吳鎖柱，王妍，郭紅媛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合形成的二肽化合物，以還原型和氧化型兩種形態(tài)廣泛存在于動(dòng)植物體中［1］。還原型谷胱甘肽具有重要的生理功能，如清除自由基、解毒、維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、參與氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的用途，也可用于食品工業(yè)食品品質(zhì)的改善，如防止果蔬類食品褐變、強(qiáng)化肉制品風(fēng)味、改善面制品面團(tuán)的流變特性等［1，2］。因此，探索建立一種簡單、靈敏、準(zhǔn)確的還原型谷胱甘肽檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，谷胱甘肽的檢測方法主要有酶循環(huán)法［1］、熒光法［3～6］、高效液相色譜法［7，8］、高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法［9，10］等，這些檢測方法雖然靈敏度較高，但存在試劑成本高、儀器設(shè)備昂貴、檢測步驟繁瑣、對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求較高等缺陷。與上述檢測方法相比，比色法是一種實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡單、快速、儀器設(shè)備簡單的谷胱甘肽測定方法［11～17］。

黃瓜是一種深受大眾喜愛的蔬菜，其營養(yǎng)成分豐富。黃瓜中的還原型谷胱甘肽是一種天然的抗氧化成分，可以清除人體內(nèi)的自由基，也可以保護(hù)體內(nèi)含巰基的蛋白質(zhì)和酶分子發(fā)揮正常的生理功能，有益于人體健康。黃瓜中還原型谷胱甘肽含量的多少與其營養(yǎng)價(jià)值及功效密切相關(guān)，因此，對其含量的檢測具有重要意義。

本研究擬以鐵氰化鉀與還原型谷胱甘肽的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，建立一種簡單、有效的比色檢測黃瓜中還原型谷胱甘肽的新方法，以期為食品質(zhì)量控制、功能食品開發(fā)、臨床檢測等過程中谷胱甘肽成分的準(zhǔn)確、可靠分析提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

鐵氰化鉀、還原型谷胱甘肽、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和氫氧化鈉均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸購自中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站。市售黃瓜購自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬院菜市場。

1.2 試驗(yàn)方法

溶液配制：0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 為5.0～9.0）由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)配制；采用0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 為5.0～9.0）分別配制5.0 mmol·L-1鐵氰化鉀溶液和1.0 mg·mL-1的谷胱甘肽溶液。

黃瓜樣品預(yù)處理：首先，對市售黃瓜樣品進(jìn)行去皮、榨汁和過濾處理；然后，將過濾后的黃瓜樣品汁液在5 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液供顯色反應(yīng)使用。

顯色反應(yīng)：將一定體積的5.0 mmol·L-1鐵氰化鉀溶液、1.0 mg·mL-1的谷胱甘肽溶液及0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液充分混合，待顯色反應(yīng)一段時(shí)間后，采用智能手機(jī)（型號：紅米4X）對反應(yīng)后的溶液進(jìn)行拍照，并用SP-754 型紫外可見分光光度計(jì)對同一條件下反應(yīng)后稀釋2 倍的溶液進(jìn)行多次光譜掃描平行測定。

本試驗(yàn)首先對鐵氰化鉀比色法檢測谷胱甘肽方法進(jìn)行了驗(yàn)證。然后，考察了鐵氰化鉀濃度、緩沖液pH、反應(yīng)時(shí)間等因素對顯色反應(yīng)的影響，獲得最佳的谷胱甘肽檢測條件。接著，在最佳的檢測條件下，對不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的谷胱甘肽溶液進(jìn)行測定，獲得該方法檢測谷胱甘肽的線性范圍、檢出限等響應(yīng)性能。最后，將建立的方法用于市售黃瓜樣品中谷胱甘肽含量的測定。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定黃瓜樣品中谷胱甘肽的含量；將一定體積的5.0 mmol·L-1鐵氰化鉀溶液、9.0 mg·mL-1的谷胱甘肽溶液、0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液及離心后的黃瓜樣品上清液充分混合，待顯色反應(yīng)一段時(shí)間后，采用智能手機(jī)對反應(yīng)后的溶液進(jìn)行拍照，并用分光光度計(jì)對含不同標(biāo)準(zhǔn)濃度谷胱甘肽的黃瓜樣品溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，并用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵氰化鉀與谷胱甘肽的顯色反應(yīng)

圖1 為2.0 mmol·L-1鐵氰化鉀與0.50 mg·mL-1谷胱甘肽反應(yīng)前后溶液的顏色變化圖和溶液稀釋2 倍后的吸收光譜圖。由圖1A 可見，反應(yīng)前鐵氰化鉀溶液的顏色為黃綠色，而谷胱甘肽溶液的顏色為無色；反應(yīng)后鐵氰化鉀溶液的顏色明顯變淺。光譜測定結(jié)果表明可在419 nm 波長處觀察到鐵氰化鉀溶液的最大吸收峰，而在相應(yīng)波長范圍內(nèi)未觀察到谷胱甘肽溶液的吸收峰；當(dāng)鐵氰化鉀溶液與谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)后，反應(yīng)后的溶液仍在419 nm 波長處有最大吸收峰，但與單獨(dú)的鐵氰化鉀溶液的吸光度相比，其吸光度明顯降低（圖1B）。這些結(jié)果表明具有還原性的谷胱甘肽可以將具有氧化性的鐵氰化鉀還原，同時(shí)引起鐵氰化鉀溶液顏色和吸光度的變化。因此，有望借助鐵氰化鉀溶液顏色和吸光度的變化實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽含量的測定。

2.2 鐵氰化鉀濃度對顯色反應(yīng)的影響

由于反應(yīng)前與反應(yīng)后鐵氰化鉀溶液的顏色均呈現(xiàn)不斷加深的趨勢，這使得通過溶液顏色變化難以獲得最佳的鐵氰化鉀濃度。因此，進(jìn)一步通過考察反應(yīng)前后溶液的吸光度差值變化來優(yōu)化鐵氰化鉀濃度對顯色反應(yīng)的影響。由圖2 可見，隨著鐵氰化鉀濃度的不斷增大，反應(yīng)前后溶液的吸光度差值首先逐漸升高，然后趨于穩(wěn)定。由于鐵氰化鉀濃度為2.4 mmol·L-1時(shí)反應(yīng)前后溶液的吸光度差值變化最為明顯，因此，后續(xù)選擇該濃度的鐵氰化鉀進(jìn)行谷胱甘肽的測定。

2.3 緩沖液pH 對顯色反應(yīng)的影響

由圖3 可見，隨著緩沖液pH 的不斷增大，反應(yīng)前鐵氰化鉀溶液的顏色變化較難分辨，與谷胱甘肽反應(yīng)后溶液的顏色變化較為明顯，而且緩沖液pH 為8.0 時(shí)溶液的顏色較其它條件下更淡并趨于無色。由于緩沖液pH 為8.0 時(shí)反應(yīng)前后溶液的顏色變化最為明顯，因此，選擇該緩沖液pH 進(jìn)行谷胱甘肽的后續(xù)測定。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對顯色反應(yīng)的影響

由圖4 可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長，溶液的顏色逐漸變淺，在反應(yīng)27 min 后溶液的顏色達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并趨于無色。因此，選擇27 min 為最佳反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行谷胱甘肽的后續(xù)測定。

圖1 2.0 mmol·L-1鐵氰化鉀與0.50 mg·mL-1谷胱甘肽反應(yīng)前后溶液的顏色變化圖（A）和溶液稀釋兩倍后的吸收光譜圖（B）Fig.1 Diagrams of solution color change（A）and absorption spectrum（B）of the two-fold diluted solution before and after reacting between 2.0 mmol·L-1 potassium ferricyanide and 0.50 mg·mL-1 glutathione

圖2 不同濃度鐵氰化鉀與0.50 mg·mL-1谷胱甘肽反應(yīng)前后溶液的吸光度差變化圖Fig.2 Diagram of the variation of absorbance difference at different concentration of potassium ferricyanide before and after reacting with 0.50 mg·mL-1 glutathione

2.5 不同濃度谷胱甘肽的測定

由圖5 可見，隨著谷胱甘肽濃度的不斷增大，反應(yīng)后溶液的顏色逐漸變淺（圖5A）。同時(shí)，吸光度也隨著谷胱甘肽濃度的增加在不斷降低；當(dāng)谷胱甘肽濃度高于0.36 mg·mL-1時(shí)，溶液吸光度趨于穩(wěn)定（圖5B）。而且，在0～0.36 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與谷胱甘肽濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R=?0.992，圖5C）。據(jù)空白溶液吸光度信號的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以擬合曲線斜率獲得該方法的檢出限為3.0 μg·mL-1。

2.6 樣品檢測

圖3 2.4 mmol·L-1 鐵氰化鉀與0.50 mg·mL-1 谷胱甘肽在不同緩沖液pH 條件下反應(yīng)前（A）后（B）溶液的顏色變化圖Fig.3 Diagram of solution color change of 2.4 mmol·L-1 potassium ferricyanide before（A）and after（B）reacting with 0.50 mg·mL-1 glutathione under different buffer solution pH

通過光譜測定獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃瓜樣品中谷胱甘肽的濃度為0.31 mg·mL-1，回收率為89.8%～103.9%。這些結(jié)果表明可以將建立的比色檢測方法成功用于黃瓜樣品中谷胱甘肽含量的準(zhǔn)確測定。

3 討論與結(jié)論

圖4 2.4 mmol·L-1 鐵氰化鉀與0.50 mg·mL-1 谷胱甘 肽 反應(yīng)不同時(shí)間時(shí)溶液的顏色變化圖Fig.4 Diagram of solution color change of 2.4 mmol·L-1 potassium ferricyanide reacting with 0.50 mg·mL-1 glutathione for different time

目前，已報(bào)道的酶循環(huán)法、熒光法、高效液相色譜法、高效液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法等谷胱甘肽檢測方法雖然靈敏度或準(zhǔn)確度較高，但也存在一些不足之處，如試劑成本高、儀器設(shè)備昂貴、對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求較高等。本研究建立的鐵氰化鉀比色檢測谷胱甘肽方法有望彌補(bǔ)上述檢測方法的不足之處。例如，與酶循環(huán)法相比，本研究建立的方法在試劑成本和穩(wěn)定性方面存在明顯優(yōu)勢。本試驗(yàn)所用的鐵氰化鉀試劑的價(jià)格遠(yuǎn)較酶試劑的低，而且受環(huán)境溫度、pH 等因素的影響較小。又如，與熒光法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相比，本研究建立的方法在儀器設(shè)備成本、對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求方面存在顯著優(yōu)勢。本試驗(yàn)所用的智能手機(jī)和紫外可見分光光度計(jì)設(shè)備的價(jià)格較熒光分光光度計(jì)、高效液相色譜、質(zhì)譜設(shè)備低得多，而且對操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求較低，易推廣。

鐵氰化鉀溶液顏色為黃綠色，谷胱甘肽溶液顏色為無色，將二者混合后一段時(shí)間，溶液顏色明顯變淺且吸光度降低。該現(xiàn)象說明具有還原性的谷胱甘肽可以與具有氧化性的鐵氰化鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并伴隨鐵氰化鉀溶液顏色和吸光度的變化。這為利用鐵氰化鉀溶液顏色和吸光度的變化實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽的比色測定提供了一種可能。

本研究基于還原型谷胱甘肽可以引起鐵氰化鉀溶液褪色和吸光度降低的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對黃瓜樣品中谷胱甘肽含量的比色檢測。在最佳的檢測條件下，隨著谷胱甘肽濃度的不斷升高，反應(yīng)后鐵氰化鉀溶液的顏色逐漸變淺，而且溶液的吸光度與谷胱甘肽濃度在0～0.36 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為3.0 μg·mL-1，黃瓜樣品中谷胱甘肽的回收率為89.8%～103.9%。

圖5 2.4 mmol·L-1鐵氰化鉀與不同濃度谷胱甘肽反應(yīng)后溶液的顏色變化圖（A）、溶液稀釋兩倍后的吸收光譜圖（B）及吸光度隨谷胱甘肽濃度的變化關(guān)系圖（C）Fig.5 Diagrams of solution color change（A），absorption spectrum of the two-fold diluted solution（B）and relationships of absorbance with glutathione concentration（C）after reacting between 2.4 mmol·L-1 potassium ferricyanide and different concentration of glutathione

綜上所述，本研究建立了一種比色檢測還原型谷胱甘肽的方法，該方法具有操作簡單、成本低、靈敏、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，為食品樣品中谷胱甘肽含量的測定提供了一種新途徑。