呂良，蘇瑞軍，晉小婷，張立超，李卓玉*

（1.山西大學 生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西大學 生物醫(yī)學研究院，山西 太原 030006）

0 引言

四溴雙酚A（Tetrabromobisphenol A，TBBPA）是目前全球廣泛使用的溴代阻燃劑（BRFs）之一[1]，因其熱穩(wěn)定性高而被添加用于環(huán)氧樹脂、聚酯樹脂等產(chǎn)品中，從而使產(chǎn)品擁有優(yōu)良的阻燃性和自熄性。TBBPA在全球年產(chǎn)量近17萬噸，其中我國是亞洲的生產(chǎn)大國[2]。近些年，TBBPA在各種環(huán)境介質中被檢出，如沉積物、水體、土壤、大氣等[3-5]。美國國家毒理學計劃（NTP）研究證實，TBBPA暴露導致大鼠甲狀腺激素水平改變，并發(fā)現(xiàn)TBBPA暴露增加了大腸癌的發(fā)病率[6]。2016年國際癌癥研究中心（IARC）將TBBPA列為2A級致癌物質[7]。但環(huán)境濃度暴露下TBBPA對肝的致癌風險尚需進一步評估。

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）有較高發(fā)病率和死亡率，是五大常見癌癥之一[8]。我國新診斷肝癌患者占全世界肝癌人數(shù)的60%，其死亡率居惡性腫瘤第二位[9]。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，正常的肝細胞會從卵石狀向長梭形轉變，同時許多肝癌標志物的表達也會發(fā)生相應變化，對肝癌進展有重要影響。GPC-3是一種在肝癌組織中高表達的蛋白，是肝癌早期的敏感標記物[10]。MMP-2和MMP-9是基質金屬蛋白酶家族的重要成員，在肝癌組織中的表達高于癌旁組織，主要參與破壞細胞外基質，促進腫瘤細胞浸潤和轉移[11]。VEGF是血管生成因子，在肝癌組織中高表達[12]。腫瘤細胞中高表達的VEGF分泌到腫瘤微環(huán)境，能夠促進腫瘤相關血管的生成，從而利于腫瘤細胞生長、浸潤以及轉移[13-15]。因此，通過檢測上述肝癌標志物表達量的變化，能夠有效地評估環(huán)境濃度TBBPA長期暴露的致肝癌風險。

有研究表明高濃度TBBPA引起人正常肝細胞L02氧化應激ROS升高，降低細胞線粒體膜電位（MMP）并增加細胞凋亡水平[16]。TBBPA對肝癌細胞HepG2的毒性作用及劑量研究表明，TBBPA對HepG2細胞具有明顯毒性，基準劑量值為 9.45 μmol/L[17]。并隨TBBPA濃度增加（＞1 μmol/L）HepG2細胞活力下降，ROS過量生成及細胞凋亡增加[18]。Chen等研究表明暴露于600 mg/kg的TBBPA會損害鯛魚肝臟[19]。Arnon等研究表明TBBPA對肝臟毒性主要是對組織損害[20]。Yang等研究表明慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和非酒精性脂肪肝的病因與肝細胞凋亡密切相關[21]。然而，低劑量的環(huán)境濃度TBBPA暴露對肝癌的風險尚未報道。因此本研究以人正常肝細胞系HL-7702為材料，用低劑量環(huán)境濃度的TBBPA進行長期暴露，檢測細胞在形態(tài)學和分子層面的變化。探討TBBPA與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關性，可為環(huán)境濃度TBBPA長期暴露的致肝癌風險提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HL-7702細胞（ATCC，USA），胎牛血清（Gibco，USA），RPMI-1640培養(yǎng)基（Minibio，China），TBBPA（St.Louis，Mo，USA），DMSO（Solarbio，China），反轉錄試劑盒（TransGen Biotech，China），CO2細胞培 養(yǎng) 箱（Eppendorf Galaxy170S），倒 置 顯 微 鏡（Zeiss，Germany），實 時 定 量 PCR 儀（Bio-Rad，USA）。

1.2 HL-7702細胞的培養(yǎng)

人源正常肝細胞HL-7702培養(yǎng)于37℃，體積分數(shù)為5% CO2，恒溫恒濕條件下。所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.3 細胞毒性測定

采用CCK-8對細胞存活率進行測定。將生長狀態(tài)良好的HL-7702細胞用胰酶消化，1 000 r/min離心并制成細胞懸液，接種到96孔板中（2×103個/孔）。人體血液樣本中TBBPA的濃度約為1.3×10-8mol/L～9.5×10-12mol/L[22]，因此在細胞貼壁后，對照組用空白培養(yǎng)基處理，實驗組用含濃度為1.00×10-12、1.00×10-11、1.00×10-10、1.00×10-9、1.00×10-8、1.00×10-7、1.00×10-6、1.00×10-5、1.00×10-4mol/L的TBBPA培養(yǎng)基處理，24 h更換一次培養(yǎng)基，48 h后更換無血清培養(yǎng)基并加入CCK-8，2 h后450 nm下測定吸光值。

1.4 細胞形態(tài)觀察

將2×106個對數(shù)期HL-7702細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，用倒置顯微鏡拍攝0周時細胞形態(tài)圖像。將細胞計數(shù)，取2×106個細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，收集余下的細胞作為0周時細胞樣。待傳代細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基并用PBS緩慢洗3次，加入10 mL含1.00×10-8mol/L的TBBPA培養(yǎng)基處理1周，并拍攝1周時細胞形態(tài)圖像。將細胞計數(shù)，取2×106個細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，收集余下的細胞作為1周時細胞樣。第2、3和4周的處理方法與第一周相同。

1.5 實時熒光定量PCR

收集TBBPA暴露處理0、2、4周后的HL-7702細胞樣品，加入Trizol提取總RNA，并利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA模板，然后于實時定量PCR儀進行qRT-PCR分析。內(nèi)參GAPDH基因將目的基因mRNA表達量進行均一化處理?；虮磉_變化的計算采用倍增變化率表示，倍變化增率=2-△△Ct（△Ct為目的基因和內(nèi)參基因Ct值的差值）。實驗引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.6 集落形成實驗

將TBBPA暴露處理0、2、4周的HL-7702細胞接種于24孔板中（5×103個細胞/孔），用空白培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d。吸棄培養(yǎng)基，PBS緩慢清洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min。吸棄4%多聚甲醛，PBS緩慢清洗3次，加入700 μL 0.5%結晶紫染色液，染色15 min。吸棄染色液，PBS緩慢清洗3次，室溫干燥。用顯微鏡對染色后的細胞進行拍照，每組重復3次。將拍照后的細胞每孔加入700 μL 1% SDS溶液，室溫孵育20 min后混勻，每孔吸取100 μL加入96孔板中（6組平行），用酶標儀在波長570 nm下檢測吸光值。集落形成率=（實驗組吸光值/對照組吸光值）×100%。

1.7 錨著獨立性生長實驗

用RPMI-1640培養(yǎng)基配制1.4%的瓊脂糖溶液高溫高壓滅菌15 min，稍冷后放入39℃恒溫水浴鍋中保溫，然后加入預溫的含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成0.7%瓊脂糖溶液。取6孔板，每孔加入1.5 mL 0.7%瓊脂糖溶液鋪制底層瓊脂，凝固后備用。分別將TBBPA暴露處理0、2、4周的HL-7702細胞與等體積的0.7%瓊脂糖溶液與細胞懸液充分混勻，使上層瓊脂糖終濃度為0.35%，每孔加1 mL，接種細胞密度為5×103個細胞/孔。待頂層瓊脂凝固后每孔加入1 mL空白培養(yǎng)基。在37℃，體積分數(shù)為5% CO2，恒溫恒濕條件下進行培養(yǎng)（每3天更換一次培養(yǎng)基）。待長出單細胞克隆團時，吸棄培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計每組克隆的單細胞克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×1000‰，用mean±SD表示。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0和SPSS軟件進行分析，用t檢驗對樣本均值進行比較，結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示，*P＜0.05，**P＜0.01，表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 環(huán)境濃度TBBPA短期暴露對人正常肝細胞存活率沒有影響

首先采用CCK-8檢測不同濃度的TBBPA短期暴露對HL-7702細胞存活率的影響情況。如圖1所示，TBBPA在環(huán)境濃度（1.00×10-12～1.00×10-8mol/L）下對細胞存活率影響不大，而濃度大于1.00×10-8mol/L時，隨著濃度的增加細胞存活率逐漸降低，數(shù)據(jù)表明環(huán)境濃度下的TBBPA對肝正常細胞的存活率沒有顯著影響。因此，將采用1.00×10-8mol/L的TBBPA長期暴露，探究TBBPA對HL-7702細胞的致癌風險。

圖1 環(huán)境濃度TBBPA短期暴露對人正常肝細胞的存活率沒有影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=6）Fig.1 No effect of liver cells viability rate by short-term TBBPAexposure can be observed（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=6）

2.2 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對人正常肝細胞形態(tài)變化影響

用1.00×10-8mol/L的TBBPA暴露細胞1～4周后，細胞形態(tài)變化見圖2。由圖2可知，對照組細胞呈正常的鵝卵石形狀。經(jīng)TBBPA暴露后，細胞數(shù)量變化不明顯，部分細胞出現(xiàn)細長梭形的形態(tài)，細胞間空隙增大，細胞出現(xiàn)絲狀偽足，呈現(xiàn)癌細胞的遷移形態(tài)特征。結果表明：環(huán)境濃度TBBPA長期暴露引起細胞形態(tài)學改變，表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對HL-7702細胞有誘發(fā)細胞癌變的風險。

圖2 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對人正常肝細胞形態(tài)變化影響（黑色箭頭指示為細胞偽足，n=3）Fig.2 Effect of morphological in liver cells by long-term TBBPAexposure（Black arrows showed pseudopod of cells，n=3）

2.3 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌早期標志物GPC-3的影響

檢測環(huán)境濃度TBBPA暴露HL-7702細胞0、2、4周后，肝癌早期標志物GPC-3的表達情況。結果表明，GPC-3表達量隨TBBPA暴露時間增加而顯著升高，表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對HL-7702細胞有誘發(fā)癌變的風險。

圖3 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌早期標志物GPC-3的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.3 Effect of long-term TBBPAexposure in early marker of liver cancer GPC-3（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.4 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌浸潤、轉移主要標志物MMPs的影響

檢測環(huán)境濃度TBBPA暴露HL-7702細胞0、2、4周后，肝癌浸潤、轉移標志物MMP-2和MMP-9的表達情況。如圖4所示，隨TBBPA暴露時間增加，MMP-2表達量略有升高，MMP-9的表達量顯著升高。結果表明：環(huán)境濃度TBBPA長期暴露能夠引起HL-7702細胞浸潤和轉移標志物表達升高，有誘發(fā)細胞癌變的風險。

圖4 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌浸潤、轉移主要標志物MMPs的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.4 Effect of long-term TBBPAexposure in MMPs，the major marker of liver cancer infiltration and metastasis（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.5 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對腫瘤相關血管生成關鍵標志物VEGF的影響

檢測環(huán)境濃度TBBPA暴露HL-7702細胞0、2、4周后，細胞中血管生成標志物VEGF的表達情況。如圖5所示，結果表明：VEGF表達量隨TBBPA暴露時間增加而顯著升高，這說明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露促進HL-7702細胞血管生成關鍵標志物VEGF基因表達，有誘發(fā)細胞癌變的風險。

圖5 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對肝癌瘤內(nèi)血管生成關鍵標志物VEGF的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.5 Effect of long-term TBBPAexposure on VEGF，the key marker of angiogenesis in liver cancer（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.6 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細胞集落形成的影響

檢測TBBPA暴露處理0、2、4周的HL-7702細胞的集落形成情況，結果如圖6所示。結果表明：與對照組相比，集落形成數(shù)量隨暴露時間增加而顯著增加（圖6 A），圖6 B為定量統(tǒng)計圖，這說明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露能促進HL-7702細胞集落的形成，有誘發(fā)細胞癌變的風險。

圖6 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細胞平板克隆形成率的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.6 Effect of long-term TBBPAexposure in colony formation efficienty of cells（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

2.7 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細胞軟瓊脂克隆形成的影響

軟瓊脂錨著獨立生長能力和細胞的侵襲性密切相關。圖7結果表明，與對照組相比，軟瓊脂克隆形成率隨暴露時間增加而增加，對照組克隆形成率為（1.67±0.54）‰，TBBPA暴露2周組克隆形成率為（1.89±0.42）‰，TBBPA暴露4周組克隆形成率為（2.28±0.16）‰。表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露能增強HL-7702細胞錨著獨立生長能力，有誘發(fā)細胞癌變的風險。

圖7 環(huán)境濃度TBBPA長期暴露對細胞軟瓊脂克隆形成的影響（與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）Fig.7 Effect of long-term TBBPAexposure in soft agar colony formation of cells（Compared with the control，*P＜0.05，**P＜0.01，n=3）

3 討論

肝臟是人體中控制葡萄糖代謝、脂質代謝和有害物質排出的關鍵器官[23]，是應激反應的主要器官，具有多種抗壓的酶[24-27]。環(huán)境污染物暴露能引起肝功能異常[28]，誘發(fā)肝臟病變。TBBPA暴露能引起肝母細胞瘤、血管瘤和大腸腫瘤的發(fā)病率增加[29]。有研究表明，TBBPA暴露引起子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa細胞形態(tài)明顯改變，由卵圓形變成長梭形，少數(shù)細胞出現(xiàn)絲狀偽足[22]。Voulgari等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞在浸潤和轉移過程中，細胞形態(tài)變細長并出現(xiàn)偽足[30]。在本研究也得到相似結果，發(fā)現(xiàn)長期環(huán)境濃度TBBPA暴露能夠誘導肝正常細胞發(fā)生明顯的形態(tài)改變，提示有引起肝細胞癌變的風險。肝癌標志物GPC-3、MMPs和VEGF對原發(fā)性肝癌的檢測診斷非常重要。GPC-3在HCC組織中高度表達，有文獻表明GPC-3可以作為肝癌的一種新的早期標志物[10，31]。本研究中環(huán)境濃度 TBBPA 長期暴露人HL-7702細胞后，早期肝癌標志物GPC-3在第2周就發(fā)生顯著升高，表明GPC-3響應敏感，預示細胞有早期癌變趨勢。MMPs是腫瘤細胞惡化時破壞細胞外基質的主要參與者，其典型代表MMP-2和MMP-9與腫瘤細胞的浸潤和轉移關系最為密切，且MMP-2和MMP-9的高表達是腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉移的重要因素之一[11]。有研究表明，TBBPA顯著誘導人乳腺癌MCF-7細胞中MMP-9的表達升[32]。McCormick等在TBBPA暴露斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)，MP P-2、MMP-9和MMP-13表達增加2 ～ 8[33]。在本研究中，TBBPA暴露4周后，HL-7702細胞中MMP-2和MMP-9表達顯著增加，表明TBBPA暴露可以通過影響MMP-2和MMP-9表達來促進腫瘤的惡化。

VEGF與血管生成密切相關，參與腫瘤的生長、浸潤和轉移，在肝癌組織中VEGF常常高表達，并分泌到微環(huán)境中促進腫瘤相關血管的生長[12-15]。VEGF能特異性結合血管內(nèi)皮細胞上的受體，促進血管生成，從而維持腫瘤的繼續(xù)生長[34-35]。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5細顆粒物暴露人肺上皮細胞和肺微血管內(nèi)皮細胞引起 VEGF、IL-6、MDM-2、AKT-1、STAT、和P-53表達失調，在一定程度上解釋了PM2.5細顆粒物的致癌分子機制[36]。本研究中TBBPA長期暴露HL-7702細胞后，能夠誘導細胞中VEGF表達顯著升高，為TBBPA通過促進血管生成增加致癌風險提供一定的依據(jù)。

集落形成和錨著獨立生長實驗是檢測腫瘤細胞生物學特性常用的方法[37]。腫瘤細胞失去接觸抑制，可在平板中形成集落或在半固體瓊脂培養(yǎng)基中形成克隆，具有錨著獨立生長能力，是惡性腫瘤細胞重要標志[38]。李世珍等研究表明，鈾礦粉暴露支氣管上皮細胞誘導細胞呈錨著不依賴性增長，獲得了惡性細胞特征[39]。唐瑩等研究表明，高劑量煙塵染毒肺泡II型上皮細胞，細胞軟瓊脂克隆能力增強，預示高劑量煙塵染毒引起細胞惡性轉化[38]。本研究中TBBPA長期暴露HL-7702細胞后，隨暴露時間增加，HL-7702細胞的集落形成率和軟瓊脂克隆率增加，說明TBBPA長期暴露誘導HL-7702細胞呈現(xiàn)錨著不依賴性生長，獲得了某些惡性細胞的生物學特性，為TBBPA長期暴露增加致癌風險提供實驗依據(jù)。

4 結論

本研究結果表明，環(huán)境濃度TBBPA長期暴露人正常肝細胞HL-7702后，誘導細胞形態(tài)呈長梭形，細胞間隙變大，出現(xiàn)絲狀偽足，呈現(xiàn)癌細胞特征。此外，細胞內(nèi)早期肝癌標志物GPC-3、MMPs和VEGF的表達量顯著升高，細胞集落形成和錨著獨立生長能力增強。表明環(huán)境濃度TBBPA長期暴露有誘發(fā)肝細胞癌變的風險，該結果為評價TBBPA的致癌風險奠定了一定的理論基礎。