李猛，陳美君

（黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150028）

0 引 言

維生素B1是一種重要的水溶性維生素，對維持機體的正常代謝和功能起著重要作用，而我們?nèi)梭w自身無法合成，必須從食物中獲得，在嬰幼兒配方奶粉中是必須添加的營養(yǎng)強化劑之一，因此準確測定嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的含量十分重要[1-6]。目前文獻報道中測定嬰幼兒配方奶粉中維生素B1的方法主要有高效液相色譜法[7-9]、高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]等。其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有前處理簡單，不需要衍生化，靈敏度高等特點，但儀器設(shè)備昂貴，對實驗室條件和檢驗員等要求高，檢驗成本高等缺點。而高效液相色譜法具有儀器較為普及，檢測成本低且檢出限滿足實驗需求等優(yōu)點，所以目前主要采用的方法為高效液相色譜法。其中國家標準GB5413.11-2010嬰幼兒食品和乳品中維生素B1的測定和最新食品標準食品中維生素B1的測定GB5009.84-2016第一法，均采用高效液相色譜法[13-14]。

本文通過分析維生素B1測定的反應(yīng)原理，認為衍生劑的配置和添加量是整體實驗中的一個關(guān)鍵操作點，所以在原有的標準和文獻的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了衍生劑條件，并對樣品經(jīng)過高溫高壓酸水解法和直接調(diào)p H法兩種不同前處理方法進行了比較分析。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

維生素B1標準品（Dr.Ehrenstorfer）；鹽酸硫胺素，純度≥99%；甲醇，色譜純；濃鹽酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、冰乙酸、正丁醇、鐵氰化鉀均為分析純；木瓜蛋白酶，酶活力≥800 U/mg；淀粉酶，酶活力≥3700 U/g。

1 mol/L鹽酸溶液：移去85 mL濃鹽酸加水稀釋至1 000 mL，搖勻。

0.1 mol/L鹽酸溶液：移去8.5 mL濃鹽酸加水稀釋至1 000 mL，搖勻。

0.01 mol/L鹽酸溶液：量取0.1 mol/L鹽酸溶液50 mL，用水稀釋并定容至500 mL，搖勻。

0.05 mol/L乙酸鈉溶液：稱取6.80 g乙酸鈉，加900 mL水溶解，用冰乙酸調(diào)p H為4.0～5.0之間，加水定容至1 000 mL。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后使用。

2.0 mol/L乙酸鈉溶液：稱取27.2 g乙酸鈉，用水溶解并定容至100 mL，搖勻。

100 g/L氫氧化鈉溶液：稱取25 g氫氧化鈉，用水溶解并定容至250 mL。

混合酶溶液：稱取1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶，加水定容至50 mL，渦旋，使呈混懸狀液體，臨用前配置。

20 g/L鐵氰化鉀溶液：稱取2 g鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100 mL，搖勻，臨用前配制。

堿性鐵氰化鉀溶液（衍生劑A）：將5 mL鐵氰化鉀溶液與200 mL氫氧化鈉溶液混合搖勻，臨用前配制。

堿性鐵氰化鉀溶液（衍生劑B）：將10 mL鐵氰化鉀溶液與200 mL氫氧化鈉溶液混合搖勻，臨用前配制。

堿性鐵氰化鉀溶液（衍生劑C）：將15 mL鐵氰化鉀溶液與200 mL氫氧化鈉溶液混合搖勻，臨用前配制。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀，配Waters 2475熒光檢測器；高速離心機，Eppendorf centrifuge 5430R；pH計，Sartorius；手提式高壓滅菌鍋，上海博訊；漩渦震蕩器，Vortex mixer xw-80A。

1.3 色譜條件

色 譜 柱，Phenomenex C18 150×4.6mm；柱溫30℃；流動相：0.05 mol/L乙酸鈉溶液-甲醇（65+35）；進樣量10μL；運行時間5 min；檢測波長：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長435 nm。

1.4 標準儲備溶液的配置

準確稱取鹽酸硫胺素標準品13.1 mg，相當于11.659 mg硫胺素，用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至10 mL，搖勻，置于0～4℃冰箱中，保存期為3個月，濃度為1.1659 mg/mL。

2 樣品測定方法

2.1 樣品前處理的兩種方法

2.1.1樣品前處理方法一

稱取3～5 g樣品于100 mL錐形瓶中（帶有軟質(zhì)塞子），加60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，塞上軟質(zhì)塞子，高壓滅菌鍋中121℃保持30 min。水解后冷卻至室溫，搖勻后用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)p H至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液，搖勻后置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，將酶解液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻過濾，取上清液備用。

2.1.2樣品前處理方法二

稱取3～5 g樣品于100 mL錐形瓶中，加50 mL熱蒸餾水（50～60℃）溶解，用1.0 mol/L鹽酸調(diào)pH至1.7左右后，再用100 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)p H至4.5左右，搖勻后將樣液全部轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻過濾，取上清液備用。

2.2 試液衍生化

準確取上清液1 mL于10 mL指型瓶中，加入1 mL衍生劑A，渦旋衍生10 s，準確加入3.0 mL正丁醇，渦旋萃取1 min，4 500 r/min離心10 min，離心后取上層正丁醇相經(jīng)0.45μm有機微孔濾膜過濾，取濾液于進樣瓶中供分析用。若維生素B1濃度超出線性范圍的最高濃度值，應(yīng)取上清液稀釋適宜倍數(shù)后，重新衍生進樣。

2.3 標準曲線的繪制

另取1.0 mL標準系列工作液，與試液同步進行衍生化，以維生素B1標準工作液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 維生素B1反應(yīng)原理

維生素B1是由氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲基結(jié)合而成[15]，其的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，維生素B1的噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合，經(jīng)鐵氰化鉀氧化劑氧化成具有熒光的硫色素，硫色素溶于正丁醇中成藍色熒光[16-17]。反應(yīng)如圖2所示。硫色素反應(yīng)為維生素B1的專屬反應(yīng)，在一定條件下形成的硫色素與維生素B1濃度成正比。

圖1 維生素B1結(jié)構(gòu)式

圖2 維生素B1測定的反應(yīng)原理

3.2 衍生劑的確定

根據(jù)維生素B1的測定原理，認為在測定維生素B1含量時，衍生劑中的氫氧化鈉提供了堿性介質(zhì)，使噻唑環(huán)開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合后經(jīng)氧化劑鐵氰化鉀氧化生成硫色素，該反應(yīng)是維生素B1的專屬反應(yīng)，因此氫氧化鈉與鐵氰化鉀的濃度直接影響最終的定量結(jié)果，所以認為衍生劑的配置和添加量是一個關(guān)鍵操作點，本實驗嘗試配置不同濃度鐵氰化鉀溶液觀察其對定量的影響，再通過添加不同體積的衍生劑考察氫氧化鈉添加量對測定結(jié)果的影響，如表1所示，使用兩種前處理方法，測定同一樣品，觀察維生素B1含量的變化，確定最佳的鐵氰化鉀濃度和衍生劑的添加量，比較結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)使用衍生劑A時，添加1 000μL對樣液進行衍生，測定結(jié)果最高，衍生反應(yīng)相對更完全。

表1 不同濃度鐵氰化鉀與衍生劑添加量

圖3 維生素B1含量與衍生劑的關(guān)系

3.3 高溫高壓酸水解對維生素B 1測定的影響

方法一中，樣品需要經(jīng)過121℃高溫，酸水解30 min，通過試劑空白加標的方法，考察維生素B1在不受樣品基質(zhì)影響時，在121℃高溫高壓下酸水解30 min對其穩(wěn)定性的影響。取標準儲備液50μL于100 m L棕色容量瓶中，用水定容后搖勻待衍生，做6個平行樣品；另取標準儲備液50μL于100 mL錐形瓶中，加60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，后與方法一中一致（2.1.1），做6個平行樣品；所有樣品與標準工作液同步衍生上機測定，結(jié)果如表2，由表可見，高溫高壓水解對維生素B1的穩(wěn)定性沒有顯著性差異，認為其對維生素B1的定量分析沒有顯著影響。

表2 水解對維生素B1穩(wěn)定性的影響

3.4 方法驗證

3.4.1線性范圍和檢出限

準確吸取1 mL維生素B1標準儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容，搖勻配置成標準中間液，濃度為0.1166 mg/m L。再分別取維生素B1標準中間液25、50、100、150、200、250μL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，與試液同步衍生。結(jié)果見表3，維生素B1線性關(guān)系良好。以信噪比為3時的進樣質(zhì)量濃度為最低檢出質(zhì)量濃度，根據(jù)樣品前處理最終計算得出方法的檢出限為0.03 mg/100 g。

表3 峰面積、線性方程與相關(guān)系數(shù)

3.4.2兩種樣品前處理方法的回收率和精密度

選擇2個嬰幼兒配方乳粉作為基質(zhì)，分別添加3個濃度的標準溶液，采用兩種前處理方法處理后，標準工作液與試液同步衍生，對其回收率和精密度進行計算比較，結(jié)果見表4，樣品前處理方法一回收率在75.3%～88.1%之間，相對標準偏差RSD在1.27%～4.49%之間。樣品前處理方法二回收率在88.1%～97.3%之間，相對標準偏差RSD在1.08%～4.09%之間。比較發(fā)現(xiàn)樣品前處理方法二的回收率和精密度均優(yōu)于樣品前處理方法一。

3.4.3兩種樣品前處理方法測定實際樣品數(shù)據(jù)的對比

表4 兩種樣品前處理方法回收率和精密度（n=6）

表5 兩種前處理方式數(shù)據(jù)對比

選取5種不同品牌的嬰幼兒配方奶粉，樣品分別用兩種前處理方法進行處理，然后與標準工作液同步衍生，測定樣品中維生素B1的含量，5個樣品，連續(xù)測定3天，每次做2個平行樣品，見表5。結(jié)果顯示方法二的測定結(jié)果均高于方法一，且3天的重現(xiàn)性也要優(yōu)于方法一，該結(jié)果與回收率結(jié)果相符。分析原因認為，方法一中需要進行高溫高壓酸解同時結(jié)合酶解，該處理使得樣品中大量的蛋白質(zhì)分解成肽或氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)可能會吸附游離態(tài)的維生素B1或與其再次反應(yīng)結(jié)合，而雷濤[18]，王帥帥[19]指出，嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素主要來源于人為添加的，呈游離態(tài)，而本身含有的雖多為結(jié)合態(tài)，但含量極低。從而導致維生素B1損失，無法與堿性鐵氰化鉀進一步衍生產(chǎn)生硫色素，最終導致回收率偏低，測定結(jié)果低。因此認為，在使用方法一作為前處理方法時，應(yīng)同時做樣品加標回收和質(zhì)控樣品，在最終結(jié)果計算時應(yīng)結(jié)合考慮回收率和質(zhì)控樣品的值，確定是否需要折算回收率。

4 結(jié) 論

本實驗優(yōu)化了衍生劑的條件，即當取1 mL樣液或標準工作液進行衍生時，加1 mL衍生劑A進行衍生，衍生效率最高。同時比較了兩種方法的回收率和精密度，方法一的回收率在75.3%～88.1%之間，相對標準偏差為1.27%～4.49%。方法二的回收率在88.1%～97.3%，精密度在1.08%～4.09%之間，比較發(fā)現(xiàn)方法二在回收率和精密度上要優(yōu)于方法一，兩種方法均適用于嬰幼兒配方乳粉中維生素B1的測定。

前處理方法一是基于現(xiàn)有國家標準方法，其優(yōu)點在于適用范圍廣，可測定含淀粉類等幼兒配方食品，但是回收率低，因此認為在測定一批樣品時應(yīng)同時做質(zhì)控樣品和回收率，在計算結(jié)果時，應(yīng)考慮是否折算回收率，避免結(jié)果偏低。

前處理方法二的優(yōu)點是操作簡單，重現(xiàn)性好，且回收率高，測定結(jié)果更接近于真實值，適用于大批樣品的快速準確測定。其缺點為如果想測定含淀粉的樣品，還需要進一步優(yōu)化方法，添加淀粉酶酶解樣品，以釋放結(jié)合態(tài)的維生素B1。