梁 棟，陳 芳，張 良，胡小松*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京100083 2 國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心 北京100083）

芽孢是細(xì)菌在環(huán)境脅迫（如低溫、干旱和營養(yǎng)缺乏等）下形成的休眠體。因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性而對高溫、高壓、干燥、輻射、低溫、腐蝕性物質(zhì)等具有極強(qiáng)的抗性。如何將芽孢殺滅一直是食品殺菌領(lǐng)域亟待突破的關(guān)鍵問題[1]?，F(xiàn)階段殺滅芽孢主要是靠傳統(tǒng)的高溫、高壓的方法，然而高溫、高壓在殺滅芽孢的同時(shí)，也會引起食品營養(yǎng)流失，口感、風(fēng)味等品質(zhì)的嚴(yán)重下降。如何在常溫下殺滅芽孢一直是食品領(lǐng)域研究人員的一大挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)芽孢萌發(fā)后，其抗性消失，這也為殺滅芽孢提供了一個(gè)有效策略。如今，先萌發(fā)后殺滅是殺滅芽孢的一個(gè)最有效途徑[2]。

肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNac）通過β-1，4 糖苷鍵連接聚合而成。與MurNac 相連的依次是L-Ala，γ-Glu，m-Dpm 和D-Ala。革蘭氏陰性菌和陽性菌的主要區(qū)別在第3 個(gè)氨基酸，大多數(shù)陽性菌的第3 個(gè)氨基酸是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后產(chǎn)物[3]。研究表明，含有Dpm 的胞壁肽是一種有效的萌發(fā)劑，能促進(jìn)芽孢萌發(fā)。最小的有效結(jié)構(gòu)單元的胞壁肽為二糖三肽，其二聚體或三聚體依然能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)[4]?，F(xiàn)如今，國內(nèi)還沒有關(guān)于胞壁肽分離純化的報(bào)道，也沒有關(guān)于胞壁肽對芽孢萌發(fā)的影響研究。本文通過酶解等方法成功分離純化了胞壁肽，研究胞壁肽對于芽孢萌發(fā)的影響，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis 168），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.2 試驗(yàn)試劑

LB 液體培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；Bacterial Agar（BD）；α-淀粉酶、胰蛋白酶、變?nèi)芫兀徺I自美國Sigma 公司；其它試劑均為分析純。

1.3 儀器及設(shè)備

倒置熒光顯微鏡，德國蔡司公司；高效液相色譜，日本島津公司；超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國沃特世公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；傅里葉變換紅外光譜掃描儀，美國鉑金埃爾默公司；500 兆核磁共振譜儀，瑞士布魯克公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；均質(zhì)破碎儀，美國Fastprep-24；冷凍離心機(jī)，日本日立公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 枯草芽孢桿菌芽孢的制備[5]菌種先用LB瓊脂培養(yǎng)基活化3 代以上，接入2×SG 培養(yǎng)基中涂板培養(yǎng)。在37 ℃培養(yǎng)2 d 后，用相差顯微鏡鏡檢芽孢，當(dāng)視野中大部分芽孢從母細(xì)胞中脫落后，用冷的無菌去離子水將培養(yǎng)基上的芽孢清洗收集到離心管中，離心條件為8 000 g、4 ℃、10 min，離心數(shù)次。離心過程中保證全程在低溫條件中進(jìn)行。離心后除去上清液，獲得的芽孢沉淀重懸于ACES 緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）中，最后用相差顯微鏡鏡檢，視野中≥95%的芽孢呈現(xiàn)明亮狀方可使用。芽孢濃度約為1.0×108CFU/mL，存放于4 ℃冰箱，1個(gè)月內(nèi)使用。

1.4.2 芽孢平板計(jì)數(shù) 將芽孢懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，枯草芽孢桿菌芽孢采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行傾注平板計(jì)數(shù)，每個(gè)平板中加入1 mL 稀釋菌液?？莶菅挎邨U菌芽孢在37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h。殺菌效果用芽孢減少的對數(shù)表示：lg（Nt/N0），其中，Nt為處理后存活的菌落數(shù)，N0為處理前菌落總數(shù)。

1.4.3 芽孢萌發(fā)試驗(yàn) 吸取適量芽孢液于離心管中，加入適量萌發(fā)劑。放置在搖床中培養(yǎng)1 h （37℃，200 r/min）。之后將芽孢液放入80 ℃水浴中加熱20 min。平板計(jì)數(shù)計(jì)算芽孢萌發(fā)率。

1.4.4 肽聚糖的提取 采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）的細(xì)胞壁提取肽聚糖[6-7]。購買的菌種在液體培養(yǎng)基中活化3 代后使用。將枯草芽孢桿菌接種到LB 瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h。取新鮮單菌落接種到適量的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約1.0，離心收集菌體（8 000×g、4 ℃、10 min），用冷的無菌去離子水清洗2 次。將沉淀重新懸浮于8% SDS 溶液中，煮沸30 min，離心（13 000×g，15 min，25 ℃）收集沉淀，清洗數(shù)次直至除去殘留的SDS。SDS 處理除去了菌體的其它蛋白質(zhì)，非共價(jià)結(jié)合的脂蛋白和脂多糖。將沉淀溶于無菌去離子水中均質(zhì)破碎儀破碎細(xì)菌，不溶性細(xì)胞壁組分再通過離心收集（40 000×g，30 min，25℃）。收集的不溶性細(xì)胞壁進(jìn)一步用α-淀粉酶、胰蛋白酶進(jìn)行酶解，以除去細(xì)胞壁上的糖原、共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)。以上兩步酶解均在緩沖液中進(jìn)行（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），在胰蛋白酶中需要加入10 mmol/L CaCl2。將酶解液加入SDS（終質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）煮沸鈍化胰蛋白酶，并清洗除去SDS。將細(xì)胞壁重新懸浮于氫氟酸（5 mg 細(xì)胞壁懸浮于2 mL 48% HF）中，4 ℃處理48 h。HF 可以除去肽聚糖上磷酸二酯鍵共價(jià)連接的次生細(xì)胞壁多糖，包括磷壁酸、poly-（β，1-6 GlcNAc）等。細(xì)胞壁組分再分別采用8 mol/L LiCl 和0.1 mol/L EDTA 清洗，無菌水清洗2 次，最后采用丙酮除去脂磷壁酸和脂多糖。將樣品凍干，得到肽聚糖。

1.4.5 胞壁肽分離純化 將提取的肽聚糖懸浮于12.5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液 （1 mmol/L MgCl2，pH 6.0，0.02% 疊氮化鈉）中，加入5 μg/mL 變?nèi)芫兀?7 ℃酶解24 h。酶解的胞壁肽需要采用硼氫化鈉還原，防止Cl 的異構(gòu)化。將胞壁肽懸浮于100 mL 0.5 mol/L 的硼酸鹽緩沖液（pH 9.0）中。胞壁肽還原采用新鮮配制的25 mL，25 mg/mL NaBH4，在加入過程中使pH 保持在9.0。還原反應(yīng)在室溫中保持15 min 并不停地振蕩，加入H3PO4使反應(yīng)終止，將pH 調(diào)至4。所得樣品保存在-20℃。還原的胞壁肽采用HPLC （Shimadzu）分離，ODS 色譜柱 （Hypersil octadecylsilane column，250 mm×4.6 mm，顆粒：5 μm，30105-254630，Thermo Fisher Scientific）。洗脫液分別是：A，40 mmol/L 磷酸鈉（pH 4.5）；B，40 mmol/L 磷酸鈉（pH 4.0）并加入20%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇。A、B 流動相中加入0.00025%的疊氮化鈉。色譜柱平衡柱子采用流動相A，柱溫52 ℃，流速0.5 mL/min，平衡1 h。可溶性胞壁肽進(jìn)樣100 μL，進(jìn)樣5 min 后，洗脫程序?yàn)锽 流動相以線性梯度從0 到100%，時(shí)間為5 min到270 min，流動相流速保持在0.5 mL/min。胞壁肽組分檢測采用紫外檢測器，波長為206 nm[8-9]。

1.4.6 胞壁肽組分脫鹽[10]胞壁肽組分凍干后重新懸浮于無菌超純水中，采用HPLC 法進(jìn)行脫鹽，色譜柱為前述分離柱。柱子采用0.007%（體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸平衡，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，胞壁肽采用50%甲醇（0.0025%三氟乙酸）線性梯度（0～100%）洗脫，洗脫時(shí)間在30～50 min 之間，胞壁肽組分檢測采用紫外檢測器，波長為206 nm。

1.4.7 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜鑒定 脫鹽的胞壁肽組分采用三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Quattro Micro，Micromass）進(jìn)行鑒定。全掃描模式（MS Scan）質(zhì)譜條件：正離子（ESI+）數(shù)據(jù)采集模式產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+；m/z 掃描范圍100～2 000 u；毛細(xì)管電壓3.5 kV；錐孔電壓40 V；萃取電壓5.0 V；離子源溫度110 ℃；脫溶劑溫度450 ℃；脫溶劑氣650 L/h；錐孔反吹氣50 L/h；RF 透鏡電壓0.5 V。

1.4.8 紅外掃描光譜 采用壓片法將1.5 mg 凍干的GM-TriDAP 與200 mg 干燥的KBr 在瑪瑙研缽中混合研磨均勻，置于磨具中，用壓片機(jī)進(jìn)行壓片（壓力為20～30 MPa）1 min，取下后得到透明的樣品薄片，用傅里葉變換紅外譜儀進(jìn)行紅外光譜的掃描，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.4.91H NMR 將2 mg 凍干的GM-TriDAP 樣品溶于1 mL D2O 中，冷凍干燥并重復(fù)3 次將糖肽中的活潑H 置換，溶于0.5 mL D2O 中后置于核磁管中，核磁共振分析采用500 兆核磁共振譜儀，室溫20 ℃，500 MHz 作氫譜。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。繪圖使用Origin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞壁肽HPLC 分析

肽聚糖是由N-乙酰葡糖胺 （GlcNAc）、N-乙酰胞壁酸（MurNAc）及肽單元組成的聚合體，肽鏈氨基酸的組成主要是Ala、Glu、DAP，還有極少量的Gly，大多數(shù)G-及產(chǎn)孢菌具有meso-DAP 殘基。對枯草芽孢桿菌細(xì)胞壁的肽聚糖采用變?nèi)芫孛附?，其片段?jīng)硼氫化鈉還原后，采用HPLC 進(jìn)行胞壁肽的分離，得到胞壁肽譜圖（圖1）。從圖中可以看出，枯草芽孢桿菌的胞壁肽主要含有15 個(gè)胞壁肽組分，主要的峰8 個(gè)。肽聚糖經(jīng)過變?nèi)芫孛附夂?，形成以GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-meso-DAP 為基本結(jié)構(gòu)單元的二聚體、三聚體、四聚體等[3]。這些胞壁肽組分分子質(zhì)量越大，保留時(shí)間越長，因此，單體目標(biāo)峰出峰時(shí)間較早。Atrih 等[3]對枯草芽孢桿菌的胞壁肽進(jìn)行分析，得到38 個(gè)組分，在20 min 保留時(shí)間內(nèi)的前4 個(gè)組分均為胞壁肽單體，個(gè)別組分基團(tuán)出現(xiàn)酰胺化而保留時(shí)間不同。此結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

圖1 枯草芽孢桿菌的胞壁肽HPLC 色譜圖Fig.1 Peptidoglycan muropeptides from B.subtilis 168 separated by reversed-phase HPLC

2.2 胞壁肽ESI-MS 分析

對每個(gè)組分單峰收集，脫鹽后進(jìn)行ESI-MS分析，通過對3 號峰的MS 分析（圖2），其分子離子[M]+為m/z 869，伴峰：[M+H]+為m/z 870，該分子質(zhì)量組成與GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-GlumesoDAP（理論值：869.9）一致[11]，伴峰的形成是因?yàn)樵谡x子模式下，目的片段會在電離過程中加一個(gè)氫，分子質(zhì)量增加。因此，峰3 即為目標(biāo)物二糖三肽（GM-TriDAP），其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。

2.3 胞壁肽FTIR

圖2 胞壁肽峰3 的質(zhì)譜圖Fig.2 MS analysis of muropeptides 3

對胞壁肽3 號峰單峰收集，冷凍干燥后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，紅外光譜圖見圖3所示，從圖中可以看出，在2 個(gè)區(qū)域存在強(qiáng)吸收，一個(gè)是～3 447 cm-1，另一個(gè)是～1 020 cm-1。肽鏈的幾個(gè)特征帶包括酰胺A 帶（～3 500 cm-1）、酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺Ⅱ帶（1 510～1 580 cm-1）。酰胺A 帶主要是N-H 伸縮振動，對氫鍵非常敏感；酰胺Ⅰ帶是肽鏈的主要特征帶，主要是C=O和C-N 的伸縮振動；而酰胺Ⅱ帶主要是N-H 面內(nèi)變角振動，以及C-N 和C-C 的伸縮振動[12]。糖環(huán)的特征峰集中在800 cm-1～1 200 cm-1之間，包括C-OH 的伸縮振動和糖苷鍵C-O-C 的振動疊加吸收信號。峰3 的紅外光譜的吸收峰歸類見表1所示，從表中可以看出，胞壁肽3 號峰包涵糖肽的典型基團(tuán)振動特征，一個(gè)是肽鏈的酰胺吸收帶，包括3 447 cm-1的酰胺A 帶、1 647 cm-1的酰胺Ⅰ帶；另一個(gè)是在1 200～800 cm-1，1 020 cm-1是糖環(huán)以及糖苷鍵的特征吸收峰[8]。因此，胞壁肽3 號峰具有典型的糖肽結(jié)構(gòu)特征。

2.4 1H NMR

圖3 胞壁肽峰3 的FT-IR 譜圖Fig.3 FT-IR spectroscopy of muropeptides 3

表1 紅外譜的波數(shù)與基團(tuán)振動模式Table 1 Wave number and group vibration mode in infrared spectrum

氫譜是所有核磁共振譜中靈敏度最高的，可以為化合物提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。對胞壁肽3 號峰的結(jié)構(gòu)進(jìn)行氫譜分析，檢驗(yàn)其是否與GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mesoDAP 結(jié)構(gòu)相符。氫譜中各官能團(tuán)的化學(xué)特性主要體現(xiàn)在化學(xué)位移上，氫原子核外電子云密度越大，化學(xué)位移越小，出峰位置越靠近右方。1H NMR 譜見圖4所示，從圖中可以看到典型的胞壁肽信號模式，糖肽官能團(tuán)本身的性質(zhì)、取代基等都會對物質(zhì)的化學(xué)位移產(chǎn)生影響，從而改變官能團(tuán)出峰位置，糖環(huán)和肽鏈表現(xiàn)不同的化學(xué)位移[13]。在前人針對肽聚糖片段核磁分析的基礎(chǔ)上[14]，對胞壁肽3 號峰氫譜的化學(xué)位移進(jìn)行歸屬，GlcNAc、MurNAc 和肽鏈氨基殘基的典型信號介于4.7×10-6～3.3×10-6之間，4.67 是GlcNAc 異頭碳原子上的質(zhì)子共振信號；對于甲基和脂肪烴的亞甲基質(zhì)子化學(xué)位移介于2.5×10-6～1.1×10-6之間。綜合上述分析，胞壁肽峰3 的1H NMR 與目標(biāo)糖肽結(jié)構(gòu)相符。

2.5 胞壁肽對芽孢萌發(fā)的影響

芽孢萌發(fā)后熱抗性消失，濕熱處理（80 ℃，20 min）不能直接殺滅芽孢，但可將萌發(fā)的芽孢殺滅[15-16]。因此，熱抗性消失經(jīng)常用來表征芽孢是否經(jīng)歷了萌發(fā)[5]。為驗(yàn)證本文中得到的胞壁肽是否具有萌發(fā)效果，將制備的胞壁肽加入到枯草芽孢桿菌168 芽孢液中混合均勻（胞壁肽終質(zhì)量濃度為1 mg/mL），37 ℃振蕩孵育1 h。隨后，將胞壁肽處理后的芽孢進(jìn)行濕熱處理（80 ℃，20 min），利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算濕熱處理前后芽孢數(shù)量的變化即為萌發(fā)芽孢的數(shù)量。胞壁肽對枯草芽孢桿菌168 芽孢萌發(fā)的影響如圖5所示。未加入胞壁肽的處理組中，芽孢數(shù)經(jīng)濕熱處理后并未減少，說明芽孢仍保持原有的熱抗性，并未發(fā)生萌發(fā)過程。而加入胞壁肽后的芽孢經(jīng)濕熱處理后數(shù)量減少了0.9 個(gè)對數(shù)，說明0.9 個(gè)對數(shù)的芽孢在胞壁肽處理后熱抗性消失，發(fā)生了萌發(fā)，與前人研究結(jié)果相一致[17]。由此可知，本試驗(yàn)中制備的胞壁肽（二糖三肽）能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，為后續(xù)進(jìn)一步研究胞壁肽誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

圖4 胞壁肽峰3 的1H NMR 譜圖Fig.4 1H NMR spectrum of muropeptides 3

圖5 不同處理對枯草芽孢桿菌168 芽孢萌發(fā)的影響Fig.5 The effect of different treatments on the germination of B.subtilis 168 spores

3 結(jié)論

利用枯草芽孢桿菌為對象，制備、分離純化細(xì)菌營養(yǎng)體細(xì)胞壁上的胞壁肽，得到的胞壁肽最小單位為二糖三肽，此胞壁肽可以有效促進(jìn)芽孢萌發(fā)，為芽孢萌發(fā)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。