劉婷婷 張鑫藝 隋小宇 陳剛 王慧玉 張杰 孫輯凱 徐濤

(齊齊哈爾醫(yī)學院，齊齊哈爾，161006)

離子液體以其獨特的性質(zhì)，作為一種“綠色溶劑”用于植物活性成分的萃取分離，具有潛在優(yōu)勢。離子液體目前主要應用于合成、催化、萃取等領(lǐng)域，近年來，基于離子液體的固液萃取技術(shù)在植物化學研究領(lǐng)域越來越受到關(guān)注[1]，已發(fā)展應用于生物堿[2]、黃酮類[3-4]、香豆素[5]、木脂素類[6]等藥用植物活性成分的萃取分離過程。

盡管離子液體在很多萃取研究中體現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)萃取溶劑的性質(zhì)，但其不足之處也十分明顯[7]。首先，純離子液體的黏度大，與傳統(tǒng)萃取過程相比，其萃取過程中的混合和傳質(zhì)性能會顯著下降。向離子液體中添加分子溶劑作為稀釋劑，通過離子—分子相互作用及溶劑化效應可有效削弱離子間的相互作用及其微觀聚集結(jié)構(gòu)，顯著降低體系的黏度，促進傳遞過程的進行[8-9]。目前的研究多采用離子液體-水復合溶劑實現(xiàn)活性物質(zhì)的固液萃取[10-13]，水作為共溶劑，降低離子液體的黏度，提高了溶劑的擴散能力。但離子液體-水復合溶劑對植物原料的滲透性較差，分散速度緩慢。

選用纖維素酶作用于植物材料，降解構(gòu)成細胞壁的物質(zhì)，破壞細胞壁的致密結(jié)構(gòu)，減小傳質(zhì)阻力，從而有利于有效成分的提取。而咪唑類離子液體中加入纖維素酶，纖維素酶可以降解纖維素、果膠而破壞植物細胞壁，從而使提高子液體的擴散能力。其意義在以下幾方面體現(xiàn)：①纖維素酶能夠有效破壞植物細胞壁，減小溶劑擴散阻力；②纖維素酶破壞細胞壁會使細胞內(nèi)成分溶解、混懸于溶劑中，利于提取分離；③節(jié)約時間和溶劑；④提高了離子液體滲透能力。而這其中首要工作是要保證纖維素酶在離子液體-水中的酶活力。測定纖維素酶酶活的方法有化學法(底物、產(chǎn)物分析)、熒光法、同位素測定法和電化學法[14-15]。本研究采用熒光分析法考查咪唑類離子液體中纖維素酶的熒光活性。熒光光譜分析法的主要優(yōu)點是靈敏度高、選擇性高、干擾小、試樣量小，相比于化學法操作簡便[16]。利用熒光光譜法分析不同1-烷基-3-甲基咪唑類離子液體水溶液中纖維素的酶活力，為離子液體的選擇和利用提供基礎數(shù)據(jù)。此外，離子液體已廣泛應用于生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化領(lǐng)域[17]，在預處理過程中，借助纖維素酶的水解作用，有效提高纖維素的降解效率[18-20]。本研究結(jié)果也將為該領(lǐng)域中的纖維素酶的酶學特性提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

纖維素酶，以羧甲基纖維素鈉為底物的酶活≥1×106U/g，銀川市和氏璧生物技術(shù)有限公司；11種咪唑類離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氫氟硼酸鹽[Bmim]BF4，溴化1-辛基-3-甲基咪唑[Omim]Br溴化1-己基-3-甲基咪唑[Hmim]Br, 1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽[Bmim]NO3，溴化1-乙基-3-甲基咪唑[Emim]Br, 1-丁基-3-甲基咪唑?qū)妆交撬猁}[Bmim]MBS, 1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽[Bmim]HSO4, 氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑[Amim]Cl, 氯化1-芐基-3-甲基咪唑[Bzmim]Cl, 氯化1-丁基-3-甲基咪唑[Bmim]Cl, 溴化1-丁基-3-甲基咪唑[Bmim]Br, 上海成捷化學有限公司，使用時未經(jīng)進一步純化，去離子水為實驗室自制。熒光光譜儀LS-45/55, 美國PerkinElmer。

1.2 纖維素酶的熒光光譜

配制質(zhì)量濃度為2 g/L纖維素酶于檸檬酸緩沖溶液中(pH= 4.8, 50 mmol/L),掃描纖維素酶的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,得到纖維素酶的最大激發(fā)波長(λex,max)和最大發(fā)射波長(λemx,max)及熒光強度。掃描范圍200～800 nm，激發(fā)單色器狹縫寬度20 nm，發(fā)射單色器狹縫寬度5 nm，循環(huán)水浴溫度50 ℃。

1.3 離子液體溶液中纖維素酶的熒光活性測定

配置一定濃度的離子液體溶液與上述酶溶液等體積混合后， 在相同的作用時間內(nèi)，以纖維素酶λex,max波長為激發(fā)光，于λemx,max下檢測纖維素酶的熒光活性，空白分別為各離子液體溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶的熒光光譜特征

在蛋白質(zhì)分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)。個別蛋白質(zhì)分子含有的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)也能發(fā)射熒光。Trp、Tyr及Phe熒光強弱順序從大到小依次為Trp、Ty、Phe。通常，蛋白質(zhì)的熒光通常在 280 nm 或更長的波長被激發(fā)，因此Phe在絕大多數(shù)實驗條件下不被激發(fā)。蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來自Trp和Tyr 殘基。Trp 殘基對微環(huán)境的變化很敏感，因而常作為內(nèi)源熒光探針來研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象[21]。目前，對于熒光光譜的研究主要在猝滅劑、溶劑、電磁場及金屬離子等對酶構(gòu)象方面[22-23]。因此，可以根據(jù)蛋白質(zhì)溶液在280 nm附近的激發(fā)波長下所產(chǎn)生較高強度的熒光，根據(jù)蛋白溶液的熒光光譜特征，可以分析蛋白結(jié)構(gòu)的變化,進而考查環(huán)境等因素對纖維素酶活力的影響[24]。

結(jié)果如圖1所示，纖維素酶的最大激發(fā)波長270 nm(熒光強度194.43)，最大發(fā)射波長 346 nm (熒光強度196.05)，它的熒光發(fā)射光譜和激發(fā)光譜之間存在著鏡像對稱關(guān)系。由于纖維素酶為蛋白質(zhì)，熒光活性主要來自于其色基酸殘基，其熒光活性的穩(wěn)定性有待考查，因此不同時間點(30、 60、90、120 min)分別考查纖維素酶的熒光活性，其熒光強度在190.44～193.04范圍內(nèi)變化，說明其熒光活性在2 h內(nèi)是較穩(wěn)定的。

圖1 纖維素酶的熒光光譜特征

2.2 離子液體溶液對纖維素酶的熒光活性的影響

2.2.1 離子液體的熒光干擾

離子液體在酶熒光活性測定時會存在一定程度的干擾，最終導致酶熒光活性測定準確度降低。因此對離子液體溶液自身的熒光干擾進行了考查。結(jié)果如表1所示，11種咪唑型離子液體中在346 nm處的熒光強度較小，對酶活性測定影響較小。

表1 離子液體溶液的熒光干擾

2.2.2 離子液體結(jié)構(gòu)對纖維素酶熒光活性的影響

陽離子碳鏈長度。陰離子均為Br-時，碳鏈長度不同對纖維素酶熒光強度產(chǎn)生影響亦不相同。陽離子碳鏈長度越長，纖維素酶的熒光強度降低幅度越大，當碳鏈的原子數(shù)目為2或4個時對酶活性影響最小。這可能由于空間位阻的影響，使得纖維素酶空間結(jié)構(gòu)、褶皺程度發(fā)生改變，導致其分子內(nèi)的熒光猝滅，其具體影響如表2所示。

陽離子不飽和程度。陰離子均為Cl-時，分別考查了陽離子碳鏈的不飽和程度對纖維素酶熒光強度影響，熒光活性大小依次順序為丁烷基、烯丙基、芐基, 陽離子不飽和程度越大對酶的活性影響越大。

表2 離子液體溶液中纖維素酶的熒光活性

2.2.3離子液體溶液濃度對纖維素酶熒光活性的影響

如表3所示，離子液體溶液濃度分別為0.40、0.25、0.20、0.10 mol/L時，11種咪唑類離子液體中纖維素酶熒光活性隨濃度的增高成遞減的趨勢，濃度越低，對酶活性影響越小。

表3 纖維素酶在不同濃度離子液體中的熒光強度

3 討論與結(jié)論

纖維素酶系蛋白質(zhì)中，因其含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基而產(chǎn)生較強的內(nèi)源熒光。 影響分子發(fā)光的環(huán)境因素有：溶劑、介質(zhì)酸堿性、介質(zhì)的溫度和黏度及有序介質(zhì)。當某些因素作用于蛋白質(zhì)后，會導致其熒光強度下降，這種現(xiàn)象稱為熒光猝滅作用。一般來說，不同陰離子組成的離子液體影響纖維素酶活性，結(jié)果在一定程度上符合離子對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的Hofmeister規(guī)律[16]；離子液體中碳鏈長度較長的陽離子對纖維素酶有較大的抑制作用，但未達到失活水平；最明顯的是高濃度的離子液體會使酶在一定程度上失去部分活性。

從Chen、Liu et al.[25-26]的研究可以看出，在低濃度的咪唑型離子液體溶液中，纖維素酶保持一定的活性，對水解纖維素保持有效的催化效率，能夠破壞細胞壁，提高傳質(zhì)。Cui et al.[27]對1-烷基-3甲基咪唑型離子液體溶液中纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶對喜樹翅果進行處理，其中以[Omim]Br+半纖維素酶溶劑體系在目標化合物的溶出效果上優(yōu)勢明顯，這可能與喜樹翅果細胞壁主要以半纖維為主有關(guān)。本研究的光譜學研究結(jié)果顯示，低濃度的離子液體溶液對纖維素酶酶活力有一定影響，其還具備一定催化水解能力和效率。