葛婉寧 鐘敏 張柳笛

0 引言

近年來，除心臟移植之外，心室輔助裝置(ventricular assist device，VAD)成為臨床上治療心力衰竭的重要手段[1]。但是在VAD使用過程中，由于非生理性剪切應力(non-physiological shear stress，NPSS)造成血液機械損傷，引起一系列臨床并發(fā)癥，主要包括創(chuàng)傷性溶血和血栓的形成[2-4]。經(jīng)過近幾十年對VAD的研發(fā)與改進，溶血和血栓問題已經(jīng)得到重大改善。然而，近年來，VAD在臨床使用上的消化道出血問題開始引起越來越多的關注[5]，VAD植入1年后的出血發(fā)生率可高達65%。一些研究發(fā)現(xiàn)，VAD中NPSS對血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的機械損傷是引發(fā)臨床上出血癥狀的主要因素[6-9]。然而由于血液成分vWF的機械損傷現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)和研究較晚，至今仍然定義模糊且缺乏相關的評價標準,非常不利于VAD的創(chuàng)新設計與發(fā)展。

vWF是一種在正常凝血過程中發(fā)揮重要作用的血漿糖蛋白，分子量較大，最小單體片段為500 kDa，高分子量部分可以超過10 000 kDa[10-12]。與vWF相關的評價參數(shù)主要包括高分子量血管性血友病因子(high molecular weight von Willebrand factor,HMW-vWF)的減少量、vWF抗原總含量、以及表征vWF抗原活性的vWF瑞斯托霉素輔因子活性和 vWF膠原結(jié)合活性[13]。其中HMW-vWF的損傷測試(vWF多聚體分析實驗)可以最直觀地反映vWF多聚體分子量分布狀況，是評價VAD對vWF損傷的首選測試方法。HMW-vWF多聚體是決定vWF功能的重要部分，當血管破裂時，大量血小板會以HMW-vWF為中介，粘附在膠原纖維上形成血栓得以止血。NPSS對于HMW-vWF多聚體的降解，會直接破壞凝血機制，引發(fā)凝血功能異常并導致不同程度的出血事件[14-17]。然而，由于vWF分子量較大，沒有合適的內(nèi)參蛋白作為實驗參照，也沒有相應分子量的蛋白質(zhì)分子量標準品來對應實驗結(jié)果。除此之外，vWF多聚體分析實驗的操作步驟復雜、影響因素眾多、實驗成本也較高，目前僅有極少數(shù)的實驗室可常規(guī)檢測，所使用設備和方法也不盡相同，給研究VAD中NPSS對于血液成分vWF機械損傷的影響規(guī)律造成困難，不利于VAD的創(chuàng)新設計和改進，因此合理設計vWF損傷的評價實驗并優(yōu)化實驗方法十分必要。

本文針對VAD對vWF機械損傷這一臨床問題，給出在NPSS環(huán)境下，血液成分HMW-vWF損傷程度的測試方法，為制定VAD中NPSS對血液成分vWF機械損傷的標準提供參考，使得VAD 領域內(nèi)對具有臨床意義的標準化實驗方法形成共識，促進VAD的創(chuàng)新設計和改進。

1 研究方法

首先采用人血作為基礎血樣，通過將測得的vWF高、中、低分子量的灰度值比值與文獻中實際數(shù)值做對比，驗證實驗方法的可行性。然后采用該方法，對經(jīng)過血泵BPX-80剪切之后的豬血樣本進行測試，以研究VAD對血液成分HWM-vWF的損傷情況，驗證方法的有效性。其中剪切血樣是利用標準化血泵體外檢測平臺制備的，該平臺之前主要用于體外溶血測試，本研究成功將其應用擴展到對于vWF機械損傷的測試中[18]。

1.1 儀器與試劑

實驗儀器包括美國Bio-Rad公司的制膠器(1704412，15 cm×10 cm)、電泳槽(Mini-Sub Cell GT,18 cm×40.5 cm×9.4 cm/1 L/3.0 cm)和轉(zhuǎn)印槽(Criterion Blotter,12 cm×16 cm×18 cm/450 mL)，以及北京六一儀器廠的雙穩(wěn)定時電泳儀電源(DYY-6C)。

使用試劑包括一抗(polyclonal rabbit anti-human von Willebrand factor，DAKO，美國)、二抗(anti-rabbit IgG HRP-linked antibody，Cell Signaling Technology，美國)、ECL發(fā)光液底液(Cell Signaling Technology，美國)、瓊脂糖(Sigma-Aldrich，美國)、十二基硫酸鈉(SDS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國)、10×Tris-乙酸-EDTA電泳緩沖液(TAE，海利克思，美國)、10×TBS緩沖液(海利克思，美國)、Tris-甘氨酸電泳緩沖液(海利克思，美國)、Tris-HCl緩沖液(海利克思，美國)、甘油(安諾倫生物科技有限公司，中國)、溴酚藍(上海滬試實驗室器材股份有限公司，中國)、Tween 20(上海碧云天生物技術有限公司，中國)、無水甲醇(上海滬試實驗室器材股份有限公司，中國)、脫脂奶粉(北京索萊寶科技有限公司，中國)、顯影液和定影液(上海源葉生物科技有限公司，中國)。

1.2 實驗方法及步驟

實驗使用免疫印跡法將電泳分離后的vWF分子從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體聚偏氟乙烯膜(PVDF，Immobilon-P)上，然后用特異性抗體檢測膜上vWF多聚體的分子量分布情況。整個過程一般需要3 d，主要步驟包括制膠、電泳、轉(zhuǎn)印、免疫反應和顯色5部分[19-23]。

1.2.1 測試樣品的制備

人血為蘇州大學唐仲英血液中心志愿者捐獻，豬血從蘇州大學動物實驗中心取得，取血過程由專業(yè)人員進行操作，均已通過蘇州大學倫理委員會批準。

為了制備血泵剪切血樣，根據(jù)ISO和美國材料實驗協(xié)會(American Socienty of Test Materials,ASTM)標準明確測試血液的選用標準，搭建標準化血泵體外檢測平臺[24-26]。實驗用血采自體溫正常、無明顯疾病特征的豬，采血時按照 1∶20 的比例加入 0.4% 的肝素溶液抗凝。整個回路包括一根總長為 2 m，內(nèi)徑為 9.5 mm 的聚氯乙烯軟管，一個儲血袋，一個流量探頭，壓力傳感器，螺旋夾和一臺待測試離心式血泵 BPX-80。在血液灌輸過程中注意用孔徑為 74 μm 的濾網(wǎng)過濾之后通過重力作用灌輸?shù)饺鐖D1所示的回路中[25]。

圖1 標準化循環(huán)回路示意圖Figure 1 Schematic diagram of standardized circulation loop

開啟血泵，將其調(diào)整到待測試的實驗條件。其中泵的流量設定為(2±0.25)L/min，壓力設定為(110±3)mmHg，循環(huán)血液溫度為(37±1)℃。測試周期為5 h，在血泵循環(huán)5 min 后采集第1個血樣，之后每隔1 h 采集1次，共計6個血樣。每次采集3 mL血樣，將血液樣本在4 000 r/min，10 min的參數(shù)下兩次離心得到待測血漿樣本，記錄時間和編號，并置于-80℃冰箱保存留用。

1.2.2 制膠

將0.3 g瓊脂糖粉末用50 mL電泳緩沖液(40 mmol/L Tris-乙酸,pH 7.8,0.1% SDS,1 mmol/L EDTA)混勻，微波爐中加熱至溶液澄清透明，然后將冷卻至55℃的瓊脂糖溶液從一側(cè)緩慢均勻倒入制膠器，插入梳子，待膠凝固后放入4℃冰箱30 min。

1.2.3 電泳

將解凍后的血漿樣本在4℃下14 000 r/min離心15 min，再用上樣緩沖液(65.8 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8,2.1% SDS,26.3%甘油，0.01%溴酚藍)按1∶20稀釋。每個加樣槽上樣量為10 μL。將電泳槽置于4℃冰箱中，30 mA恒定電流下運行30 min后提高到50 mA，直到指示劑遷移到另一端，總過程約3.5 h。

1.2.4 轉(zhuǎn)印

從冰箱中取出提前配置好的轉(zhuǎn)印緩沖液(2.5 mmol/L Tris,19.2 mmol/L甘氨酸,20%無水甲醇,0.01% SDS,pH 8.8)，將電泳完的膠浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡15 min。為了活化 PVDF上面的正電基團，使它更易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，要提前將剪好的PVDF膜用甲醇浸泡1 min，純水沖洗后浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中留用。同時要保證膜上無油脂類物質(zhì)，以免影響蛋白結(jié)合和抗體雜交。在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸濕支撐保護PVDF膜和凝膠的黑色海綿和濾紙(美國BIO-RAD公司)，按照膠夾安裝順序組裝完成，將膠夾放置在轉(zhuǎn)印槽中，PVDF膜的一側(cè)朝向轉(zhuǎn)印槽的陽極，凝膠則朝向轉(zhuǎn)印槽陰極。向槽中添加轉(zhuǎn)印緩沖液至刻度線，置于4℃冰箱中，在70 mA的恒定電流下過夜(運行約15～17 h)。

1.2.5 vWF多聚體的免疫反應

將轉(zhuǎn)印完的PVDF膜浸入40 mL封閉液(5%的脫脂奶粉，0.1% Tween 20，TBS緩沖液)1 h，室溫置于搖床上緩慢搖晃。使用0.1% TBS-T(0.1% Tween 20，TBS緩沖液)洗膜5次，先沖洗1次，再置于搖床上洗4次，每次10 min。再分別將一抗、二抗用抗體稀釋液(即封閉液)按1∶4 000和1∶2 000稀釋，室溫下孵育PVDF膜各1 h，0.1% TBS-T洗膜5次，方法同上。最后使用TBS洗液洗膜一次(置于搖床上10 min)以去除Tween的影響。

1.2.6 vWF多聚體的呈像與分析

采用化學發(fā)光法(ECL)，提前按照說明配制好ECL發(fā)光液，保證發(fā)光液能夠全面覆蓋PVDF膜。在工作臺上鋪一張保鮮膜，倒上ECL發(fā)光液，再將PVDF膜倒扣在上面反應1 min。將膜上多余的液體吸干，轉(zhuǎn)移到在X光片夾中用保鮮膜包裹。在暗室紅燈下剪裁3張比膜的長和寬均大1 cm的 X光膠片蓋在膜上，壓緊曝光過夜。

曝光完成后，取出X光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2 min(20～25℃)，溫度過低時(低于16℃)需適當延長顯影時間。顯影結(jié)束后，用純水沖掉X光片上的顯影液，迅速浸入定影液中，定影時間一般為5～10 min，以膠片透明為止。在室溫下晾干膠片，放置在觀片臺上用相機拍照或掃描至電腦中。將所得圖片導入ImageJ 軟件，選中需要分析的樣品區(qū)域，得到膠片選中區(qū)域的圖像灰度，該灰度值即與此區(qū)域中vWF含量成正比。將每個樣品的灰度值與初始樣品的灰度值作比較即可得出HMW-vWF的降解程度，從而分析得出在NPSS環(huán)境下，血液成分HMW-vWF的機械損傷情況。

2 實驗結(jié)果

為了確保實驗方法的通用性，作者進行了多次重復性實驗，本文僅選取了一組具有代表性的圖片進行展示。

2.1 健康人血樣本測試結(jié)果

圖2即為所得的健康人血樣本vWF分子量分布圖像，條帶清晰完整且容易區(qū)分，從下往上，條帶中vWF多聚體的分子量依次升高。參照文獻[27]中的vWF多聚體條帶-分子量對照圖，對圖2中的條帶進行分區(qū)，其中低分子量區(qū)域為條帶1-2，對應分子量為500～2 500 kDa；高分子量區(qū)域為條帶8以上，分子量大于5 500 kDa；介于兩區(qū)域之間的條帶3-7為中分子量區(qū)域，對應分子量為3 000～5 000 kDa。從圖中可以看出，高分子量、中分子量、低分子量區(qū)域可以很容易地區(qū)分開，便于使用ImageJ軟件進行樣品之間的定量分析比較。將圖像與文獻[18,19,28]中健康人血vWF的實際數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果基本一致，證明了該方法的可行性。

圖2 健康人血樣本vWF分子量分布Figure 2 Molecular weight distribution of vWF in healthy human blood sample

2.2 機械損傷前后豬血樣本測試結(jié)果

使用免疫印跡法對經(jīng)BPX-80血泵剪切前后的樣本進行測試，圖3中1通道對應BPX-80運行5 min采集的第一個血樣，2-6通道分別對應5 h測試周期中，每隔1 h 采樣的測試結(jié)果，由圖中可以看出經(jīng)血泵剪切之后的樣本與健康人血樣本一樣，條帶清晰完整，通過ImageJ軟件得出不同通道高分子量區(qū)域的灰度值，將1-6通道的灰度值與1通道的灰度值做比較即可得出HMW-vWF的剩余量(圖4)，分析出在NPSS環(huán)境下，血液成分HMW-vWF的機械損傷情況。

圖3 BPX-80剪切血樣中vWF多聚體條帶分布圖Figure 3 Distribution of vWF multimer for BPX-80 sheared

圖4中灰度值比值隨時間呈下降趨勢，這表明在血泵運行期間，高剪切應力會造成血液成分HMW-vWF的降解，使得HMW-vWF被剪切應力破壞成為小分子，失去凝血功能。另外，從圖4還可以看出，灰度值比值在初始1 h內(nèi)下降較多(14%)，后續(xù)趨于穩(wěn)定，至實驗結(jié)束損失量一直維持在20% 左右。該數(shù)值的大小代表了HMW-vWF受高剪切應力影響的降解量，可以用來衡量研發(fā)中的血泵對vWF的損傷程度，進而評估血泵的性能，保證血泵的有效性和安全性。由于本研究的主要目的是探討vWF機械損傷測試方法的建立，因此課題組主要關注血泵剪切樣品的相對損傷程度，這個方法最直觀，后續(xù)還會進行vWF活性測定，以和本方法相互驗證。

圖4 各時間點樣品中高分子量vWF與0時刻樣品比值Figure 4 The ratio of HMW-vWF at each time point to the initial point

3 討論

3.1 測試血泵和血樣的討論

3.1.1 測試血泵的討論

目前，國際上很多新型血泵的研發(fā)中，常采用美國Medtronic公司的BPX-80和美國Abbott公司的CentriMag血泵來作為對照泵[23,29]。這兩種泵都是技術較為成熟、性能穩(wěn)定的體外離心泵，其中BPX-80是目前國內(nèi)唯一能買到的商品化心室輔助裝置，因此課題組選用BPX-80進行vWF損傷的研究。

在之前的研究中，BPX-80主要用于ASTM標準化體外溶血實驗的對照泵，本研究成功將其應用到對vWF機械損傷的研究中，為后續(xù)更多相關實驗，如vWF抗原總含量測定、vWF膠原結(jié)合活性測定等奠定基礎。

3.1.2 測試血樣的討論

在血樣的制備過程中，為了確保采樣的準確性，需要舍棄采樣口附近的2 mL血樣。冰凍保存的樣本須注意避免反復凍融，反復凍融過程中產(chǎn)生的機械剪切力將對樣本中的蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生破壞作用，從而得出假陽性結(jié)果。此外，融化樣本的混勻過程亦應注意，不要劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。

3.2 電泳和轉(zhuǎn)印方案的討論

電泳是現(xiàn)在用于分離和純化生物大分子最常用的技術。轉(zhuǎn)印過程是將待測分子轉(zhuǎn)移到固相載體上，在轉(zhuǎn)印膠夾組裝過程中，按照膠夾安裝順序：黑色海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-黑色海綿，逐層鋪在膠夾中，注意趕走氣泡。需保證兩張濾紙的長、寬分別比膠小，而膜的長、寬分別比膠大，避免上下兩層濾紙因為過大而相互接觸引起短路，影響轉(zhuǎn)印的完整性。

需要注意的是，在電泳和轉(zhuǎn)印的通電過程中，系統(tǒng)產(chǎn)熱使溫度升高，如果實驗時間很長容易燒膠，因此整個實驗通電過程在 4℃ 冰箱中進行。

3.3 vWF多聚體呈像方法的討論

免疫印跡的檢測方法分為熒光檢測法和化學發(fā)光檢測法，而熒光檢測法又可分為可見紅外檢測和近紅外熒光檢測。其中可見紅外檢測已經(jīng)被證實有很高的自發(fā)熒光，會降低檢測的靈敏度。近紅外熒光檢測背景較低，可以提高檢測的靈敏度，再結(jié)合其信號穩(wěn)定、定量準確、動態(tài)范圍廣等特點，已經(jīng)成為國內(nèi)外很多蛋白質(zhì)研究者的主流選擇?；瘜W發(fā)光檢測法是通過酶標記的抗體和底物發(fā)生酶促動力學反應，然后利用暗室壓片或者化學發(fā)光成像儀進行檢測。

在實驗探索的過程中，作者嘗試使用近紅外熒光檢測法和化學發(fā)光檢測法兩種方法進行vWF多聚體的呈像對比。其中熒光成像技術采用Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)，依靠Image Studio軟件進行數(shù)據(jù)分析?；瘜W發(fā)光成像使用ECL發(fā)光液，在暗室中進行壓片，根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。在整個實驗過程中，近紅外熒光檢測法和化學發(fā)光檢測法都需要制膠、電泳、轉(zhuǎn)印、封閉和免疫反應這些操作步驟。其差別在于在免疫反應過程中抗體的標記物不同，近紅外熒光檢測法使用熒光標記抗體，而化學發(fā)光檢測法則使用酶標記抗體。

通過對比兩種檢測方法的實驗結(jié)果，近紅外熒光檢測法所得到的圖像背景較高，條帶不清晰，后續(xù)分析計算比較困難。另外Odyssey近紅外熒光成像設備價格昂貴，后期需要定期維護，并且需要購買特定熒光標記的二抗。而化學發(fā)光檢測法所得的實驗結(jié)果達到預期效果，并且該方法受實驗條件的限制較少，只要設置一個暗室即可進行，因此在之后的實驗過程中課題組沒有繼續(xù)探索完善近紅外熒光檢測法，而是選用化學發(fā)光法來實現(xiàn)vWF多聚體的呈像，如果后續(xù)實驗需要，課題組將會做進一步的研究。對于沒有條件購買紅外設備的實驗室，建議采用化學發(fā)光法，價格低廉的同時完全滿足測試分析要求。

4 結(jié)論

本研究采用健康人血作為基礎血樣驗證了免疫印跡法檢測vWF機械損傷的有效性?；谠摲椒ù罱ǖ臋z測平臺也成功定量檢測出了BPX-80血泵剪切對豬血中vWF的損傷情況。該檢測方法可用于對VAD的血液相容性評價，對于保證其安全性和有效性具有重要意義。文中明晰了實驗方法和操作細節(jié)，希望供VAD研發(fā)和評價測試人員參考。