屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水的代謝作用

陳志娜，葉 韜，張慧宇，郭曉香，馬琳琳，李金鳳，張 萍，沈業(yè)橋，劉 天

（1 淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院 安徽淮南232038 2 資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安徽淮南232038）

黃漿水是豆腐加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，富含大豆異黃酮、蛋白質(zhì)和維生素P、K 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及大量水溶性的糖類，如水蘇糖、棉籽糖、蔗糖等[1-2]，通常被直接排放，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境[3]。黃漿水在貯藏的過(guò)程中可自然發(fā)酵為酸漿，是一種良好的豆腐凝固劑。與石膏、鹵水作為凝固劑的豆腐相比，酸漿豆腐質(zhì)地細(xì)膩、口感鮮嫩，深受人們喜愛(ài)[4]。然而，自然發(fā)酵酸漿中含有大量的乳酸菌、酵母及其它微生物，也包括一些有害微生物，如蠟樣芽孢桿菌[5]，造成酸漿質(zhì)量不穩(wěn)定，并對(duì)酸漿豆腐的安全性構(gòu)成威脅，從而限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

由于乳酸菌在酸漿形成過(guò)程中起主導(dǎo)作用，因此純種乳酸菌發(fā)酵制備酸漿成為趨勢(shì)。目前已有干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、解淀粉乳桿菌等[6-9]多種乳酸菌應(yīng)用于黃漿水發(fā)酵中。由于人體不能產(chǎn)生α-半乳糖苷酶，因此黃漿水中的主要低聚糖——水蘇糖和棉籽糖等不能被人體消化利用，在腸道中被細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)氣，導(dǎo)致胃腸脹氣[10]。研究表明有些乳酸菌，如鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等具有α-半乳糖苷酶活性，在發(fā)酵的過(guò)程中可利用大豆低聚糖緩解脹氣[11]。另外，在乳酸菌發(fā)酵黃漿水的過(guò)程中，在β-葡萄糖苷酶的作用下，糖苷形式的大豆異黃酮可以轉(zhuǎn)化為更易吸收的游離型苷元大豆異黃酮[12]，從而提高發(fā)酵黃漿水的抗氧化活性[13]。

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于乳酸菌的一種，是腸道內(nèi)的正常菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品[14]、泡菜[15]、豆醬[16]等發(fā)酵食品中，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強(qiáng)等特點(diǎn)，以及抑制病原菌、增強(qiáng)免疫力等作用[17-18]。課題組前期從泡菜中篩選出1 株屎腸球菌E.faecium R2[19]，該菌株可利用豆腐黃漿水中的低聚糖生長(zhǎng)產(chǎn)酸，無(wú)需補(bǔ)充碳源和其它營(yíng)養(yǎng)素即可達(dá)到豆腐凝固劑所需的酸度。采用該菌種純種發(fā)酵制備酸漿可有效降低大腸桿菌等的污染[20]，既解決了自然發(fā)酵酸漿中微生物雜亂的問(wèn)題，提高了酸漿豆腐的安全性，又可降低生產(chǎn)成本，具有廣泛的應(yīng)用前景。為了更好地了解屎腸球菌R2 對(duì)豆腐黃漿水的發(fā)酵特性，本研究采用HPLC 法對(duì)屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中的低聚糖、有機(jī)酸以及大豆異黃酮的組分和含量進(jìn)行測(cè)定與分析，監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的變化規(guī)律，并對(duì)發(fā)酵黃漿水的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，揭示屎腸球菌R2 的發(fā)酵功能特性，以期為屎腸球菌R2 的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌E.faecium R2，CGMCC No.14944（專利保藏菌種），保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，由淮南師范學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室提供；食品級(jí)黃豆購(gòu)于淮南蘇果超市；黃漿水，實(shí)驗(yàn)室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Trolox、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黃豆黃素、大豆黃素苷、草酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、果糖、葡萄糖、棉籽糖、水蘇糖、蔗糖等標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司；乙睛（色譜純）、乙酸（色譜純），天津科密歐化化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；對(duì)硝基苯酚、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，阿拉丁生化科技股份有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

MRS 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫-80 1 mL，121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

黃漿水培養(yǎng)基：將100 mL 黃漿水加入到250 mL 錐形瓶中，密封后121 ℃滅菌15 min，冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250-A 生化培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；LDZW-60KCS-ll 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械；T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；5804R 型離心機(jī)，Eppendorf 公司；KQ-400B型超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司；HPLC2998 高效液相色譜，Waters 公司；250 mm×4.6 mm 5 μm 氨 基 柱、250 mm×4.6 mm 5 μm Thermo C18 柱，Aglient 公司。

1.3 方法

1.3.1 黃漿水的制備 以傳統(tǒng)工藝制作的鹵水黃漿水作為初級(jí)黃漿水，初級(jí)黃漿水接種屎腸球菌發(fā)酵劑（接種量3%）發(fā)酵36 h 制得一代酸漿。以一代酸漿做為凝固劑制得二級(jí)豆腐黃漿水，再接種屎腸球菌發(fā)酵劑（接種量3%）發(fā)酵36 h 制得二代酸漿。以二代酸漿做凝固劑制得三級(jí)豆腐黃漿水，如此循環(huán)三代后消除原鹵鹽凝固劑的影響，試驗(yàn)采用三代以后酸漿點(diǎn)制豆腐過(guò)程中所產(chǎn)生的黃漿水[21]。

1.3.2 樣品制備 將活化后的屎腸球菌R2 按3%接種量接入新鮮豆腐黃漿水培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)，獲得發(fā)酵0，12，24，36 h 的樣品，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的屎腸球菌R2 生物量和pH 的變化趨勢(shì)。樣品經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后供后續(xù)分析使用。

1.3.3 HPLC 測(cè)定大豆低聚糖 色譜柱：Aglient氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：70%乙腈-30%水（蔗糖、果糖、葡萄糖），68%乙腈-32%水（棉籽糖、水蘇糖）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。大豆低聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。

表1 大豆低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 The standard curves of soybean oligosaccharides

1.3.4 HPLC 測(cè)定有機(jī)酸 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq （250 mm×4.6 mm，5 μm）；Thermo C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：10 mmol/L 磷酸氫二鉀 （用磷酸調(diào)pH 為2.55）；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)：210 nm。有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表2。

1.3.5 HPLC 測(cè)定大豆異黃酮 色譜柱：Thermo C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A：0.1%乙酸乙腈溶液，B：0.1%乙酸溶液；流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長(zhǎng)：260 nm。梯度洗脫條件按照GB/T 26625-2011。大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表3。

表2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 The standard curves of organic acids

表3 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 The standard curves of soybean isoflavones

1.3.6 酶的定位及活性測(cè)定

1）粗酶液的制備 將屎腸球菌R2 以3%接種量接種到黃漿水培養(yǎng)基中，于37 ℃下靜置培養(yǎng)，分別于12，24，36 h 取發(fā)酵液。發(fā)酵液于4 ℃下5 000 r/min 離心10 min，得菌液上清及沉淀；菌體沉淀用生理鹽水洗滌2 次后，懸浮于2 mL、pH=5.0 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，超聲功率130 W，破碎時(shí)間15 min，間隔時(shí)間2 s。破碎后于4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min，得菌體碎片和破碎上清；菌體碎片用5 mL、pH=5.0 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗滌2 次后溶于1 mL pH=5.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖液中用作酶活測(cè)定，菌液上清、破碎上清直接進(jìn)行酶活測(cè)定[22]。

2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取0.1391 g 對(duì)硝基苯酚，精確到0.001 g，用0.2 mol/L 碳酸鈉溶液定容至100 mL，4 ℃下保存?zhèn)溆?。依次移取?duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液1，2，3，4，5，7，9 mL，用0.2 mol/L 碳酸鈉溶液定容至100 mL，配成濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9 mmol/L 的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

吸取1 mL 對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入1 mL pH=5.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖液；對(duì)照的空白試管中加入2 mL pH=5.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖液；在所有的試管中加入8 mL 0.2 mol/L 碳酸鈉溶液，振蕩，在400 nm 處測(cè)定吸光值。以對(duì)硝基苯酚含量為X 軸、吸光值為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.642X+0.006，R2=0.999。

3）酶活測(cè)定 將粗酶液、10 mmol/L 對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液和10 mmol/L 對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液分別于37 ℃水浴中預(yù)熱10 min。然后吸取0.4 mL 粗酶液于干凈的試管中，分別加入0.4 mL 對(duì)硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液或10 mmol/L 對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，破碎上清和破碎沉淀酶活測(cè)定以緩沖液代替粗酶液作為空白對(duì)照，菌液上清酶活測(cè)定以加熱使酶失活的上清液作為空白對(duì)照，于37 ℃中水浴10 min 后，加入3.2 mL 0.2 mol/L 碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，待冷卻至室溫后，將反應(yīng)液于400 nm 處測(cè)定吸光值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中菌液上清、破碎上清和破碎沉淀中的α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活力[22]。

酶活力單位定義：在37 ℃，pH 5.0 條件下，1 min 催化生成1 nmol 對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1 個(gè)酶活單位（U）。

1.3.7 對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定 參考劉力[13]的方法略有修改，取2.0 mL 0.05 g/L DPPH 無(wú)水乙醇溶液，加入2.0 mL 發(fā)酵液，搖勻，置于25 ℃水浴中避光反應(yīng)30 min 后，于8 000 r/min 下離心10 min，期間注意避光。在517 nm 處測(cè)定吸光度值。蒸餾水作為對(duì)照，Trolox 作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=-0.0285X+0.8299，R2=0.9907，結(jié)果以μg Trolox/mL 表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS18.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（One-way ANOVA），利用Duncan’s multiple range test 方法進(jìn)行顯著性分析，選取P<0.05 為顯著水平。采用OriginPro8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中酸度的變化

豆腐黃漿水中含有小分子糖類、蛋白質(zhì)及一些生物活性物質(zhì)，適于微生物的生長(zhǎng)，pH 值可以反映屎腸球菌R2 發(fā)酵黃漿水后形成的游離H+和有機(jī)酸的變化情況。圖1為屎腸球菌R2 發(fā)酵黃漿水過(guò)程中OD 值和pH 的變化規(guī)律。從圖1中可以看出，屎腸球菌R2 能夠利用豆腐黃漿水中的小分子糖類生長(zhǎng)，降低黃漿水的pH 值。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)量逐漸增加，pH 值逐漸下降，其中12～24 h 之間菌體生長(zhǎng)最快，pH 下降最明顯。

2.2 發(fā)酵處理對(duì)豆腐黃漿水中低聚糖含量的影響

圖2為屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中低聚糖含量的變化規(guī)律。新鮮豆腐黃漿水中5 種糖的含量為19 418.22 mg/L，其中水蘇糖和蔗糖含量較高，水蘇糖含量占5 種糖含量的58%，蔗糖含量占5 種糖含量的30%，棉籽糖、葡萄糖和果糖的含量相對(duì)較低。在屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿水的過(guò)程中，低聚糖含量均有不同程度的下降。發(fā)酵12 h 后，葡萄糖的含量迅速下降，利用率達(dá)到43%，其次為棉籽糖和果糖，利用率均為17%，水蘇糖和蔗糖的利用率較低，分別為4%和3%；發(fā)酵24 h 后葡萄糖基本利用完畢，無(wú)法檢出。此時(shí)，果糖的利用率達(dá)到68%，棉籽糖的利用率達(dá)到22%，水蘇糖和蔗糖的利用率均為12%。表明屎腸球菌R2 在發(fā)酵豆腐黃漿水時(shí)優(yōu)先利用葡萄糖，其次為果糖和棉籽糖；發(fā)酵36 h 后，果糖的含量幾乎沒(méi)有發(fā)生變化（P<0.05），蔗糖的利用率達(dá)到31%，棉籽糖和水蘇糖的利用率分別為38%和24%。因此，經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2 的發(fā)酵作用，可以有效地緩解棉籽糖和水蘇糖引起的胃脹氣。

圖1 屎腸球菌R2 發(fā)酵黃漿水過(guò)程中pH和OD 值的變化規(guī)律Fig.1 Changes of pH and OD values in fermented tofu whey （FTW）during the fermentation with E.faecium R2

圖2 屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中低聚糖含量的變化Fig.2 Changes of oligosaccharides in FTW during the fermentation with E.faecium R2

圖3 屎腸球菌R2 不同部位的α-半乳糖苷酶活性Fig.3 α-galactosidase activity of different fractions in E.faecium R2

2.3 屎腸球菌R2 α-半乳糖苷酶的定位及活性分析

棉籽糖和水蘇糖的代謝需要α-半乳糖苷酶，研究表明，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lact.casei）、植物乳桿菌（Lact.plantarum）、發(fā)酵乳桿菌（Lact.fermentum）、短乳桿菌（Lact.s brevis）、布氏乳桿菌（Lact.buchneri）、腸膜明串株菌（Leuconostoc mesenteroides）和羅伊氏乳桿菌（Lact.reuteri）等[23-26]在發(fā)酵的過(guò)程中可以分泌α-半乳糖酶，將α-半乳糖苷類寡糖水解為可消化的糖類。屎腸球菌R2 不同部位的α-半乳糖苷酶酶活見(jiàn)圖3。如圖3所示，菌液上清酶活幾乎為零，說(shuō)明α-半乳糖苷酶沒(méi)有被分泌到細(xì)胞外，屎腸球菌R2 的α-半乳糖苷酶不是胞外酶；細(xì)胞破碎并離心后，細(xì)胞破碎上清和破碎沉淀均具有酶活，說(shuō)明屎腸球菌R2 的α-半乳糖苷酶屬于胞內(nèi)酶；細(xì)胞破碎沉淀酶活顯著高于破碎上清酶活，說(shuō)明該酶以可溶性蛋白和不可溶性蛋白兩種形式存在，且主要以不可溶性蛋白形式為主。這一結(jié)果與Ames 等[27]的研究一致，其研究表明大多數(shù)α-半乳糖苷酶位于G+陽(yáng)性菌細(xì)胞質(zhì)中。Mital 等[28]研究證明乳酸菌所產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶類的活性范圍在pH 4.5～8.0，而屎腸球菌R2 發(fā)酵36 h后pH 下降到3.58（圖1），嚴(yán)重偏離了該酶的最適pH，這導(dǎo)致了豆腐黃漿水中棉籽糖和水蘇糖被部分分解（圖2），而不是被全部降解，這一結(jié)果與付亭亭等[29]的研究一致。

2.4 發(fā)酵處理對(duì)豆腐黃漿水中有機(jī)酸含量的影響

表4顯示了屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中乳酸、醋酸、酒石酸等9 種有機(jī)酸的變化。結(jié)果表明，在新鮮豆腐黃漿水中丁二酸含量最高，檸檬酸含量次之，接下來(lái)為醋酸、酒石酸、蘋(píng)果酸和乳酸，馬來(lái)酸和富馬酸含量很低，草酸含量最低，未檢出。

經(jīng)屎腸球菌R2 的發(fā)酵后，豆腐黃漿水中的有機(jī)酸總量有了大幅度的升高，這與發(fā)酵過(guò)程中黃漿水中的pH 值的下降規(guī)律一致。從表4中可以看出，發(fā)酵過(guò)程中乳酸的量增幅最大，由99.60 mg/L 增加到2 678.88 mg/L，提高了27 倍；其次是醋酸由950.26 mg/L 增加到1 210.91 mg/L；馬來(lái)酸的含量稍有增加，富馬酸的含量呈現(xiàn)先升高隨后降低的趨勢(shì)。酒石酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸的含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中逐漸降低，丁二酸的含量稍有波動(dòng)。

表4 屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿水過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化（mg/L）Table 4 Changes of organic acids in FTW during the fermentation with E.faecium R2 （mg/L）

2.5 發(fā)酵處理對(duì)豆腐黃漿水中大豆異黃酮組成和含量的影響

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)中形成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、改善婦女更年期綜合征等多種功效[30]。大豆異黃酮共有12 種異構(gòu)體，以游離型黃酮苷元（Aglycones）和結(jié)合型糖苷（Glycosides）2 種形式存在。苷元型大豆異黃酮主要包括染料木素（Genistein）、黃豆黃素（Glycitein）和大豆苷元（Daidzein）；糖苷型大豆異黃酮主要包括染料木苷（Genistin）、大豆黃素苷（Glycitin）、大豆苷（Daidzin）以及它們各自的乙?；咸烟擒蘸捅Ｆ咸烟擒昭苌颷31]。天然存在的大豆異黃酮主要以結(jié)合型β-葡萄糖苷的形式存在，這種形式的大豆異黃酮較難被人體吸收；游離苷元型大豆異黃酮不僅具有更高的生物活性，而且更容易被腸道吸收[13]。

研究了屎腸球菌R2 的發(fā)酵作用對(duì)豆腐黃漿水中染料木苷、大豆黃素苷、大豆苷、染料木素、大豆苷元及黃豆黃素含量的影響，結(jié)果如圖4所示。在新鮮豆腐黃漿水中大豆異黃酮總量為245.17 mg/L，其中糖苷型大豆異黃酮含量為175.12 mg/L，這與賀云[31]的結(jié)果一致，即大部分大豆異黃酮以結(jié)合型糖苷的形式存在。

新鮮豆腐黃漿水經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2 的發(fā)酵作用后，其大豆異黃酮組分的存在形式及含量都發(fā)生了變化。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，糖苷型大豆異黃酮含量逐漸降低，苷元型大豆異黃酮含量明顯升高，這表明屎腸球菌R2 能夠促進(jìn)糖苷型大豆異黃酮向苷元型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化。發(fā)酵36 h 后，低活性糖苷型異黃酮含量顯著減少（P<0.05），其含量下降到23.40 mg/L；其中大豆苷和染料木苷在發(fā)酵24 h 后含量為零，全部轉(zhuǎn)化，而大豆黃素苷的含量變化相對(duì)較?。煌瑫r(shí)，游離型苷元異黃酮的含量顯著增加（P<0.05），由70.05 mg/L增加到115.21 mg/L；其中大豆苷元含量由25.43 mg/L 增加至43.17 mg/L，染料木素含量由24.90 mg/L 增加至50.16 mg/L，黃豆黃素含量由19.72 mg/L 增加至21.88 mg/L。

發(fā)酵24 h 后染料木苷和大豆苷已被完全轉(zhuǎn)化，但是24 h 后染料木素和大豆苷元的含量仍在增加（P<0.05），說(shuō)明還存在丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷，當(dāng)原有的染料木苷和大豆苷消耗完以后，這兩種丙二酰葡萄糖苷轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的β-葡萄糖苷后又繼續(xù)向苷元型異黃酮轉(zhuǎn)化[32]。另外，經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2 的發(fā)酵作用，大豆異黃酮總量由245.17 mg/L 下降到 138.60 mg/L，可能是因?yàn)榇蠖管辙D(zhuǎn)化成大豆苷元后，在屎腸球菌R2 的作用下又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成雌馬酚。雌馬酚是大豆異黃酮重要的代謝終產(chǎn)物，由大豆苷元在腸道菌的作用下經(jīng)特異性代謝得到，具有較異黃酮前體更高的生物活性，且性質(zhì)穩(wěn)定，容易被人體吸收[33]。姜雪[34]從女性體內(nèi)篩選出1 株可以轉(zhuǎn)化大豆苷元生成雌馬酚的腸道菌屎腸球菌HY-1。因此，屎腸球菌R2很可能也具有將大豆苷元轉(zhuǎn)化成雌馬酚的能力。

2.6 屎腸球菌R2 β-葡萄糖苷酶的定位及活性分析

研究表明乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中可促進(jìn)豆腐黃漿中糖苷型大豆異黃酮向游離苷元型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化，這主要是β-葡萄糖苷酶的酶解作用[30]。對(duì)屎腸球菌R2 發(fā)酵過(guò)程中不同部位的β-葡萄糖苷酶酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，可知屎腸球菌R2 具有β-葡萄糖苷酶酶活，且不同部位的酶活具有顯著差異（P<0.05）。菌體上清中的β-葡萄糖苷酶酶活幾乎為零，破碎沉淀酶活顯著高于破碎上清酶活，說(shuō)明屎腸球菌R2 的β-葡萄糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，且主要以不可溶性蛋白形式為主。這一結(jié)果與張哲[35]的研究一致，其研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌的β-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，主要為處于細(xì)胞膜上的不可溶性酶，還有少量存在于原生質(zhì)體內(nèi)細(xì)胞液中的可溶性酶。由圖5可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，β-葡萄糖苷酶的酶活先增加后稍有下降，在發(fā)酵24 h 時(shí)達(dá)到最大。

圖4 屎腸球菌R2 發(fā)酵對(duì)豆腐黃漿水中大豆異黃酮含量的影響Fig.4 Changes of isoflavones in FTW during the fermentation with E.faecium R2

圖5 屎腸球菌R2 不同部位的β-葡萄糖苷酶活性Fig.5 β-glucosidase activity of different fractions in E.faecium R2

2.7 發(fā)酵處理對(duì)豆腐黃漿水清除DPPH 自由基能力的影響

大豆異黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化活性，經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵作用，糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型大豆異黃酮，抗氧化活性會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)[13]。圖6為發(fā)酵黃漿水DPPH 自由基的清除能力，由圖6可以看出，屎腸球菌R2 發(fā)酵豆腐黃漿可顯著提高其清除DPPH 自由基的能力，發(fā)酵36 h 后，黃漿水DPPH 自由基的清除能力由14.20 μg Trolox/mL 增加到55.25 μg Trolox/mL。

圖6 發(fā)酵黃漿水DPPH 自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activities in FTW by E.faecium R2

使用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)大豆異黃酮轉(zhuǎn)化與DPPH 自由基清除能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表5所示。結(jié)果顯示，游離型苷元大豆異黃酮大豆苷元和染料木素的含量與DPPH 自由基清除能力呈顯著正相關(guān)（P<0.05），并且染料木素的含量與DPPH 自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），同時(shí)，糖苷型大豆異黃酮大豆苷和染料木苷的含量與DPPH 自由基清除能力呈顯著負(fù)相關(guān) （P<0.05），而大豆黃素苷和黃豆黃素與DPPH 自由基清除能力之間不相關(guān)（P<0.05）。說(shuō)明屎腸球菌R2發(fā)酵過(guò)程中DPPH 自由基清除能力的提高確實(shí)與大豆異黃酮的生物轉(zhuǎn)化有關(guān)，且主要因?yàn)槿玖夏舅睾痛蠖管赵康脑黾印?/p>

表5 大豆異黃酮生物轉(zhuǎn)化與DPPH 自由基清除能力的相關(guān)性Table 5 Pearson correlation coefficients between soybean isoflavone biotransformation and DPPH radical scavenging activities

3 結(jié)論

對(duì)屎腸球菌R2 發(fā)酵作用對(duì)豆腐黃漿水中低聚糖、有機(jī)酸和大豆低聚糖含量以及DPPH 清除能力的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，屎腸球菌R2可以產(chǎn)生α-半乳糖苷酶以利用豆腐黃漿水中的碳水化合物生長(zhǎng)產(chǎn)酸，可以有效地降解棉籽糖和水蘇糖，產(chǎn)生大量的乳酸、醋酸等有機(jī)酸，最終使pH 下降到3.6 以下；同時(shí)，屎腸球菌R2 還可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶將活性低的糖苷型大豆異黃酮（主要為大豆苷和染料木苷）轉(zhuǎn)化為高活性游離型苷元大豆異黃酮，進(jìn)而顯著提高了黃漿水清除DPPH 自由基的能力。對(duì)α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了初步定位，結(jié)果表明兩種酶均屬于胞內(nèi)酶，且主要為不可溶性蛋白酶，但是兩種酶的確切位置及酶活特性還需進(jìn)一步研究；另外，經(jīng)過(guò)屎腸球菌R2 的發(fā)酵作用，所測(cè)的大豆異黃酮總量有所下降，因此，在發(fā)酵的過(guò)程中大豆苷元很可能繼續(xù)轉(zhuǎn)化為大豆異黃酮代謝終產(chǎn)物雌馬酚，其具體的代謝機(jī)理仍需進(jìn)一步探討。