周寶春，王軟林，柴寶峰

（山西大學 生物技術研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室 ，山西 太原 030006）

0 引言

無義介導的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途徑是一種mRNA質(zhì)量監(jiān)控機制，保障細胞內(nèi)基因的精準表達。在真核生物的細胞中，它的功能是用來識別和降解含有提前終止密碼子（premature termination codons，PTCs）的異常轉(zhuǎn)錄本，從而避免存在潛在毒性的蛋白截短體產(chǎn)生[1]。這種監(jiān)控機制不僅在高等真核生物中普遍存在，而且在原生生物的三大超群——陷攝蟲群（Ex-cavata）、多貌生物群（Diaphoretickes）和單鞭毛生物群（Amorphea）中均有發(fā)現(xiàn)[2-4]。

在不同進化水平的生物中，NMD途徑具有一定的進化特征，從高等真核生物到低等原生生物，NMD途徑相關蛋白因子的種類、數(shù)量、結構和功能均存在一定的差異[3]。例如在識別含PTC轉(zhuǎn)錄本的方式上，進化程度相對較高的哺乳動物是以依賴于外顯子連接復合體（exon junction complex，EJC）的方式，在停滯的核糖體上通過招募SMG1（Suppress with morphogenetic effect on genitalia-1）、UPF1（upframeshift 1）和 eRF（eukaryotic release factor）因子形成SURF復合體，隨后再招募結合UPF2和UPF3b因子，通過這兩個因子再與外顯子連接復合體結合[1]。在低等真核生物釀酒酵母中會招募形成eRF-UPF1-UPF2-UPF3 復合體[1，5]。而在進化程度相對較低的原生動物中，識別PTC的分子機制更為復雜。嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila）是以一種不依賴于外顯子連接復合體的方式，招募形成UPF1-UPF2-UPF3復合體[6]。賈第蟲（Giardia lamblia）可能是以一種依賴于不均一核小核糖核蛋白1（HRP1）的方式并招募形成SURF復合體[7-8]。

八肋游仆蟲（Euplotes octocarinatus）是一類單細胞原生生物，細胞中有一個“C”形營養(yǎng)大核和一個球形生殖小核。據(jù)統(tǒng)計，大核中大約含有三萬條高拷貝片段化的基因大小染色體（gene size chromosome）[9]，即一條染色體中含有一個基因。而且，由于游仆蟲大核基因閱讀框中存在無義密碼子編碼氨基酸現(xiàn)象和翻譯移碼現(xiàn)象[10]，使得該類生物的NMD途徑機制更具特殊性。為此，在前期對八肋游仆蟲NMD途徑初步研究的基礎上[11-12]，利用生物信息學方法對八肋游仆蟲NMD途徑因子進行分析，以期對原生動物NMD途徑的深入研究提供支持，具體包括NMD相關蛋白因子的同源鑒定和結構功能域注釋、核心蛋白因子eUPF1與eUPF2的三級結構預測、分子對接和相互作用的關鍵氨基酸分析。最后利用定點突變和Pull-down實驗驗證eUPF2與eUPF1之間相互作用的關鍵結構域與預測結果的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

八肋游仆蟲（69號）為本實驗室培養(yǎng)，菌株E.coliDH5α、E.coliBL21為本實驗室保存，質(zhì)粒pGEX-6P-1、pET-28a分別用于重組載體的構建和體外基因原核表達。

1.2 主要實驗試劑

EasyTaq?DNA Polymerase、EasyPure?Quick Gel Extraction Kit試劑盒、TransStart?FastPfu FlyDNA Polymerase、EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、High Pure dNTPs、His抗體及GST單克隆抗體購自Transgene公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司；Plasmid Mini KitI購自OMEGA公司；寡核苷酸引物合成和重組載體測序由華大基因有限公司完成；PMSF蛋白酶抑制劑購自于BBI Life Sciences公司；Eastep?Super Total RNA Extraction Kit試劑盒購自Promega公司；Tris購自Solarbio公司；配制LB培養(yǎng)基所用酵母粉、蛋白胨購自Oxoid公司；氯化鈉、瓊脂粉購自Sangon公司。

1.3 生物信息學分析

為了鑒定八肋游仆蟲中NMD途徑相關蛋白因子，首先從 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）中下載人類NMD途徑相關蛋白因子的氨基酸序列，然后在游仆蟲大核基因組數(shù)據(jù)庫（http：//ciliates.ihb.ac.cn/database/home/#eo）[9]中 作 tblastn 搜索。再將得到的序列，在NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中作blastx序列比對，進一步對獲取的基因序列作驗證。四膜蟲NMD相關蛋白因子基因序列下載自TGD（http：//ciliate.org/index.php/home/welcome）；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NMD相關蛋白因子基因序列下載自SGD（https：//www.yeastgenome.org/）；藍氏賈第蟲NMD相關蛋白因子基因序列 下 載 自 GiardiaDB（https：//giardiadb.org/giardiadb/）；擬南芥（Arabidopsis thaliana）NMD相關蛋白因子基因序列下載自TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）。

蛋白多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 7.0.14 軟件[13]，采用 Jalview2.10.5 軟件[14]進行可視化。其他生物中的同源蛋白序列均下載自Uni-Prot數(shù)據(jù)庫。eUPF1蛋白質(zhì)三級結構模型采用Swiss-model（https：//www.swissmodel.expasy.org/）[15]進行在線預測，eUPF2 蛋白質(zhì)三級結構模型通過Zhang Lab I-TASSER Protein Structure&Function Predictions（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）進行在線預測[16]。采用 InterPro Protein sequence analysis（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）對蛋白質(zhì)功能結構域注釋；利用ZDOCK SERVER（http：//zdock.umassmed.edu/）進行蛋白分子對接，對接結果采用PDBePISA（http：//www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver）[17]進行 相互作用 關鍵氨基 酸位點的尋找，采用Discovery Studio 4.5 Visualizer軟件分析相互作用蛋白因子間的疏水作用和氫鍵。

1.4 重組表達質(zhì)粒的構建與突變

以八肋游仆蟲cDNA為模板，采用PCR法，用引物BF781/BF782和BF783/BF784分別擴增獲取eUPF1 CH結構域和eUPF2 U1BD結構域基因，然后用相應的限制酶分別對目的基因片段和載體進行雙酶切（Table 1），最后用T4 DNA連接酶，將目的基因分別克隆到pET-28a和pGEX-6P-1質(zhì)粒上，得到重組表達質(zhì)粒pET-28a-eUPF1-CH和pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（WT）；利用定點突變技術，設計引物DT901/DT902，利用PCR法將eUPF2的αA-helix結構對應的DNA片段進行缺失突變，得到重組表達質(zhì)粒pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（MT）。

1.5 蛋白純化與Pull-down分析

分別將構建好的pET-28a-eUPF1-CH、pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（WT）和pGEX-6P-1-eUPF2-U1BD（MT）重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細胞中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)。第二天，將陽性單克隆菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中。在37℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)5 h后，加入IPTG誘導劑，16℃低溫誘導過夜，使融合蛋白大量表達。離心收菌，加入PMSF蛋白酶抑制劑，冰浴超聲破碎細胞，4℃離心收集帶標簽（GST/His）融合蛋白上清液，將收集的兩種蛋白上清液混合，混合均勻后分成兩等份，一份緩慢注入平衡過的含Glutathion-Sepharose 4B柱材料的柱子中，另一份緩慢注入平衡過的含Ni-NAT柱材料的柱子中，冰浴過夜結合。用洗滌緩沖液除去雜蛋白，隨后用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。洗脫的目的蛋白經(jīng)低溫濃縮后制備樣品。質(zhì)量分數(shù)15% SDS-PAGE電泳后，對互作蛋白分離，Western blot濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜上，封閉液中封閉1 h，PBST溶液充分洗膜后，用質(zhì)量分數(shù)5%脫脂牛奶分別稀釋Anti-GST/Anti-His一抗（1∶1000稀釋）和熒光二抗（1∶1000稀釋）。再將膜置于蛋白標簽相對應的一抗稀釋液中，4℃過夜孵育。然后用PBST溶液充分洗膜，再將膜置于熒光二抗稀釋液中孵育2 h，最后用PBST溶液清洗膜上殘留二抗，利用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)成像。

2 實驗結果

2.1 八肋游仆蟲NMD途徑相關蛋白因子的鑒定

陷攝蟲超群類生物處在真核生物進化譜系最早的分支，進化程度最低[2，4]，對于研究 NMD 途徑的起源與進化十分重要。而藍氏賈第蟲剛好處于這一分支，所含NMD因子在種類上比較少，不存在外顯子連接復合體組分蛋白因子。在多貌生物超群中，八肋游仆蟲和嗜熱四膜蟲均屬于囊泡蟲超門（Alveolatas）中的纖毛蟲類。擬南芥則屬于陸生高等植物，其NMD核心蛋白因子種類都在兩種及以上，也含有EJC組分蛋白因子。真菌和動物界均劃定在單鞭毛超群中，釀酒酵母的NMD相關蛋白因子種類也比較少，而人類的因子種類最為豐富。對于mRNA降解相關蛋白因子，無論物種進化程度高低，在各種生物細胞中均存在。從八肋游仆蟲基因組數(shù)據(jù)庫中，通過同源比對鑒定到11種NMD相關蛋白因子基因（圖1），包括UPF1（GenID：Contig 9114）、UPF2（GenID：Contig 14745）、MAGO（Gen-ID：Contig 11747）、Y14（GenID：Contig 15189）、UAP56（GenID：Contig 12743）、eIF4AIII（GenID：Contig 8403）、POP2（GenID：Contig 5432）、Exosome（GenID：Contig 25198）、XRN1（GenID：Contig 15461）、DCP2（GenID：Contig 21304）和PABP（Gen-ID：Contig 7968）。

圖1 八肋游仆蟲與其他生物的NMD途徑相關同源蛋白因子比較Fig.1 Comparison of NMD pathway-related homologous protein factors betweenE.octocarinatusand other organisms

表1 本研究所用到的寡核苷酸引物Table 1 List of oligonucleotide primers used in this work

用人類SMG1蛋白氨基酸序列在Euplotes octocarinatusGenome Database中作tblastn搜索時，得到一條屬于PIKK（Phosphatidylinositol 3-kinase-reated protein kinase）蛋白激酶家族的序列，PIKK蛋白激酶家族由SMG1、ATM、ATR、PRKDC和mTOR成員組成，它們在基因準確表達的監(jiān)控上起到重要作用[18]，功能結構域注釋和系統(tǒng)發(fā)育樹結果（圖2）顯示，其與 mTOR（mammalian target of rapamycin）聚為一支，所以認為mTORL蛋白（GenID：Contig 9214）可能是八肋游仆蟲的PIKK家族成員。對mTORL的功能結構域預測，發(fā)現(xiàn)在其N端沒有人類 mTOR 的 HEAT（huntingtin，elongation factor 3，PP2A and TOR1）重復結構域，而是未知功能的結構域DUF3385，但擁有FAT、FRB、PIKK和FATC這些PIKK家族蛋白保守結構域。

圖2 八肋游仆蟲mTORL蛋白功能結構域注釋（A）及PIKK家族蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹（B）Fig.2 Schematic representation of mTORL ofE.octocarinatus（A）and phylogenetic tree of PIKK family proteins（B）

對鑒定到的這些NMD相關蛋白因子進行結構域注釋（圖3）。八肋游仆蟲UPF1與人類UPF1的相似度為40%，與嗜熱四膜蟲UPF1a的相似度為43%，與嗜熱四膜蟲UPF1b的相似度為23%。S/T模體（motifs）是UPF1上蛋白激酶SMG1的磷酸化修飾位點，在八肋游仆蟲、嗜熱四膜蟲以及酵母UPF1蛋白中均沒有人類UPF1蛋白C末端的S/T模體，并且在這三種生物細胞中也都沒有找到SMG1蛋白因子。八肋游仆蟲UPF2具有3個MIF4G結構域，與人類UPF2蛋白相似度為18%，與嗜熱四膜蟲UPF2蛋白相似度為17%；鑒定到的八肋游仆蟲的四種外顯子連接復合體組分蛋白因子eIF4AIII、MAGO、Y14和UAP56中，前三種是EJC核心蛋白組分，其與人類相應的因子相比，相似度分別為65%、67%、41%和59%；與嗜熱四膜蟲相比，相似度分別為67%、68%、36%和45%。加工體（processing body，P-body）是真核生物細胞中mRNA降解的場所[19-20]，從八肋游仆蟲基因組中分別鑒定到的P-body組分蛋白有XRN1、POP2和DCP2。這三種蛋白與人類同源蛋白相似度分別為24%、38%和19%。外切體（exosome）在mRNA去腺苷酸化后會沿著5′→3′的方向降解mRNA[21]，八肋游仆蟲外切體蛋白與人類外切體9相似度為22%。PABP（poly A binding protein）蛋白與Poly（A）尾巴的結合對于維持mRNA的穩(wěn)定性以及無義mRNA的識別至關重要[22]，八肋游仆蟲PABP蛋白與人類PABP蛋白的相似度為23%。

圖3 八肋游仆蟲NMD相關蛋白因子功能結構域示意圖Fig.3 Schematic representation of functional domain of NMD-related protein factors inE.octocarinatus

2.2 eUPF1與eUPF2蛋白三級結構預測與蛋白分子對接

eUPF1和eUPF2是NMD途徑核心蛋白因子，eUPF1-CH結構域與eUPF2-U1BD結構域之間的相互作用對于NMD途徑的啟動至關重要。UPF1-CH結構域多序列比對結果表明該結構域在進化上比較保守（圖4A），CH結構域是一段富含Cys和His殘基的結構域。其中，在eUPF1（71-166 aa），即對應人類hUPF1的123-213 aa的這段比對區(qū)域中，Cys-His占16.67%；對UPF2-U1BD結構域的多序列比對，及其二級結構與人類hUPF2-U1BD結構域二級結構比對的結果（圖4B）表明，eUPF2-U1BD-αA在結構和序列上相對保守。前期通過體外Pull-down和酵母雙雜交實驗驗證了eUPF1-CH與eUPF2-U1BD之間的相互作用關系，并闡明了UPF2對NMD途徑啟動的重要性[11-12]，但這二者之間如何進行相互作用仍不清楚。

圖4 八肋游仆蟲UPF1-CH和UPF2-U1BD結構域的多序列比對Fig.4 Sequences alignment of UPF1-CH and UPF2-U1BD domains ofE.octocarinatuswith that of other species.（A）Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of UPF1-CH protein.In UPF1（71-166 aa）of E.octocarinatus，using small triangle mark at the conservative sequence of Cys and His residues.（B）Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of UPF2-U1BD protein.The secondary structures of UPF2-U1BD ofE.octocarinatusand human were marked，respectively

蛋白質(zhì)分子的空間結構決定其功能，采用同源建模預測eUPF1蛋白的三級結構（圖5A）。以人類UPF1-UPF2復合體的晶體結構（PDB ID 2wjv.1.A）為模板建模，模型質(zhì)量QMEAN得分為-1.81，可信度GMQE得分為0.66，與模板的相似度為47.91%。對eUPF2蛋白三級結構進行預測（圖5B），模型質(zhì)量評估系數(shù)C-score得分為-0.48，兩兩結構相似度系數(shù)TM-score得分為（0.65±0.13），兩兩結構間的距離偏差RMSD得分為（8.4±4.5）?。

圖5 八肋游仆蟲UPF1與UPF2蛋白三級結構預測及其相互作用關鍵氨基酸分析Fig.5 Prediction of tertiary structure of eUPF1 and eUPF2 proteins and analysis of key amino acids for their interaction

為了進一步研究eUPF1-CH與eUPF2-U1BD（αA-helix，767-786 aa）之間相互作用的關系，將二者進行蛋白分子對接，以hUPF1與hUP2相互作用的關鍵結構和氨基酸為參照，從對接結果中挑選合理的對接模型。對挑選好的蛋白復合體模型，采用PDBePISA進行在線分析。分析結果顯示，它們之間的相互作用面積為793.6 ?2，在這種對接方式下的自由能ΔiG的值為-13.1。

已有研究證實hUPF1-CH上與hUPF2-U1BD相互作用的關鍵氨基酸殘基有V157、V161、F192、L193、I233、R236[23]。根據(jù)多序列比對結果（圖4A）和PISA結果，我們推測eUPF1-CH上與eUPF2-U1BD相互作用的關鍵氨基酸殘基是V108，V111，F(xiàn)145，L147，I186 和 K189，其中eUPF1-CH 殘基V111、F145和 I186，與hUPF1-CH 殘基 V161、F192和I233在多序列比對上相一致，eUPF1-CH殘基V108和L147分別對應hUPF1-CH殘基V157的+1位氨基酸和L193的+2位氨基酸，而hUPF1-CH上氨基酸殘基R236對應eUPF1-CH上殘基K189，二者均為帶正電荷的氨基酸，來維系蛋白質(zhì)的空間結構。

在hUPF2-U1BD中的αA-helix結構（767-786 aa）中，與hUPF1-CH結構域相互作用的關鍵氨基酸有 F1113、I1114、L1117、M1120、M1121 和 L1125[23]。而在對接模型中，eUPF2-U1BD通過PISA分析、多序列比對（圖4B）、三級結構預測（圖5B），找到兩種因子相互作用的關鍵的氨基酸是F772、L776、M779、I780、F784 和 K786。其中F772、L776、M779與hUPF2中氨基酸殘基F1113、L1117和M1120在序列比對上相一致。

對接模型經(jīng)過Discovery Studio 4.5 Visualizer軟件進行分析（圖5C）后，發(fā)現(xiàn)eUPF2-U1BD中的αA-helix結構與eUPF1-CH相互作用面具有較強的疏水作用（圖5.Ca，Cb）。此外，這兩個相互作用的結構域還靠氫鍵來維持（圖5.Cc，Cd），形成氫鍵的氨基酸殘基分別是N116與E768、S101與K786、V111與Q769。

2.3 eUPF2-U1BD空間結構中的αA-helix對于eUPF1與eUPF2的相互作用起到關鍵作用

已有研究證實，在hUPF2-U1BD的N端部分（1108-1128 aa）會形成一個長而微彎的α-螺旋，C末端部分會折疊形成β發(fā)夾結構（1167-1189 aa）[23]。這兩個結構分別獨立地結合在hUPF1 CH結構域的兩個相對的面上。在eUPF2蛋白中，通過多序列比對以及結構預測發(fā)現(xiàn)，eUPF2-U1BD空間結構存在三個α-螺旋（圖4B和圖5B），但只有αA與hUPF2-U1BD在結構和序列上與之相對應，即αA-helix結構（767-786 aa）。那么αA-helix是否也是eUPF1與eUPF2之間相互作用的關鍵結構呢？為了驗證這一問題，我們利用定點突變技術，將這段αA-helix對應基因進行缺失突變（圖6A）。然后利用原核表達系統(tǒng)進行表達，以野生型為對照。采用GST Pull down和His Pull down實驗來分別驗證野生型和突變型eUPF2-U1BD與eUPF1-CH之間的相互作用。研究結果（圖6B）發(fā)現(xiàn)，eUPF2-U1BD突變型喪失了其與eUPF1-CH相互作用的能力，說明αA-helix對于eUPF2-U1BD與eUPF1-CH之間的相互作用至關重要。

圖6 αA-helix結構在eUPF2-U1BD與eUPF1-CH互作過程中關鍵作用Fig.6 Important role of αA-helix for the interaction between eUPF2-U1BD and eUPF1-CH domain

3 討論

縱觀NMD通路的研究歷程，在以人類為代表的高等真核生物和以釀酒酵母為代表的低等真核生物上取得了豐碩的研究成果，并提出了多種合理的模型來解釋含有PTC的轉(zhuǎn)錄本如何被識別和降解。人類NMD途徑（圖7a）監(jiān)控mRNA的質(zhì)量基于首輪的翻譯過程，當核糖體滑動停滯到PTC處時，首先招募形成SURF復合體，隨后UPF2作為橋梁連接起了與EJC結合的UPF3b因子，從而提出了依賴于外顯子連接復合體的經(jīng)典模型[1]。值得注意的是，PTC需處于最后一個外顯子連接處上游50-55 nt時，mRNA才能被NMD識別和降解，這也被稱為“50 nt邊界規(guī)則”[24]。隨著人類NMD因子的復合晶體結構逐漸被解析[23，25-27]，各個因子間的相互作用又充分得到證實。而對于酵母的NMD途徑（圖7b）有學者提出了“偽3’UTR模型”[5]，認為PTC的出現(xiàn)導致了3’UTR的加長，阻礙eRF3與PABP的正常結合，觸發(fā)了NMD途徑。

圖7 不同物種識別含PTC轉(zhuǎn)錄本的機制比較Fig.7 Schematic diagram showing how different organisms′NMD factors are involved in PTC-containing transcript degradation

原生動物在起源與進化上處于特殊地位，通過對原生動物的NMD通路研究，可以更好地了解NMD通路的起源與進化，但關于原生動物的NMD通路的研究報道卻十分稀少。嗜熱四膜蟲NMD通路的研究（圖7c）[6]證實，在敲除了EJC組分核心因子MAGO的基因后，細胞中含PTC的轉(zhuǎn)錄本不會因此上調(diào)，且通過GST-Pull down實驗也證實了EJC與UPF3并未有相互作用關系，進而證實了四膜蟲的NMD途徑不依賴于EJC。通過基因敲除等技術手段，證實了UPF蛋白作為NMD途徑的核心因子，初步推斷了嗜熱四膜蟲的NMD模型，但是該模型仍然不系統(tǒng)、不完整。

本課題組之前曾對藍氏賈第蟲NMD通路（圖7d）進行過研究，基于酵母雙雜交和Pull-down實驗，發(fā)現(xiàn)停滯在PTC處的核糖體上也會形成SURF復合體，隨后UPF1又會與HRP1相互作用，對無義mRNA識別和錨定，激活了NMD途徑，同時也證實了XRN1和Ski7P作為降解含PTC轉(zhuǎn)錄本的下游降解因子[7-8]。此外，課題組前期也對八肋游仆蟲的NMD通路進行過研究[11-12]，發(fā)現(xiàn)八肋游仆蟲NMD通路存在UPF1、UPF2、MAGO和Y14因子，基于酵母雙雜交和Pull-down實驗，證實了UPF1的CH結構域與UPF2的U1BD結構域之間存在相互作用關系。在此基礎上，本研究結合人類同源蛋白晶體結構的研究[23]，即通過hUPF2 U1BD結構域上保守的α-螺旋和β發(fā)夾結構分別獨立地與hUPF1 CH結構域中兩個相對的面結合。利用Pull-down實驗證實了八肋游仆蟲eUPF2可能通過其保守的αA-helix結構域參與eUPF2與eUPF1之間的相互作用。此外，課題組之前也證實了Mago與Y14之間的相互作用關系。本研究在此基礎上又找到一個EJC核心因子eIF4A3，那么它是否與Mago和Y14存在相互作用關系仍有待于實驗證明。另外本課題組之前證實了UPF2的第三個MIF4G結構域與Y14之間的相互作用關系，初步提出了eRF1-eRF3-UPF1-UPF2-EJC的模型（圖7e）。然而八肋游仆蟲的NMD通路與人類相比仍然不完善，不系統(tǒng)。在通路的下游，無義mRNA又會被哪些因子降解呢？為此，基于同源序列搜索，從八肋游仆蟲大核基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出11種NMD相關因子，其中可能直接參與mRNA降解的因子有脫帽酶DCP2、去腺苷酸化酶POP2、外切酶XRN1和外切體exosome，那么這些因子是否也具有類似人類同源蛋白的功能[1]，仍有待于后續(xù)的實驗驗證。

在八肋游仆蟲基因組數(shù)據(jù)庫中并未找到SMG1，在其他真核生物分類譜系中也能找到SMG1缺失的物種（如擬南芥，釀酒酵母）[2]。在人類NMD通路中，SMG1可以磷酸化修飾hUPF1的S/TQ模體，改變蛋白質(zhì)分子的空間構象，調(diào)節(jié)UPF1的解旋酶活性[25]。磷酸化UPF1執(zhí)行完功能后會被去磷酸化酶PP2A（serine/threonine protein phosphatase 2A）去磷酸化[1]，然而在游仆蟲大核基因組數(shù)據(jù)庫中也沒有找到PP2A。那么在SMG1缺失的物種中，UPF1是否需要被磷酸化激活或被其他激酶（如酪氨酸蛋白激酶）激活仍然是NMD機制懸而未解的重要問題。