分子標記輔助選育甘藍型油菜抗草甘膦除草劑恢復系

史慧芹，肖 麓

(青海大學，青海省農林科學院，青海省春油菜遺傳改良重點實驗室，國家油菜改良中心，青海分中心農業(yè)部春油菜科學觀測實驗站，青海省春油菜研究開發(fā)中心，青海 西寧 810016)

油菜是中國重要的油料作物，是油脂、蛋白質飼料及工業(yè)原料來源之一，具有生長適應性強、用途廣、經濟價值高等特點[1]。由于油菜栽培方式的變化與除草劑的廣泛使用，導致油菜田間雜草問題日趨嚴重[2]。據報道，我國每年有50%～80%的油菜種植面積發(fā)生雜草危害，可造成15%～20%的產量損失[3]。田間除草方式分為勞動力成本高的人工中耕除草和快速高效防控草害的化學除草劑除草[4]。但由于種植田經常出現單子葉與雙子葉類雜草混生，對除草劑的劑量及噴施時間的把控要求嚴格，難以達到預期的除草效果，導致全世界的農作物每年減產10%左右[5]。因此，對抗廣譜性除草劑油菜品種的培育有著重要的現實意義。

目前，草甘膦(Glyphosate，N-磷酸基甲基甘氨酸)是滅生型除草劑之一[6]，具有高效、低毒、低殘留、無污染以及雜草不易產生抗性的特點，且不影響后茬作物生長等優(yōu)良性能[7]。閆睿智等[8]以抗草甘膦品系RH和3份恢復系6275、7-5、5200R為親本材料進行一次雜交、三次回交、兩次自交和兩次背景選擇，使得雜交種獲得抗除草劑特性。周心童等[9]利用一年多代回交轉育技術，將EPSPS基因轉入5個常規(guī)親本中，從而獲得穩(wěn)定的含有抗性基因的新品系材料。利用一年多代快速回交轉育技術向轉EPSPS基因油菜新品種進行的選育，如果配合草甘膦共同使用，有助于遏制雜草危害、降低環(huán)境污染，表現出經濟性、環(huán)境友好性的優(yōu)點，可為抗草甘膦油菜新品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體親本 以含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因的油菜品系甲HX6作為供體親本(華中農業(yè)大學提供)。

1.1.2 輪回親本 選用青海大學農林科學院春油菜所提供的兩份優(yōu)良的甘藍型油菜恢復系(1704、3660)作為輪回親本。其中1704為特早熟春性甘藍型油菜品系，3660為特晚熟春性甘藍型油菜品系，兩份材料均為非轉基因材料。

1.2 雜交及回交方法

2018年6月，采用甲HX6與1704、3660分別進行雜交，獲得F1。2019年1月，將F1分別與各自的輪回親本進行回交，得到BC1F1世代。2019年采用目標基因特異性引物分析BC1F1群體，選擇在目標位點表現為雜合型且遺傳背景與輪回親本相似度高的單株繼續(xù)與1704、3660進行回交，獲得BC2F1世代。2020年采用相同的方法獲得BC3F1世代。

1.3 DNA提取及除草劑抗性基因的分子標記檢測

采用CTAB法[10]提取親本以及春性甘藍型油菜轉育后代的葉片基因組DNA。參考文獻[11]方法檢測抗性基因I.variabilis-EPSPS*。該引物用于檢測油菜轉化體的特異性，將其命名為MEPSPS。上游引物序列：5′-ATACGCTCCCACATCCTGTC-3′，下游引物序列：5′-ATTAGCGCTAGGGACGTGAG-3′。

滑動網格方法是對邊界修正方法的一個補充，改進算法對稠密區(qū)域進行邊界修正，僅僅確定了聚類的邊界，而對于沒有相鄰稠密單元的低密度網格單元，其中的數據點會被作為孤立點處理，使得聚類的準確性降低。該方法采用滑動網格的思想，搜索沒有鄰近稠密網格的稀疏網格單元，對可以組成田字格的網格單元做進一步劃分，將新劃分的網格沿特定方向滑動，盡可能尋回稀疏區(qū)域的稠密網格。具體方法為計算各網格的矢量坐標以及網格滑動的方向矢量其中c為0田字格中所有網格的公共頂點，gi為網格ui的重心，計算公式如下：

針對這些不可避免的自然因素對檔案的影響，就要建立起以預防為主，修繕為輔的檔案保護模式，應建立起專門的檔案庫房館并使用相關的合理設備。該館的溫度、濕度等都要符合檔案的保存條件，而且該館在建造時，應采用節(jié)能、環(huán)保的材料，要重點注意庫房的防火、防水，防空氣污染、防有害生物等情況，從而建立一個良好的檔案保存環(huán)境。對電子檔案來說，要以預防信息泄露和保障信息安全為主，建立起覆蓋各層次的網絡環(huán)境。同時，要對毀壞性的檔案進行修補，包括檔案去污和對檔案館進行驅蟲滅菌等，合理的檔案預防和修補技術能有效保護檔案的安全。

PCR體系：0.25 mmol/L 10×Buffer 2μL，2 mmol/L dNTPs 1.6 μL，1UTaq酶 0.2 μL，0.5 mol/L上、下游引物各1 μL，60 ng模板DNA 2 μL，加ddH2O至20 μL。循環(huán)程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)共34組；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，無毒核酸染料(4s Red Plus Nucleic Acid Stain)染色，在凝膠圖像成像儀(Universal Hood Ⅱ)觀察照相。

1.4 除草劑的抗性檢測

對上述3份親本材料進行PCR驗證后，將抗性單株甲HX6與春性甘藍型油菜恢復系(1704和3660)進行雜交，再回交轉育獲得BC3F1代。在傳代進程中，分別對不同世代的材料進行分子標記輔助試樣，選擇篩選出含有抗性基因的單株(圖2)，保證抗性基因在傳代進程中不會丟失。

綜上所述,對玻璃體視網膜疾病患者實施玻璃體切除術有利于促進傷口愈合,視力恢復,臨床效果理想,值得臨床應用與推廣。

1.5 遺傳背景檢測

取親本及各BC世代的轉基因回交材料約2 cm2大小的嫩葉送至武漢基諾賽克公司進行遺傳背景分析。遺傳背景回復率的計算[12]公式：G(g)=[L+X(g)]/(2L)=1/2+(1/2)(X(g)/L)， 式中：G(g)代表g代遺傳背景回復率；X(g)指回交g代表現為輪回親本帶型分子標記數量；L指選擇條件下所采用所有分子標記數量，計算時假設各標記位點間獨立。

2 結果與分析

2.1 I.variabilis-EPSPS*抗性基因的PCR鑒定

BC1_3660共培育成苗80株，對其全部展開背景回復率檢測(表3)，群體背景回復率51.16%～86.36%，均值75.24%(>75%)，單株遺傳背景和輪回親本最高相似度達86.36%。以同樣的方法獲得BC2F1代、BC3F1代(背景回復率正在進行測試)。

在人工氣候室內待油菜長出5～6片真葉時，采用小型手動噴霧器噴施1次90 mg/L 41%農達異丙胺鹽制劑，保證每單株用藥量在3 mL左右。在噴施處理前、后的1～4周內觀察并調查其抗性。

2.2 噴藥篩選抗性材料

為了快速得到背景回復率結果，將BC1_1704和BC1_3660所有材料的葉片送至武漢基諾塞克公司進行背景回復率分析。BC1_1704共成苗70株，群體背景回復率62.00%～83.82%，平均背景回復率72.27%(<75%)。由表2可知，部分單株的背景回復率達到75%的標準，但往往還是有部分不滿足此標準，回交群體回復為輪回親本基因型往往會出現一些偏離。結合前面PCR抗性基因檢測結果，選擇背景回復率高的5個單株進一步與輪回親本回交獲得BC2F1代。由于背景回復率試驗花費時間較長，先對BC2F1代進行前景選擇，選擇含有抗性基因且生長勢較好的單株與輪回親本1704品系進行回交獲得BC3F1代(背景回復率正在進行測試)。

2.3 背景分析

提取BC1F1群體DNA，展開背景回復率分析?；诿總€位點的測序數據，分析各目標位點的基因型，統(tǒng)計發(fā)現，群體中需要檢測的基因型共有33 790個，最終獲得了有效數據(Depth≥30)的基因型比例為94.55%，平均測序深度為4 011.70倍。

表1 目標位點在部分樣品中的測序深度統(tǒng)計表

運用90 mg/L 草甘膦溶液，單株受藥量3 mL，對回交后代予以充分噴藥，對植株進行抗藥性觀察，發(fā)現7～9 d后，不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因的單株出現中心葉片顏色泛黃，并逐漸外擴，15～20 d 后整株死亡。含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因單株不受影響，生長良好。以1704為輪回親本所獲得的BC1F1代(簡稱BC1_1704)共培育出70株，待成株后全面噴施除草劑，20 d后清點成活率，發(fā)現共30個單株成活，占比42.86%。檢測發(fā)現單株均含I.variabilis-EPSPS*抗性基因；其余40個單株全部死亡，經檢測這些單株均不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因；以1704為輪回親本獲得的BC2F1代(之后稱為BC2_1704)共成苗50株，其中32株正常存活，經檢測這些單株均含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因，其余單株死亡。以3660品系為輪回親本獲得的BC1F1代(之后稱為BC1_3660)共成苗80株，除草劑噴施后46株(57.5%)能夠正常存活，在3660品系，含有抗性基因的單株共46株，經檢測這些單株均含有I.variabilis-EPSPS*抗性基因；以3660品系為輪回親本獲得的BC2F1代(之后稱為BC2_3660)成苗60株，噴施除草劑后有15株生長正常；檢測死去單株，發(fā)現均不含I.variabilis-EPSPS*抗性基因(圖3)。

表2 BC1_1704背景回復率統(tǒng)計表

選用目標基因特異性引物對本研究中采用的3份親本材料進行擴增，甲HX6中擴增得到了片段大小為732 bp的目標片段；而特早熟(1704)與特晚熟(3660)甘藍型油菜中均未擴增出732 bp的目標條帶(圖1)。經過分析表明，I.variabilis-EPSPS*基因已成功轉入甲HX6品系中。

甘肅省農業(yè)科學院蔬菜研究所副所長張玉鑫介紹說，武威地區(qū)全年降水量102-200毫米，蒸發(fā)量卻在2000毫米以上，這是其土壤嚴重干旱缺水的重要原因。十幾年來，在當地農業(yè)部門的大力支持引導下，設施農業(yè)蓬勃發(fā)展，尤其是依托當地日照資源發(fā)展的日光大棚，為農戶帶來了可觀的收入，此時的大漠已是欣欣向榮。據統(tǒng)計，武威日光溫室和塑料大棚面積已達到17.2萬畝，其中，日光溫室就占到了14.1萬畝，是甘肅重要的蔬菜產區(qū)。但同我國其他省份一樣，由于多年來肥料的不合理使用，武威地區(qū)土壤板結嚴重，瓜果蔬菜品質逐年下降，農戶們看在眼里，急在心上。

表3 BC1_3660背景回復率統(tǒng)計表

表3(續(xù))

3 討論與結論

(1)目前，I.variabilis-EPSPS*基因是控制油菜草甘膦抗性的一個重要基因?？共莞熟⒂筒耸侵袊茝V范圍最廣的一類抗性油菜品種，但由于我國尚未批準轉基因油菜的種植，導致了轉基因作物種質資源匱乏，近年來對抗性作物的轉育已成為重要的研究目標[14-15]。而雜交轉育是作物遺傳育種的基本方法，可以利用不同的親本配制雜交組合，在分離后代中定向選育，獲得不同性狀聚合的新品種[16]。本研究利用李杰華等[17]所提供的甲HX6含I.variabilis-EPSPS*抗性基因的單株，與特早熟與特晚熟甘藍型油菜品系1704、3660進行雜交轉育，最終獲得含有抗性基因的特早熟與特晚熟春性甘藍型油菜恢復系。

4.2 各地年降水量在20世紀60年代中期和80年代末出現異常偏多，夏季降水量異常對全年降水異常的貢獻最大。

(2)草甘膦是通過莖葉傳導組織傳遞至植物全株，促進雜草死亡的一類內吸傳導型除草劑。但在植物幼嫩期無效，這是由于幼嫩期葉面小、運輸組織不發(fā)達。生長旺盛的植物其傳導組織完善，葉面積較大，利用草甘膦能達到顯著的除草效果[1]。根據柳寒等[1]對擬南芥苗期、苔期抗性研究結果顯示，草甘膦直接噴至植物生殖器官，阻礙其發(fā)育。為有效發(fā)揮除草劑的作用，就要求選對噴灑時間，在作物苗期進行噴灑效果較好。本研究以此為參照，選擇各輪回世代的苗期進行噴施，不會對作物產量產生影響。對不同試驗材料噴施除草劑，噴施濃度參照李杰華等[17]研究的濃度參數，利用90 mg/L的41%農達異丙胺鹽制劑進行噴施，在噴施后7～10 d內，植株產生輕微藥害反應，此類單株中多數在分子檢測時均有抗性基因存在；在噴施后15～20 d內，非抗性單株全部死亡。

(3)在原向陽等[18]、袁權等[19]研究中均發(fā)現噴施草甘膦后，植株葉片中葉綠素含量出現不同程度的降低。光合強度的大小直接取決于葉綠素含量的高低，噴施草甘膦后，導致葉片的光合作用降低，間接影響各器官內的干物質含量。本研究可以直接觀測到噴施過草甘膦的葉片顏色比未噴施過草甘膦的葉片顏色淺，在今后的研究中，將對草甘膦與葉綠素含量的相關性進行驗證。