。在D1區(qū)有一個由30個氨基酸組成的具有特異性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，還含有一個異常的鏈內(nèi)“二硫橋”。LAG-3的胞質(zhì)區(qū)由3個特殊的蛋白質(zhì)基序組成，分別是：保守的KIEELE基序； 絲氨酸磷酸化位點S454；重復(fù)的谷氨酸-脯氨酸序列。其中 KIEELE 基序是在其他蛋白質(zhì)中均未出現(xiàn)過的高度保守序列，參與LAG-3分子胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，缺少此段基序?qū)⒉荒軐淋巴細胞產(chǎn)生抑制作用[13-14]。在跨膜基質(zhì)金屬蛋白酶類AMAD10/17的介導(dǎo)下，成熟的LAG-3分子可將D4 跨膜結(jié)構(gòu)域中的一段連接肽在細胞膜上斷裂為相對分子質(zhì)量為54 kD可溶性部分(p54)以及16 kD的肽段(p16)，從而維持細胞膜上LAG-3表達的相對平衡[15-16]。

1.2 LAG-3的表達及配體 LAG-3在人體表達局限于有炎癥的扁桃體、淋巴結(jié)或濾泡狀增生組織單個核細胞的亞群中[15-16]。最近研究[17-19]發(fā)現(xiàn)，在多種實體瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞中，LAG-3也呈現(xiàn)高表達。LAG-3作為表達在淋巴細胞表面一種抑制分子，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起特定作用。主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(MHC-Ⅱ)是第一個被發(fā)現(xiàn)也是比較受認(rèn)可的LAG-3配體，靶向抑制MHC-Ⅱ有助于T淋巴細胞激活。但其是否單獨負(fù)責(zé)LAG-3的免疫抑制功能存在較大爭議。目前已發(fā)現(xiàn)LAG-3的多種替代配體，如半乳糖凝集素-3，肝竇內(nèi)皮細胞凝集素和α-突觸核蛋白纖維，可以解釋LAG-3無需MHC-Ⅱ的參與而對各種類型的淋巴細胞起到抑制作用。在最近研究中，Wang等[20]發(fā)現(xiàn)并證實纖維蛋白原樣蛋白1(FGL1)是 LAG-3發(fā)揮T淋巴細胞抑制功能的主要配體，進而提出了新的腫瘤免疫逃逸通路FGL1-LAG-3，對發(fā)展下一代腫瘤免疫療法具有重要意義。

1.3 LAG-3的抑制機制 LAG-3的胞質(zhì)區(qū)缺乏典型的抑制基序。抑制信號可能通過胞質(zhì)區(qū)特殊的蛋白質(zhì)基序(如FsaL基序)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。Maeda等[21]認(rèn)為，LAG-3的抑制功能與其在細胞表面的表達水平密切相關(guān)，氨基酸的取代和缺失會實質(zhì)性影響LAG-3的表達水平。Workman等[22]發(fā)現(xiàn)KIEELE基序的賴氨酸殘基在介導(dǎo)LAG-3發(fā)揮抑制作用中起關(guān)鍵作用，但其機制有待進一步研究。研究表明FsaL基序中的苯丙氨酸和亮氨酸被丙氨酸取代會顯著降低LAG-3的抑制能力。此外，當(dāng)同時存在FsaL序列發(fā)生突變與重復(fù)的谷氨酸-脯氨酸基序缺失時，LAG-3的抑制能力完全喪失。但僅谷氨酸-脯氨酸重復(fù)基序的缺失并不影響LAG-3的抑制能力。說明LAG-3可能轉(zhuǎn)導(dǎo)FsaL基序和谷氨酸-脯氨酸重復(fù)基序兩個獨立的抑制信號，但傳導(dǎo)信號的分子機制仍然未知[21]。

2 LAG-3與肝臟相關(guān)疾病

2.1 LAG-3與乙型肝炎 免疫檢查點療法應(yīng)用于慢性病毒感染性疾病已成為當(dāng)下研究的熱點。LAG-3作為潛在的靶點引起研究者關(guān)注。Ye等[23]通過檢測80例慢性乙型肝炎(CHB)患者、10例慢性無癥狀HBV攜帶者(ASCs)以及18例正常健康人(HCs)外周血中CD8+T淋巴細胞表達的LAG-3發(fā)現(xiàn)，CHB組顯著高于ASCs組與HCs組。作為反映CD8+T淋巴細胞功能的標(biāo)志物IFNγ在CHB組分泌顯著降低。給予阻斷劑后可部分恢復(fù)受損CD8+T淋巴細胞功能，與單獨使用PD-L1抗體相比，聯(lián)合使用LAG-3和PD-L1抗體可更有效的恢復(fù)其功能。在HBV的感染和清除期間，CD4+T淋巴細胞在調(diào)節(jié)CD8+T淋巴細胞參與免疫應(yīng)答的過程中起關(guān)鍵作用。 Dong等[24]對比了CHB組與HCs組外周血中CD4+T淋巴細胞LAG-3的分布情況，發(fā)現(xiàn)CHB組中LAG-3出現(xiàn)顯著升高。與此同時，高表達LAG-3的CD4+T淋巴細胞分泌的IFNγ、IL-2和TNFα明顯減少，阻斷LAG-3后，CD4+T淋巴細胞功能部分恢復(fù)。除此之外，LAG-3還可以影響調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)的表達，介導(dǎo)其分泌抑制性細胞因子抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的激活和增殖。研究[23]發(fā)現(xiàn)，PD-1和LAG-3的表達與HBV DNA滴度無明顯關(guān)系，與血清ALT水平呈正相關(guān)，提示與肝損傷程度相關(guān)。目前對慢性HBV的治療尚停留在抗病毒治療的階段。由于肝細胞核內(nèi)ccc DNA存在，絕大多數(shù)患者需終生服藥，不能達到徹底治愈。聯(lián)合應(yīng)用抗體阻斷LAG-3與PD-1介導(dǎo)的T淋巴細胞免疫耐受狀態(tài)，從而促進特異性免疫應(yīng)答的恢復(fù)，將成為治療慢性HBV感染新策略。

2.2 LAG-3與丙型肝炎 HCV起病隱匿且病情進展緩慢,目前尚無有效的疫苗可供使用。肝硬化和HCC是慢性HCV感染者的主要死因[25]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性HCV感染過程中，肝組織及外周血中HCV特異性CD8+與CD4+T淋巴細胞均高表達LAG-3，表現(xiàn)出功能性耗竭[26-27]。但也有研究[28]發(fā)現(xiàn)，無論是HCV抗體陽性還是陰性的患者，肝內(nèi)和外周CD8+T淋巴細胞中LAG-3的表達沒有顯著差異。由于相關(guān)研究均未將病毒載量的數(shù)據(jù)納入，研究結(jié)果差異的原因有待進一步探討[28]。此外研究[29-30]發(fā)現(xiàn)，LAG-3還可通過調(diào)節(jié)Treg細胞與1型調(diào)節(jié)性T淋巴細胞功能致使HCV持續(xù)感染及復(fù)發(fā)。最近研究表明，LAG-3還參與HCV體液免疫調(diào)節(jié)。HCV感染過程中LAG-3+CD4+T淋巴細胞增多并表現(xiàn)出Treg樣表型。LAG-3+CD4+T淋巴細胞的頻率與CXCR3+循環(huán)濾泡性輔助性T淋巴細胞負(fù)相關(guān)。在HCV感染期間，LAG-3可能充當(dāng)負(fù)向調(diào)節(jié)劑，參與中和抗體反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在介導(dǎo)體液免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。這與阻斷PD-1和LAG-3顯著增強小鼠惡性瘧原蟲感染期間抗體反應(yīng)的報道[18]相一致。但是LAG-3+CD4+T淋巴細胞是否作為Treg調(diào)節(jié)循環(huán)濾泡性輔助性T淋巴細胞應(yīng)答仍有待確定[31]。這一發(fā)現(xiàn)將有助于進一步了解HCV的持續(xù)性感染機制，并通過這些免疫紊亂現(xiàn)象改善疫苗接種方案，達到病毒根治的目的。

2.3 LAG-3與肝細胞癌(HCC) 近年來以PD-1、CTLA-4免疫檢查點為靶點的新型藥物已成為治療晚期HCC的二線藥物[32]。在我國，70%～90%的HCC與HBV感染有關(guān)，HBV抗原被認(rèn)為是HCC的腫瘤相關(guān)抗原[33]。Wang等[34]對比了CHB與HCC患者CD8+T淋巴細胞表型與功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)HCC組織中CD8+T淋巴細胞表達的LAG-3、PD-1等耗竭標(biāo)志物水平更高，細胞增殖水平與活性也明顯低于CHB。分析發(fā)現(xiàn)兩者在表型、功能狀態(tài)和潛在機制有所不同，推測可能是由不同的途徑驅(qū)動，其機制不明有待進一步研究。Guo等[35]檢測了143例HCC患者腫瘤組織及腫瘤旁正常組織中LAG-3、FGL1、PD-L1與CD8+T淋巴細胞分布及表達情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中LAG-3和FGL1的表達水平明顯高于正常組織，而PD-L1和CD8低于鄰近正常肝組織。高水平的FGL1與高密度的LAG-3+細胞密切相關(guān)，與PD-L1無關(guān)。CD8+T淋巴細胞密度與PD-L1水平呈正相關(guān)，與FGL1表達呈負(fù)相關(guān)。高水平的LAG-3+細胞往往代表患者預(yù)后不佳。研究者通過體外分離并擴增單純HCC患者與HCC合并尿毒癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞發(fā)現(xiàn)后者LAG-3+CD8+、PD-1+CD8+T淋巴細胞等腫瘤反應(yīng)性細胞比例明顯低于前者，說明HCC合并尿毒癥患者的抗腫瘤能力低于單純HCC患者，HCC合并尿毒癥患者外周血單個核細胞中獲得的腫瘤反應(yīng)性細胞不適用于T淋巴細胞治療[36]。研究表明，LAG-3與PD-1/PD-L1具有協(xié)同作用。HCC組織中絕大多數(shù)PD-1染色陽性的腫瘤浸潤淋巴細胞LAG-3表達也增加，但也有研究發(fā)現(xiàn)少部分病例只有LAG-3單個靶點表達上調(diào)，推測部分HCC患者可能受益于LAG-3通路的抑制，而非PD-1通路，LAG-3免疫檢查點會限制單藥阻斷HCC靶點的功效[35]。針對LAG-3在HCC治療中的應(yīng)用已引起關(guān)注。Wang等[37]發(fā)現(xiàn)氧化槐果堿可通過下調(diào)IL-6介導(dǎo)的JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑降低FGL1的表達進而增敏LAG-3拮抗劑介導(dǎo)的體內(nèi)外CD8+T淋巴細胞抗HCC細胞(Hepa1-6 和 HepG2)的作用，為聯(lián)合使用LAG-3拮抗劑治療HCC提供了潛在證據(jù)。最近研究[38]發(fā)現(xiàn)，雙特異性抗體MGD013和FS118可與小鼠腫瘤模型中的LAG-3和PD-L1同時結(jié)合，阻斷其介導(dǎo)的免疫抑制進而增強機體抗腫瘤能力，此發(fā)現(xiàn)為下一代檢查點抑制劑的研制提供新的方向。LAG-3為HCC的免疫治療提供了新思路，對于PD-1/PD-L1抗體產(chǎn)生耐藥的患者將于LAG-3抗體或LAG-3抗體與PD-1/PD-L1抗體的聯(lián)合應(yīng)用中獲益。

2.4 LAG-3與自身免疫性肝病(ALD) ALD是一類由自身免疫介導(dǎo)的肝損傷，與基因易感性、異常的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及分子模擬有關(guān)。目前尚未明確自身免疫環(huán)境發(fā)生異常的機制，初步考慮與自身免疫耐受的機制被破壞有關(guān)。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為體內(nèi)免疫環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及自身免疫性反應(yīng)的發(fā)生與Treg的數(shù)量及功能有密切關(guān)系[39]。研究者通過檢測ALD患者體內(nèi)Treg細胞發(fā)現(xiàn)其表達的LAG-3與TIM-3數(shù)量較正常人明顯減少，同時介導(dǎo)Treg數(shù)量減少，限制其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[40-41]。目前證據(jù)表明，LAG-3在自身性免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究[42]發(fā)現(xiàn)，LAG-3或PD-1單個檢查點缺失的小鼠會出現(xiàn)自身免疫反應(yīng)，但程度相對較輕。而同時敲除LAG-3與PD-1的小鼠卻表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的全身性自身免疫反應(yīng)，說明抑制性免疫檢查點丟失或抑制會促進自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展。據(jù)報道[43]，部分接受ICIs療法的晚期腫瘤患者也會出現(xiàn)自身免疫性反應(yīng)，也從側(cè)面驗證了上述結(jié)論。此外研究發(fā)現(xiàn)，ALD患者外周血中T淋巴細胞表達的LAG-3[44]與PD-1[45]代償性升高，推測與肝組織炎癥活動相關(guān)，但其引發(fā)的免疫下調(diào)作用遠不能抗衡疾病的發(fā)生發(fā)展，是抑制性信號“相對缺失”的表現(xiàn)。目前，針對ALD的治療尚處在初期階段，激素聯(lián)合免疫抑制劑仍是首選的治療方案，但嚴(yán)重的副反應(yīng)限制了患者的受益時間，亟待新型藥物的研發(fā)?；贚AG-3、PD-1、TIM-3等靶點的激動劑單獨或聯(lián)合應(yīng)用有望恢復(fù)機體免疫耐受狀態(tài)，抑制自身免疫反應(yīng)，達到控制ALD病情進展的目的。

2.5 LAG-3與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) NAFLD作為一種多系統(tǒng)受累的代謝性疾病，與代謝綜合征以及2型糖尿病互為因果，共同促進肝硬化、HCC以及結(jié)直腸腫瘤等肝外臟器腫瘤的發(fā)生。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)作為NAFLD疾病譜中重要的疾病，因其致病機制復(fù)雜且具有高度向肝纖維化與HCC轉(zhuǎn)變的風(fēng)險已成為肝移植的主要原因之一[46]。NASH是目前少數(shù)沒有任何標(biāo)準(zhǔn)療法的常見病之一。研究[47]發(fā)現(xiàn)，患有NASH的小鼠疾病進展過程中常伴隨內(nèi)源性IgA+細胞的積聚，IgA+細胞表達的PD-L1可直接與CD8+T淋巴細胞上相關(guān)受體結(jié)合抑制其功能進而加速向HCC的發(fā)展，給予PD-L1阻斷劑后CD8+T淋巴細胞被激活進而誘導(dǎo)HCC消退。同期試驗中研究者注意到，先天性缺乏CD8+T淋巴細胞的NASH小鼠出現(xiàn)腫瘤生長，缺乏IgA+細胞但保留CD8+T淋巴細胞NASH小鼠幾乎均未出現(xiàn)腫瘤生長。研究[47]認(rèn)為，NAFLD等慢性肝炎可通過抑制體內(nèi)CD8+T淋巴細胞功能進而加速向HCC轉(zhuǎn)變。已有多項試驗發(fā)現(xiàn),慢性肝炎疾病中LAG-3表達水平明顯升高，抑制了CD8+T淋巴細胞的功能，這可能是慢性肝炎進展為HCC的重要原因。目前相關(guān)研究相對較少，有理由相信基于LAG-3的檢查點抑制劑可延緩NASH向HCC的病程進展，有望成為NASH治療中的新策略。

2.6 LAG-3與肝多房棘球蚴病(hepatic alveolar echinococcosis, HAE) 棘球蚴病根據(jù)感染棘球絳蟲的種類不同可分為細粒棘球蚴病(cystic echinococcosis，CE)與多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)。其中AE的致病性、致殘率和致死率均高于CE，又因其感染人體后的生物學(xué)行為與惡性腫瘤類似，故有“蟲癌”之稱[48]。依賴于多種免疫逃避機制，多房棘球絳蟲可在宿主體內(nèi)長期生存?；颊咴缙诙酂o明顯臨床癥狀，多數(shù)就診時已進入病程晚期，失去手術(shù)機會。研究[49]發(fā)現(xiàn)，HAE患者外周血清中LAG-3、PD-1、TIM-3及其他免疫耗竭標(biāo)志物較正常人明顯增高，病灶旁肝組織的表達水平顯著高于遠處正常肝組織，提示T淋巴細胞耗竭。Bellanger等[50]使用多房棘球蚴囊液對22例健康志愿者全血中的單個核細胞及自然殺傷細胞進行刺激，發(fā)現(xiàn)細胞膜表面LAG-3、PD-1、CTLA-4的表達增加，說明多房棘球絳蟲的免疫逃逸可涉及多個免疫檢查點的調(diào)控，負(fù)向免疫調(diào)節(jié)是多房棘球絳蟲持續(xù)感染的重要原因。目前尚未有根治HAE的特效藥物，根治性手術(shù)仍是首選的治療方案。根據(jù)專家共識[48]推薦，根治性切除或肝移植患者術(shù)后需至少服用2年以上的阿苯達唑預(yù)防復(fù)發(fā)。目前尚未有相關(guān)的預(yù)后數(shù)據(jù)對其預(yù)防復(fù)發(fā)的效果進行評價。據(jù)報道，部分患者即使術(shù)后規(guī)律服用藥物預(yù)防，仍會出現(xiàn)復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，目前機制尚未明確，還需進一步研究[51]。隨著對棘球蚴病免疫逃逸認(rèn)識的不斷深入，免疫檢查點療法應(yīng)用于術(shù)前降期及預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)將成為下一階段研究的熱點。

3 小結(jié)

綜上所述，LAG-3 是一類表達于活化的淋巴細胞以及腫瘤浸潤細胞表面的抑制性分子，參與效應(yīng)T淋巴細胞、調(diào)節(jié)T淋巴細胞等細胞的增殖與活化，與HBV、HCV、HCC、ALD、NAFLD、HAE的免疫逃逸、免疫失衡密切相關(guān)。LAG-3常與PD-1/PD-L1共表達，單獨或與其他檢查點抑制劑協(xié)同應(yīng)用有望克服藥物低反應(yīng)率及耐藥性的問題，擺脫免疫抑制，提高機體免疫能力。但是，在LAG-3的研究中尚有不少問題亟待解決。首先，LAG-3負(fù)向調(diào)節(jié)T淋巴細胞功能的分子機制尚未明確，是否還存在其他潛在配體限制抑制劑發(fā)揮作用；其次，尚不清楚不同類型抑制劑發(fā)揮協(xié)同作用的分子機制，最佳的抑制劑組合尚未確定；再次，目前只有少量的LAG-3抑制劑進入臨床試驗尚未獲得大規(guī)模的臨床應(yīng)用，缺乏足夠的預(yù)后數(shù)據(jù)對其效果進行評價；最后，當(dāng)前抑制劑價格普遍昂貴，能否通過優(yōu)化抑制劑的分子結(jié)構(gòu)降低生產(chǎn)成本從而減輕患者經(jīng)濟負(fù)擔(dān)?？傊琇AG-3有望成為下一代ICIs療法的經(jīng)典靶點，在調(diào)節(jié)機體淋巴細胞免疫反應(yīng)、治療肝臟相關(guān)疾病及評估患者預(yù)后方面發(fā)揮重要的作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳銳負(fù)責(zé)擬定寫作思路，撰寫論文；王志鑫負(fù)責(zé)資料收集及分析，修改論文；樊海寧、王海久指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。