程斯婷 趙以軍 廖明軍

（湖北工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院河湖生態(tài)修復及藻類利用湖北省重點實驗室，湖北武漢 430068）

1 引言

浮游細菌是水生態(tài)系統(tǒng)中的次級生產(chǎn)力，在浮游微生物食物網(wǎng)中扮演不可或缺的角色［1］。浮游病毒是水生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的一種生物，能裂解宿主、控制宿主數(shù)量以及調(diào)節(jié)宿主的群落結(jié)構組成，介導基因的水平轉(zhuǎn)移，對于種群的遺傳物質(zhì)、生態(tài)系統(tǒng)功能以及生物地球化學循環(huán)都有重要影響［2］。因此，對浮游細菌和病毒的準確快速計數(shù)對于研究水生生態(tài)學非常重要。目前，使用較多的計數(shù)方法有熒光顯微鏡計數(shù)法（EFM）和流式細胞儀計數(shù)法（FCM）等，前者對水樣保存條件要求簡單，可在-20 ℃保存2 周以上［3-4］，計數(shù)結(jié)果準確率較高，但是計數(shù)所需時間較長，效率相對較低；后者計數(shù)快速，準確性高，廣泛應用于生物細胞、浮游植物、細菌和病毒［5-8］。盡管FCM結(jié)果明顯，但樣品保藏不當極易造成計數(shù)結(jié)果誤差偏大，甚至造成結(jié)果偏低50%～80%［9］。目前FCM 計數(shù)樣品保藏多采用Brussaard 等人提出的方法［9］，即新鮮樣品添加終濃度為0.5%的戊二醛固定15～30 min 后，在液氮下速凍，然后放入-80 ℃冰箱長期保存。Brussaard 等人證實-80 ℃低溫保藏前的液氮速凍能夠保證所有被測樣品計數(shù)結(jié)果的穩(wěn)定性，但其結(jié)果也同時顯示在沒有液氮前處理的情況下，仍然有部分比例的樣品（3/7）經(jīng)-80 ℃長期保藏而計數(shù)結(jié)果沒有明顯下降［9］。這提示適用于FCM 的病毒樣品保藏方法還有進一步細化探討的空間，不同環(huán)境來源的樣品所適用的保藏條件可進一步研究確定，特別是對于保藏條件受限的野外樣品而言，研究合適有效的保存條件對于確保實驗結(jié)果的可靠性至關重要。

本文以三峽水庫香溪河庫灣水樣為檢測對象，以EFM 為參照，研究了改變樣品保存溫度情況下利用FCM 計數(shù)浮游病毒和浮游細菌的可能性，為豐富淡水浮游微生物計數(shù)方法提供支持。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與保存方法

2019 年2 月25 日至2019 年3 月19 日期間采集了香溪河庫灣的表層水樣（XK：110°47′32.4″E，31°07′21.3″N；SY：110°45′41.5″E，30°58′2.1″N；XY：110°46′3.4″E，30°57′36.1″N；00：110°46′25.9″E，30°58′43.1″N；01：110°46′26.5″E，31°00′4.6″N；02：110°45′44.6″E，31°01′29.7″N；03：110°45′41.5″E，31°03′19.3″N；04：110°45′43.1″E，31°03′32.9″N；06：110°47′26.5″E，31°08′2.6″N；07：110°46′50.3″E，31°09′23.6″N；08：110°46′54.9″E，31°10′12.1″N）。

樣品采集后添加戊二醛至終濃度為0.5%進行固定，并迅速放入-20 ℃暫存2 周，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃長期保存，計數(shù)前將樣品于37 ℃下解凍。

2.2 主要儀器和試劑

儀器：生物顯微鏡（Leica DM4000B）；流式細胞儀（BD FACSCaliburTMFlow Cytometer）。

試劑：SYBR Gold、SYBR Green I、PBS、對苯二胺、甘油、Tris EDTA 緩沖液、鞘液。

2.3 方法

使用流式細胞儀對浮游細菌和病毒的計數(shù)操作方法如下［10］：由于流式細胞儀檢測樣品適宜豐度為105～106個/mL，檢測浮游細菌豐度的樣品可不經(jīng)過稀釋，檢測浮游病毒豐度的樣品需適當稀釋。對于浮游細菌的檢測，黑暗下加入SYBR Green I 至終濃度為1 ∶100 00，在40 ℃的水浴鍋中避光加熱10 min，待冷卻至室溫時上樣于流式細胞儀中檢測。檢測浮游病毒時，用經(jīng)過0.02 μm 過濾器的Tris EDTA 緩沖液（pH 約為8.0）對樣品進行稀釋（稀釋倍數(shù)為10 或50 倍），稀釋后添加SYBR Green I 至終濃度為1 ∶200 00，在水浴鍋中80 ℃下避光加熱10 min，待其冷卻至室溫時上樣檢測。

使用熒光顯微鏡對浮游細菌和病毒的計數(shù)操作方法如下［11］：取適當稀釋的樣品1 mL，加入熒光染料SYBR Gold（終濃度為0.25%），避光染色15 min后用孔徑為0.02 μm、直徑為13 mm 的氧化鋁濾膜（Whatman Anodisc）過濾，然后向濾膜上滴加1 滴抗褪色劑（1∶1 體積比甘油-PBS 溶液中添加0.1%質(zhì)量含量對苯二胺配置而成），制片后在10×100 倍的油鏡下利用藍色激發(fā)光觀察，根據(jù)熒光強度、顆粒大小區(qū)分細菌與病毒，隨機計數(shù)5 個視野中不同顆粒的數(shù)量，計數(shù)結(jié)果取平均值后根據(jù)稀釋倍數(shù)、視野面積、過濾面積計算浮游細菌與病毒的豐度，計算公式如下：

式中，A 為浮游細菌或病毒的豐度，個/mL；n 為單個顯微視野中浮游細菌或病毒的平均數(shù)量，個；Sm為濾膜面積，mm2；Sf為顯微視野面積，mm2；d為計數(shù)樣品的稀釋倍數(shù)，倍。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析方法

采用SPSS V.21 統(tǒng)計分析軟件，針對樣品中浮游細菌與病毒豐度的EFM 和FCM 檢測數(shù)據(jù)，利用Wilcoxon signed-rank 檢驗方法來觀察2 種方法的計數(shù)有無差異，P＜0.05 時差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

分別用熒光顯微鏡和流式細胞儀計數(shù)浮游細菌和病毒豐度，結(jié)果見表1。

表1 EFM 與FCM 計數(shù)浮游細菌和病毒豐度結(jié)果 個/mL

由表1 可知，EFM 與FCM 計數(shù)的浮游細菌豐度分別為（0.08～2.19）×106個/mL 和（0.16～4.10）×106個/mL，均值分別為（0.98±0.10）×106個/mL 和（0.85±0.13）×106個/mL；EFM 與FCM 計數(shù)的浮游病毒豐度分別為（0.13～3.04）×107個/mL 和（0.04～6.02）×107個/mL，均值分別為（1.09±0.16）×107個/mL 和（2.40±0.37）×107個/mL。

2 種方法對浮游細菌計數(shù)的Wilcoxon signedrank 檢驗結(jié)果中，Z=-1.842，P=0.065，認為FCM 與EFM 對于香溪河水樣中浮游細菌的計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義；而對浮游病毒計數(shù)的Wilcoxon signed-rank檢驗結(jié)果中Z=-4.704，P=0.000，認為FCM 與EFM對于香溪河浮游病毒的計數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義，表明用FCM 進行香溪河水樣中浮游病毒的計數(shù)結(jié)果比EFM 顯著偏高，具體見表2。

表2 EFM 與FCM 分別對浮游細菌和病毒計數(shù)的Wilcoxon 檢驗結(jié)果

利用Pearson 相關性分析可知，EFM 和FCM 法對病毒的計數(shù)結(jié)果具有極顯著正相關性（r=0.979，P＜0.01），見表3。

表3 EFM 與FCM 計數(shù)浮游病毒的Pearson 相關系數(shù)

4 討論

EFM 和FCM 用于計數(shù)香溪河樣品中浮游細菌豐度時結(jié)果相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2 種計數(shù)方法使用的染料對染色效率的差異影響不大，SYBR Green Ⅰ與SYBR Gold 染色效率大致相同［12］。有研究顯示，SYBR Green Ⅰ在FCM 中相比SYBR Gold 更具有優(yōu)勢，但在顯微鏡下長時間激發(fā)會在亮度和持續(xù)熒光方面有不利影響［4］。另外，多數(shù)細菌粒徑處于正常范圍內(nèi)，熒光信號較強，易辨認，使2 種方法的計數(shù)細菌豐度結(jié)果沒有顯著差異。誤差存在的主要原因可能來源于操作者造成的差異［13］，因為天然水樣中浮游細菌群落較復雜，熒光顆粒大小與強弱的界限不夠明晰，存在部分粒徑較小熒光微弱的細菌顆粒，導致計數(shù)偏差，人為計數(shù)差異一般在5%～20%內(nèi)［14］。

對香溪河樣品中浮游病毒計數(shù)時，EFM 和FCM計數(shù)的結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)CM 計數(shù)結(jié)果高于EFM（P＜0.01）。不同計數(shù)病毒的方法之間具有差異，通常有一種方法會產(chǎn)生較高病毒豐度的結(jié)果［15］。以往研究中檢測自然水體的病毒豐度會出現(xiàn)FCM計數(shù)相對EFM 偏高的結(jié)果，如Marie 等［16］對自然水體如地中海和太平洋水樣的病毒計數(shù)結(jié)果顯示，F(xiàn)CM 計數(shù)相較于EFM 計數(shù)高達1.5 倍；Chen 等［17］對沿海和湖泊水樣的病毒計數(shù)結(jié)果顯示，F(xiàn)CM 比EFM 計數(shù)高達1.3 倍。本研究中FCM 計數(shù)病毒豐度比EFM 高0.2～3.1 倍（平均值為2.0±0.1 倍），與上述研究基本接近，說明本研究中FCM 計數(shù)結(jié)果可信。FCM 計數(shù)病毒豐度顯著高于EFM，可從2 個角度解釋原因：一是在EFM 中利用顯微鏡照片計數(shù)時，由于病毒未處于完全相同的焦點平面下，可能會存在失焦的病毒不可見導致計數(shù)偏低［4］；二是FCM 計數(shù)中在添加染料SYBR Green I 后于80 ℃的高溫下加熱，熱處理可能會令病毒衣殼變性使染料滲透，染色的病毒百分比增加［16］。對FCM 和EFM 的病毒計數(shù)結(jié)果分析顯示，兩者具有強正相關性，表明FCM 能夠穩(wěn)定計數(shù)溫和冷凍香溪河庫灣樣品中的浮游病毒。

本研究中樣品采用溫和冷凍的方式保存，沒有用到液氮速凍，但FCM 計數(shù)結(jié)果并未出現(xiàn)病毒豐度下降50%～80%的現(xiàn)象［9］。這表明在FCM 計數(shù)浮游病毒方法中，液氮速凍并非所有環(huán)境樣品保存的必須條件，這對條件有限的實驗室開展浮游病毒研究意義重大。

5 結(jié)論

FCM 與EFM 計數(shù)溫和冷凍香溪河樣品中浮游細菌豐度的結(jié)果沒有顯著差異；FCM 計數(shù)溫和冷凍香溪河樣品中浮游病毒豐度的結(jié)果比EFM 獲得的結(jié)果高2.0±0.1 倍，并未出現(xiàn)病毒豐度下降50%～80%的現(xiàn)象。上述結(jié)果證實，F(xiàn)CM 計數(shù)溫和冷凍香溪河樣品中浮游細菌和浮游病毒豐度結(jié)果可靠，液氮冷凍并非FCM 計數(shù)浮游病毒和浮游細菌豐度的必須條件。研究結(jié)果拓寬了利用FCM 計數(shù)香溪河浮游微生物的環(huán)境條件范圍。