劉懿萱，文澤軒，郭 林，盧仁泉

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室，上海 200030

卵巢癌是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］。盡管有研究［2］顯示，早期卵巢癌患者術(shù)后5年生存率可達(dá)80%～90%，但卵巢癌起病隱匿，早期缺乏明顯臨床癥狀，因此大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于腫瘤晚期，失去了根治性切除的機(jī)會(huì)。目前以鉑類為主的藥物治療仍然是卵巢癌治療不可或缺的手段，雖然大多數(shù)患者經(jīng)手術(shù)和術(shù)后化療可獲得完全緩解，但還是有80%的患者會(huì)在治療后2年左右復(fù)發(fā)，隨著化療藥物使用時(shí)間的延長(zhǎng)，幾乎所有患者最終都會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后差的主要原因［3］。通過(guò)鉑類藥物的細(xì)胞毒作用從而達(dá)到殺傷卵巢癌細(xì)胞的目的，其主要機(jī)制是形成鉑-DNA交聯(lián)物，造成腫瘤細(xì)胞基因組高度不穩(wěn)定，干擾DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。因此，卵巢癌細(xì)胞能否有效地應(yīng)對(duì)鉑類藥物造成的DNA損傷是鉑類藥物是否發(fā)揮作用的關(guān)鍵。卵巢癌患者一旦發(fā)生鉑類藥物耐受，就會(huì)嚴(yán)重影響臨床治療效果。探索導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞鉑類藥物耐受的關(guān)鍵基因，并闡明其作用機(jī)制，對(duì)于卵巢癌患者的診斷、治療和預(yù)后預(yù)測(cè)都具有重要意義。

腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)，細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生拮抗作用，藥物在被細(xì)胞吸收后失活以及細(xì)胞生長(zhǎng)因子或抗凋亡蛋白的增加等幾種途徑對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐受性，但DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)是最關(guān)鍵因素［4］。盡管臨床上已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種新型化療藥物和化療方案，但當(dāng)前化療的整體效果并不理想，解決卵巢癌患者臨床耐藥問(wèn)題已成為進(jìn)一步提高療效、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

蘇氨酸酪氨酸激酶1（threonine tyrosine kinase 1，TTK1）作為一種經(jīng)典的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶，是紡錘體組裝檢查點(diǎn)的必需組分，可確保染色體的正確分離［5］。TTK1的高表達(dá)使得細(xì)胞在分裂期間經(jīng)歷大量的染色體倍增或缺失，從而可能損害其正常的生理功能。有研究［6-7］表明，TTK1可通過(guò)調(diào)控紡錘體組裝檢查點(diǎn)的方式保護(hù)細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，因此，TTK1的高表達(dá)對(duì)于腫瘤細(xì)胞在鉑類藥物造成細(xì)胞毒性的環(huán)境中維持細(xì)胞增殖可能至關(guān)重要，TTK1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，是乳腺癌、肺癌、腦腫瘤和結(jié)直腸癌預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子，然而TTK1在卵巢癌鉑類耐藥中的報(bào)道少見(jiàn)。

本研究利用生物信息學(xué)分析，篩選與TTK1相互作用的基因，進(jìn)行生物學(xué)功能分析，并建立耐藥機(jī)制網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)合RNA測(cè)序（RNA-sequencing，RNA-seq）分析TTK1在鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞中的相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料和方法

1.1 蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）v11.0［8］進(jìn)行基因間相互作用分析。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)可以研究蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘核心的調(diào)控基因。

1.2 差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)分析

對(duì)敲低TTK1的鉑類耐藥卵巢癌細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞RNA的測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用edgeR軟件包［9］對(duì)表達(dá)量M-值的加權(quán)截尾均值（trimmed mean of M-values，TMM）和每一百萬(wàn)次讀數(shù)的記數(shù)（counts per million reads，CPM）標(biāo)準(zhǔn)化，篩選至少一個(gè)在樣本中表達(dá)值CPM大于1對(duì)的基因進(jìn)行差異分析比較。顯著差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：adjustP＜0.05且|logFC|≥1。

1.3 基因富集分析

使用基因本體論（gene ontology，GO）對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分分析。使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行通路富集分析。

1.4 芯片數(shù)據(jù)的獲取與預(yù)處理

從GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載GSE114206基因芯片原始數(shù)據(jù)［10］，平臺(tái)為GPL13497，芯片探針的注釋來(lái)自美國(guó)Agilent Technologies公司，含34 184條信息。利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）提供的GEO2R平臺(tái)檢測(cè)，將全部數(shù)據(jù)保存為Excel格式，利用R軟件中的clusterProfiler包對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行處理并進(jìn)行通路富集。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

鉑類耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780DDP由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院羅建民贈(zèng)予，在含有鉑類藥物的培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)。HOSPIC、A2780和A2780DDP均在含10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。HEK-293T細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中培養(yǎng)。

1.6 免疫組織化學(xué)

操作步驟請(qǐng)參照參考文獻(xiàn)［11］。免疫組織化學(xué)分析使用抗TTK1鼠抗體（sc-376842，美國(guó)Santa Cruz公司），用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）以1∶50稀釋。卵巢癌組織和卵巢癌耐藥組織取自2014—2016年復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科收治的卵巢癌患者，并通過(guò)病理學(xué)檢查確診。該研究得到復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面知情同意書。

1.7 建立TTK1敲低的卵巢癌細(xì)胞株

使用RNAi Designer程序設(shè)計(jì)短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），序列見(jiàn)表1。將shRNA克隆到pLKO.1-puro雙酶切質(zhì)粒（Age1和EcoR5）（美國(guó)Addgene公司）中構(gòu)建重組質(zhì)粒。使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）將重組質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜載體pMD2.G（美國(guó)Addgene公司）以4∶3∶1轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中。48 h后收集病毒上清液，于4 ℃低溫下4 000×r/min離心10 min后過(guò)濾，使用濃度為8 μg/mL的凝聚胺溶液（美國(guó)Sigma公司）將其轉(zhuǎn)移到A2780DDP中感染24 h。使用2 mg/mL的嘌呤霉素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞7 d。最后通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗(yàn)證敲低效率。

表1 shTTK1序列Tab.1 Sequence of shRNA

1.8 Western blot

具體操作方法參照參考文獻(xiàn)［11］。TTK1鼠抗體（sc-376842，美國(guó)Santa Cruz公司）以1∶500稀釋，β-actin鼠抗（60008-1-lg，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）以1∶3 000稀釋，PI3K（4257，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）以1∶1 000稀釋，p-PI3K（4228，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）以1∶1 000稀釋，AKT（4685T，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）以1∶1 000稀釋，p-AKT（4056，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）以1∶1 000稀釋，NF-κb（ab114150，美國(guó)Abcam公司）以1∶500稀釋，p53（ab26，美國(guó)Abcam公司）以1∶500稀釋，TNF-α（6954S，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）以1∶1 000稀釋。

1.9 細(xì)胞免疫熒光

將細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于24孔板的蓋玻片上，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用預(yù)冷PBS洗滌3次，室溫下用4.0%多聚甲醛溶液固定10 min，然后用0.5%的Triton X-100進(jìn)行破膜15 min。牛血清白蛋白封閉1 h后將樣品與所需的一抗4 ℃溫育過(guò)夜。第2天用PBS洗滌一抗，將樣品與1∶5 000稀釋的二抗（Alexa Fluor 488和594，美國(guó)Life Technologies公司）在室溫下避光溫育45 min。PBS洗滌后，用含有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國(guó)Invitrogen公司）的Prolong Gold防褪色試劑固定樣品。使用多光子共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（LAS-AFLite，德國(guó)Leica公司）捕獲圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TTK1相關(guān)的生物學(xué)功能分析

研究蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘關(guān)鍵的調(diào)控基因。首先，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)10個(gè)與TTK1相互作用的相關(guān)基因（表2）進(jìn)行基因之間的相互作用分析（圖1A）。然后對(duì)11個(gè)相互作用的相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析，找到不同條件下顯著相關(guān)的生物學(xué)功能或通路。GO是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)，可以分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能3個(gè)部分。通過(guò)GO富集分析找到與TTK1主要相關(guān)的生物學(xué)功能（圖1B）。發(fā)現(xiàn)TTK1參與有絲分裂、細(xì)胞分化等過(guò)程，在染色體分離過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，TTK1相關(guān)基因顯著富集于細(xì)胞周期相關(guān)通路（圖1C）。鉑類藥物是否發(fā)揮作用其關(guān)鍵就在于卵巢癌細(xì)胞能否有效地應(yīng)對(duì)鉑類藥物造成的DNA損傷［12］。因此，我們構(gòu)建了耐藥機(jī)制網(wǎng)絡(luò)模型，從相關(guān)基因的功能中找到與DNA損傷修復(fù)、染色體分離和細(xì)胞周期相關(guān)的生物通路（表3），并結(jié)合蛋白相互作用構(gòu)建調(diào)控模型，使用Cytoscape軟件實(shí)現(xiàn)可視化（圖1D）。以上結(jié)果表明，TTK1可能通過(guò)CDK1作用于p53信號(hào)通路，影響細(xì)胞周期進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性。

2.2 卵巢癌鉑類耐藥通路分析

芯片GSE114206的樣本取自卵巢癌患者，其中鉑類耐藥患者6例，鉑類敏感患者6例。利用GEO2R平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得4 178個(gè)差異基因（圖2A）。根據(jù)adjustP＜0.05且|log2FC|≥1的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出1 071個(gè)上調(diào)基因，進(jìn)行通路富集。GO分析顯示，生物學(xué)過(guò)程方面，上調(diào)基因主要參與免疫細(xì)胞激活、細(xì)胞黏附及細(xì)胞因子產(chǎn)生；細(xì)胞組成方面，上調(diào)基因主要富集在囊泡腔和含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)中；分子功能方面，上調(diào)基因主要參與受體-配體活動(dòng)和細(xì)胞因子受體結(jié)合（圖2B）。KEGG分析顯示，通路富集主要集中在細(xì)胞因子間受體相互作用和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子相關(guān)通路（圖2C）。

表2 TTK1相互作用的分子Tab.2 Molecules interacting with TTK1

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析TTK1生物學(xué)功能Fig.1 Database analysis of biological function of TTK1

表3 DNA損傷修復(fù)、染色體分離和細(xì)胞周期相關(guān)的生物通路Tab.3 Biological pathways related to DNA damage repair,chromosome segregation and cell cycle

圖2 卵巢癌鉑類耐藥通路分析Fig.2 Analysis of platinum resistance pathway in ovarian cancer

2.3 TTK1在卵巢癌中的表達(dá)情況

首先，使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析多種人類腫瘤中TTK1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TTK1在多種人類腫瘤中均高表達(dá)（圖3A）。為研究TTK1在卵巢癌中的表達(dá)情況，使用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在細(xì)胞中對(duì)TTK1進(jìn)行定位，用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)TTK1存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，以細(xì)胞質(zhì)為主（圖3B）。接下來(lái)分別提取正常卵巢細(xì)胞HOSPIC、卵巢癌細(xì)胞A2780和鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780DDP的蛋白檢測(cè)TTK1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與卵巢癌細(xì)胞相比，鉑類耐藥后的卵巢癌細(xì)胞中TTK1表達(dá)明顯上調(diào)（圖3C）。使用免疫組織化學(xué)法對(duì)患者來(lái)源的卵巢癌組織及鉑類耐藥后的卵巢癌組織進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)與卵巢癌組織相比，TTK1在鉑類耐藥后的卵巢癌組織中高表達(dá)（圖3D）。以上結(jié)果提示，卵巢癌發(fā)生鉑類耐藥后TTK1表達(dá)上調(diào)，證明TTK1可能參與卵巢癌鉑類耐藥的過(guò)程。

2.4 對(duì)TTK1敲低的卵巢癌鉑類耐藥細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序

為探索TTK1在卵巢癌鉑類耐藥過(guò)程中的作用機(jī)制，使用鉑類耐藥的卵巢癌細(xì)胞A2780DDP構(gòu)建TTK1敲低的細(xì)胞株，并分別提取未敲低組與敲低組的細(xì)胞RNA進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)差異表達(dá)分析，根據(jù)adjustP＜0.05并且|log2FC|≥1的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出TTK1敲低后的161個(gè)上調(diào)基因和199個(gè)下調(diào)基因。對(duì)敲低TTK1后下調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。GO通路富集顯示，敲低TTK1主要影響耐藥細(xì)胞中與細(xì)胞因子相關(guān)的活動(dòng)（圖4A）。為更好地展示KEGG相關(guān)信號(hào)分子的變化倍率，我們基于差異基因制作了相關(guān)熱圖（圖4B）。KEGG通路富集顯示，TTK1可能通過(guò)影響卵巢癌耐藥細(xì)胞的TNF信號(hào)通路、NF-κB通路、PI3K/AKT通路和p53信號(hào)通路等影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性（圖4C），利用Western blot 和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）分別在蛋白水平和mRNA水平上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證（圖4D）。

圖3 TTK1在卵巢癌中的表達(dá)情況Fig.3 The expression of TTK1 in ovarian cancer

圖4 對(duì)TTK1敲低的卵巢癌鉑類耐藥細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq結(jié)果Fig.4 RNA-seq results were performed on TTK1 knockdown ovarian cancer platinum-resistant cells

3 討 論

本研究利用生物信息學(xué)分析，篩選出10個(gè)與TTK1相互作用的基因進(jìn)行功能富集，并根據(jù)相關(guān)生物學(xué)功能構(gòu)建耐藥模型。同時(shí)，根據(jù)GEO芯片對(duì)卵巢癌鉑類耐藥后上調(diào)的差異基因進(jìn)行通路富集分析，接著又通過(guò)卵巢癌細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果分析TTK1參與卵巢癌鉑類耐藥的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)鉑類耐藥的卵巢癌患者，TTK1相關(guān)分子可能成為卵巢癌患者治療的潛在靶點(diǎn)。

細(xì)胞周期對(duì)哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白變化和異常往往導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［13］。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)在細(xì)胞周期的不同階段均發(fā)揮重要作用，例如，啟動(dòng)基因修復(fù)或凋亡信號(hào)以確保細(xì)胞正常進(jìn)入下一階段。因此，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)相關(guān)蛋白常被作為治療腫瘤患者的關(guān)鍵靶點(diǎn)［14］。本研究對(duì)TTK1相關(guān)基因進(jìn)行基因富集分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因集中在細(xì)胞周期，說(shuō)明TTK1可能通過(guò)細(xì)胞周期相關(guān)通路發(fā)揮生物學(xué)功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，鉑類耐藥后的卵巢癌組織中TTK1呈高表達(dá)，推測(cè)TTK1在卵巢癌鉑類耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究對(duì)TTK1敲低的卵巢癌鉑類耐藥細(xì)胞株進(jìn)行RNA測(cè)序，與未敲低組相比，篩選出差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)KEGG富集通路，本研究發(fā)現(xiàn)，敲低TTK1后低表達(dá)的基因主要富集于TNF信號(hào)通路、NF-κB通路、PI3K/AKT通路和p53信號(hào)通路等。p53是一個(gè)重要的抑癌基因，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、周期調(diào)控等重要生物學(xué)過(guò)程。p53信號(hào)通路是鉑類藥物引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷的重要途徑［15-16］。有研究［17］表明，p53蛋白的聚集損害不同類型腫瘤細(xì)胞中p53基因的正常轉(zhuǎn)錄及其凋亡功能，并且可以促進(jìn)卵巢癌發(fā)生鉑類耐藥。本研究結(jié)果證明，TTK1可能通過(guò)p53的改變而影響卵巢癌對(duì)鉑類藥物的敏感性。有研究［18］表明，PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及化療耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用［19］。目前，PI3K抑制劑已被應(yīng)用于治療多種人類腫瘤（卵巢癌［20］、乳腺癌［21］和淋巴瘤［22］）并且展現(xiàn)出較好療效。本研究通過(guò)對(duì)比GEO芯片分析結(jié)果與細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在卵巢癌鉑類耐藥過(guò)程中，細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用，并且TTK1可能通過(guò)細(xì)胞因子相關(guān)通路參與卵巢癌鉑類耐藥的過(guò)程。JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是眾多細(xì)胞因子的共同途徑，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及炎癥等過(guò)程［23］。有研究［24-25］表明，JAK/STAT通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要的作用，可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析了TTK1相關(guān)分子的生物學(xué)功能并討論了TTK1參與卵巢癌鉑類耐藥的分子機(jī)制，TTK1可能通過(guò)上述多種途徑使卵巢癌產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，同時(shí)提出基于TTK1抑制劑的聯(lián)合模式治療卵巢癌可能成為一種新的治療模式。