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      LC-MS/MS測定牛奶中氟蟲腈及代謝物殘留量

      2021-04-22 04:09:42王永芳婁婷婷溫華蔚周磊
      中國乳品工業(yè) 2021年3期
      關(guān)鍵詞:氟蟲萃取柱甲酸

      王永芳,婁婷婷,溫華蔚,周磊

      (1.天津海關(guān)動植物與食品檢測中心,天津300457;2.天津海關(guān) 工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心,天津300457)

      0 引 言

      氟蟲腈是一種苯基吡唑類農(nóng)藥[1,2]。氟蟲腈經(jīng)水解及光解作用,生成氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜、氟甲腈[3],相關(guān)部門對氟蟲腈及代謝物的毒性及對環(huán)境友好度進行了評估[4-5],氟蟲腈代謝產(chǎn)物的毒性比母體大很多[6],使用不當會損害肝臟、腎臟等,我國于2009年10月1日起禁用氟蟲腈,歐盟一些國家也要求禁止使用氟蟲腈進行防蟲[7-8]。

      我國禁止在用于食品加工的動物養(yǎng)殖過程中使用氟蟲腈。國際上,牛奶中氟蟲腈最大殘留限量要求如下:《日本肯定列表》為0.02 mg/kg;歐盟(EU)No750/2010為0.005 mg/kg。國內(nèi)GB 2763-2019中明確了氟蟲腈在生乳中的限量[9],該限量標準對氟蟲腈檢測的相關(guān)標準中未指定生乳的檢測方法[10-13],且目前我國未制定乳制品中氟蟲腈殘留量檢測的相關(guān)標準。目前檢測氟蟲腈的文獻[14-20]越來越多,其中檢測方法涉及到動物源性食品的基質(zhì)大部分為雞蛋和禽肉類,牛奶基質(zhì)較少。本文采用乙腈提取,PEP Plus萃取柱進行凈化,能快速準確地測定牛奶中氟蟲腈及代謝物的含量。

      1 實 驗

      1.1 材料和儀器

      乳制品:牛奶、奶粉(市售);氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜,純度>98.0%,德國Dr.Ehrensorfer公司;乙腈、正己烷、丙酮,色譜純級,迪馬科技;乙酸銨(>98.0%),氯化鈉(>99.5%);國藥集團化學試劑有限公司;甲酸(色譜純)、Cleanert PEP Plus(60 mg/3 m L),博納艾杰爾;Florisil固相萃取柱(1 g/6 mL),色譜科;C18固相萃取柱(150 mg/3 mL),博納艾杰爾。

      液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,安捷倫1290-6460;AL204-IC型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;Promax-2020型水平往復振蕩器,德國Heidolph公司;XH-D型渦旋混合器,上海汗諾儀器有限公司。

      1.2 方法

      1.2.1標準溶液配制

      準確稱取10.0 mg標準物質(zhì),用乙腈溶解,配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的標準溶液,于-20℃冰箱進行保存。根據(jù)檢測需要,用乙腈逐級稀釋至所需濃度。

      工作液的配制。選擇空白牛奶基質(zhì),取適量氟蟲腈及代謝物混合標準溶液配制成一系列濃度的工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

      流動相配制。10 mmol乙酸銨-0.1%甲酸-水溶液:稱取乙酸銨0.78 g,溶解于1 L高純水中,再加入1 mL甲酸,搖勻,常溫保存,現(xiàn)用現(xiàn)配。

      1.2.2色譜條件

      色譜柱:Eclipse C18,100 mm×2.1 mm,1.7μm;流速為0.3 mL/min;柱溫為30℃;進樣量為10μL;流動相為流動相A:0.1%甲酸乙腈;流動相B:10 mmol乙酸銨和0.1%甲酸水溶液,梯度洗脫程序:0~1 min,10%A;1~7 min,100%A;7~8 min,10%A。

      1.2.3質(zhì)譜條件

      離子化模式:電噴霧離子源,負離子模式掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式;電噴霧電壓:4 000 V;霧化氣壓力:40 psi;離子源溫度:350℃;其他參數(shù)如表1所示。

      表1 氟蟲腈及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)

      1.2.4樣品前處理

      1.2.4.1樣品提取

      取5 g牛奶(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中,加入含1%甲酸乙腈10 mL,加入2 g的NaCl,渦旋混勻后,進行超聲提取10 min,轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心5 min,上清液待凈化。

      1.2.4.2樣品凈化

      取上述待凈化提取液2 mL,加入到PEP Plus萃取柱中,前0.5 mL流出液棄去,收集剩余的上樣流出液。過0.22μm過濾膜,上機測定。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 前處理方法的優(yōu)化

      本實驗牛奶基質(zhì)中主要成分為水,還含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖及礦物質(zhì)等,其中的蛋白質(zhì)、脂肪和一些維生素會干擾目標物的提取。關(guān)于動物源性食品中氟蟲腈殘留量的測定的文獻[21-22]中提取試劑均選擇了乙腈,由于丙酮和乙酸乙酯在提取目標物的同時,會萃取出含量較高的脂肪,不利于下一步凈化處理,而乙腈在提取過程中,加入1%甲酸能很好的沉淀蛋白[23],減少脂肪和其他雜質(zhì)的溶出,能減少基質(zhì)對氟蟲腈及其代謝物的干擾,加入適量NaCl鹽析后更好地進行凈化。本實驗采用含1%甲酸的乙腈作為提取溶劑。

      2.2 凈化方法的選擇和優(yōu)化

      牛奶中含有蛋白質(zhì)和脂肪等成分,經(jīng)過乙腈提取后,通過過凈化,能更好的去除雜質(zhì)的干擾,同時減少提取液中雜質(zhì)對檢測儀器的污染。本研究中選擇Cleanert PEP Plus固相萃取柱,F(xiàn)lorisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB凈化柱,氨基石墨復合柱4種凈化柱進行試驗比較。本研究中Florisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB凈化柱,氨基石墨復合柱需進行活化和洗脫,Cleanert PEP Plus固相萃取柱直接對提取液進行凈化。從目標物的回收率實驗和實驗凈化所需時間綜合分析,氨基石墨復合柱和Cleanert PEP Plus固相萃取柱回收率相當,回收率在80%以上,氨基石墨復合柱需要活化洗脫,所需時間是Cleanert PEP Plus固相萃取柱凈化時間的5倍時間,F(xiàn)lorisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB凈化柱回收率偏低,綜上最終選擇Cleanert PEP Plus凈化柱進行實驗。4種凈化柱的回收率如圖1所示。

      圖1 不同凈化柱對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響

      2.3 液相和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

      氟蟲腈及其代謝物的極性為弱極性,查閱相關(guān)文獻[24-27],比較C8和C18色譜柱,如圖2所示,從目標物分離程度及峰形比較,Eclipse C18色譜柱對目標物的分離效果和峰形較好,最終選擇Eclipse C18色譜柱,考慮到樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾,為使目標化合物獲得較好的分離和峰形,降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾,對下列幾種流動相進行比較:A:0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸);B:乙腈-水;C:甲醇-水,如圖3所示,通過對流動相進行考察,甲醇-水(C),目標物分離程度不如乙腈-水(B)、0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)(C)兩種流動相,通過相應(yīng)強度進行比較,0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)(A)使目標物相應(yīng)強度更好,最終選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為流動相。

      圖2 氟蟲腈色譜

      圖3 3種不同流動相氟蟲腈的色譜

      氟蟲腈及代謝物的分子結(jié)構(gòu)中有較多的氟、氯等鹵代基,在電離過程中,分子中易失去氫質(zhì)子,形成負離子,所以本方法在電噴霧離子源(ESI)下采用負離子模式進行掃描。選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式進行分析。首先對目標物進行一級質(zhì)譜分析,確定出4種目標物的母離子,在MS2 SIM掃描模式下優(yōu)化毛細管出口電壓(Fragmentor)參數(shù),按照優(yōu)化出的參數(shù)進行二級質(zhì)譜分析,通過Product Ion掃描模式進行分析,選取信號最強的兩個子離子,通過MRM掃描模式進一步優(yōu)化,確定為各自的定量參數(shù),見表1。按上述優(yōu)化的前處理參數(shù)和儀器參數(shù)進行實驗,見圖4~5。

      圖4 空白牛奶樣品多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜

      圖5 空白基質(zhì)中添加1μg/kg水平4種化合物的MRM色譜

      3 方法驗證

      3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察

      在選用質(zhì)譜進行樣品分析時,會存在基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,M E)問題??瞻谆|(zhì)配制的標準曲線的斜率與溶劑配制的標準曲線的斜率相比,比值越接近1,說明基質(zhì)效應(yīng)越不明顯,通常采用同一樣品的空白基質(zhì)配制曲線進行校正定量,或者選用穩(wěn)定同位素內(nèi)標法等方法減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾[28]。本方法選擇空白牛奶基質(zhì),用該空白基質(zhì)溶液和純試劑甲醇分別配制一定梯度濃度的標準曲線,斜率比值如表2,通過表2,可以看出,氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜在牛奶基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)可以接受,基質(zhì)效應(yīng)不是很明顯,本實驗為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,選用相應(yīng)的空白基質(zhì)配制曲線,對數(shù)據(jù)進行處理。

      表2 氟蟲腈及其3種代謝物在牛奶基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng) %

      3.2 方法的線性及靈敏度

      在空白牛奶基質(zhì)中,分別添加質(zhì)量分數(shù)為1,2,5,10,20,50μg/kg梯度水平制作基質(zhì)曲線,氟蟲腈及代謝物曲線的線性關(guān)系良好,R2均大于0.99,各化合物的定量離子的信噪比均大于10,氟蟲腈及代謝物的定量限為1μg/kg,以3倍信噪比確定為定性限,氟蟲腈及代謝物的定性限為0.6μg/kg,線性方程、相關(guān)系數(shù)R2等參數(shù)見表3。

      3.3 方法的準確度和精密度

      在空白牛奶樣品,分別添加1,2,5μg/kg 3個質(zhì)量分數(shù),每個質(zhì)量分數(shù)進行6平行實驗,氟蟲腈及代謝物的回收率為82.5%~97.4%,變異系數(shù)4.0%~10.5%范圍內(nèi),見表4。其結(jié)果符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的相關(guān)要求。

      3.4 實際樣品分析

      從超市購買20批次牛奶樣品,按照優(yōu)化的檢測方法進行樣品處理檢測,該20批次牛奶樣品中均未檢測出氟蟲腈及3種代謝物。

      表3 氟蟲腈及代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限數(shù)據(jù)

      表4 方法的平均回收率和精密度(n=6) %

      4 結(jié) 論

      本研究優(yōu)化了樣品前處理萃取試劑參數(shù),選擇酸化乙腈進行提取,優(yōu)化了凈化參數(shù),選擇Cleanert PEP Plus固相萃取柱進行凈化,優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜參數(shù),建立了LC-MS/MS法測定牛奶中氟蟲腈及其三種代謝物的測定方法。該方法的回收率、精密度、線性、測定低限等均滿足相關(guān)標準的技術(shù)要求,適用于牛奶中氟蟲腈及代謝物的快速檢測。該研究方法優(yōu)點:定量限低于國內(nèi)外牛奶中氟蟲腈限量值,完全滿足限量檢測需求,其次,該方法檢測效率高,酸性乙腈提取效率高,凈化柱無需活化,優(yōu)化后的儀器條件等因素大大縮短了檢測目標物的時間,便于對大批量牛奶中氟蟲腈進行快速篩查。國家強制標準GB 2763-2019中規(guī)定了生乳的限量,但沒有相關(guān)的檢測標準,該方法的建立可以為建立相關(guān)標準提供數(shù)據(jù)參考,同時也可以為相關(guān)執(zhí)法部門提供技術(shù)支撐,從而保障進出口乳制品的質(zhì)量。

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