鹽酸多西環(huán)素片在羔羊體內(nèi)殘留消除規(guī)律及休藥期分析

曹玉穎，王 杰，張希墨，吳琴堯，邱基程，李淑媛，張 璐，龔曉會(huì)，白如念，曹興元*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100013)

鹽酸多西環(huán)素屬于四環(huán)素類抗生素，具有高效、長(zhǎng)效、廣譜等優(yōu)點(diǎn)，抗菌效果是同類藥物的2～4倍，屬于快速抑菌劑，高濃度時(shí)具有殺菌作用，臨床上主要用于治療畜禽的支原體病、沙門菌病、大腸桿菌病和巴氏桿菌病等[1]。隨著藥物的廣泛應(yīng)用，藥物殘留問題引起社會(huì)的廣泛關(guān)注，根據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的GB 31650—2019標(biāo)準(zhǔn)，多西環(huán)素在豬、雞和牛等靶動(dòng)物組織中的最高殘留限量(MRL)均為皮+脂肪300 μg·kg-1、肌肉100 μg·kg-1、腎600 μg·kg-1、肝300 μg·kg-1 [2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于鹽酸多西環(huán)素不同制劑在豬、雞、蛋、魚和奶中的殘留消除研究已有不少報(bào)道，但鹽酸多西環(huán)素在羊上的研究還未見報(bào)道[3-7]。本試驗(yàn)旨在研究口服給予鹽酸多西環(huán)素片后，確定多西環(huán)素在羔羊組織中的殘留消除規(guī)律并計(jì)算其休藥期，為鹽酸多西環(huán)素片在羊臨床疾病治療上提供相關(guān)依據(jù)，保障消費(fèi)者的食品安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

鹽酸多西環(huán)素片：10 mg·片-1，批號(hào)為獸藥字030462604，河北省遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司提供；鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥ 98.7%，批號(hào)為20104，購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrensorfer公司；超純水：由Milli-Q超純水儀制?。患状?、乙腈均為色譜純；磷酸氫二鈉、枸櫞酸、草酸、乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)、硫酸、草酸、鎢酸鈉和三氟乙酸均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀:Agilent 1260 HPLC-VWD；R 200 D感量0.000 01 g分析天平，德國(guó)Sartofius公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；MP 2002感量0.01 g天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Waters 200606固相萃取裝置；N-EVAP-112氮吹儀，美國(guó)Organomation Associate公司；F-50無油真空泵，天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；6 cc/500 mg HLB固相萃取柱，Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康小尾寒羊羔羊40頭，雌雄各半，體重為15～20 kg， 其中，對(duì)照組5頭，給藥組35頭。

1.4 給藥與樣品采集

給藥組35只羔羊按照推薦劑量給藥(5 mg·kg-1內(nèi)服給藥，每天1次，連用5 d)。于最后1次給藥后分別在第0(12小時(shí))、1、2、3、5、7和9天，隨機(jī)選擇5只 羔羊進(jìn)行屠宰，快速取其肌肉、肝、脂肪和腎等組織(各組織樣品約250 g)，用濾紙吸取臟器表面血液。對(duì)照組未用藥羊于第0天采集相同組織作為空白對(duì)照。

1.5 樣品處理與檢測(cè)

1.5.1 提取 不同樣品提取方法如下。

1.5.1.1 脂肪：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)試料(1.00±0.01)g放置于10 mL離心管中，加ACN∶H2O=1∶9 的溶液2 mL，渦旋1 min，40 ℃超聲5 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。將殘?jiān)貜?fù)上述步驟重復(fù)提取1次，合并2次上清液，于-80 ℃ 冷凍除脂5 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min， 取出上清液，備用。

1.5.1.2 肌肉、肝：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)試料(5.00±0.05)g放置于50 mL離心管中，加入提取液EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液20 mL，渦旋1 min并振蕩10 min，加0.34 mol·L-1硫酸溶液5 mL、7%鎢酸鈉溶液5 mL，并渦旋1 min，4 ℃ 8 500 r·min-1離心5 min，取上清液。殘?jiān)锰崛∫篍DTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液20、10 mL分別重復(fù)提取，合并3次上清液，中性濾紙過濾后，備用。

1.5.1.3 腎：準(zhǔn)確稱取均質(zhì)試料(2.00±0.02)g，放置于50 mL離心管中，加入提取液EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液10 mL，渦旋1 min，并振蕩10 min， 加0.34 mol·L-1硫酸溶液2 mL、7%鎢酸鈉溶液2 mL，并渦旋1 min，4 ℃ 8 500 r·min-1離心5 min，取上清液。殘?jiān)肊DTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液10 mL重復(fù)提取2次，合并3次上清液，中性濾紙過濾后，備用。

1.5.2 樣品凈化 使用HLB小柱進(jìn)行樣品凈化，HLB柱依次用甲醇、水和EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液各5 mL進(jìn)行活化，然后將備用液全部過柱，依次用10 mL水和10 mL 5 %甲醇溶液淋洗，用真空泵干燥30 s，最后用5 mL甲醇洗脫并收集洗脫液于10 mL刻度試管中，于40 ℃水浴氮?dú)獯抵?.5～1.0 mL，用0.01 mol·L-1草酸溶液定容至2.0 mL，過濾，供高效液相色譜測(cè)定。

1.5.3 液相色譜條件 色譜柱C18(4.6 mm×150 mm，4 μm)；流動(dòng)相A為0.01 mol·L-1三氟乙酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫，詳情見表1；流速1.0 mL·min-1； 進(jìn)樣量50 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；柱溫30 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.6 方法學(xué)驗(yàn)證

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用色譜級(jí)甲醇配制成濃度1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。使用0.01 mol·L-1草酸溶液將儲(chǔ)備液稀釋成濃度為50、100、200、500、1 000、 2 000、5 000 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.6.2 靈敏度 按信噪比S/N≥3確定檢測(cè)限(LOD)，S/N≥10確定定量限(LOQ)。

1.6.3 準(zhǔn)確度和精密度 在羔羊的可食性空白組織中添加定量限、MRL和2MRL 3種不同濃度鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度制備5個(gè)平行樣品，重復(fù)3批次(連續(xù)測(cè)定3天)，計(jì)算多西環(huán)素回收率、批內(nèi)及批間變異系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品中鹽酸多西環(huán)素的色譜分析見圖1。

采用帶有加權(quán)因子(1/x2)一階矯正類型來繪制不同濃度點(diǎn)之間的“最佳擬合”直線，以實(shí)現(xiàn)3條校正曲線中理論值與實(shí)測(cè)值的偏差平方和最小化，回歸方程y=0.044x-0.414，R2=0.999，表明多西環(huán)素濃度在50～5 000 ng·mL-1色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)。

2.2 靈敏度

本方法測(cè)得多西環(huán)素在羔羊的肌肉組織中檢測(cè)限為20 μg·kg-1(S/N≥3)，定量限為50 μg·kg-1(S/N≥10)；在羔羊的肝組織、腎組織、脂肪組織的檢測(cè)限為50 μg·kg-1(S/N≥3)，定量限為100 μg·kg-1(S/N≥10)。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

多西環(huán)素在羔羊肌肉、腎、肝和脂肪中的回收率以及批內(nèi)和批間變異系數(shù)見表2。組織中多西環(huán)素的回收率為60.49%～116.8%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。

2.4 組織中藥物殘留

每個(gè)采樣時(shí)間各組織中的多西環(huán)素殘留量如表3所示。結(jié)果表明：最后1次給藥后第12小時(shí)，各組織藥物殘留濃度高低順序依次為腎>肝>肌肉>脂肪，脂肪組織中的藥物殘留量低于定量限。最后1次給藥后第1天，肌肉、肝和脂肪組織中的多西環(huán)素藥物殘留濃度均已低于檢測(cè)限，腎組織中的多西環(huán)素藥物殘留濃度低于定量限，說明鹽酸多西環(huán)素片在羔羊組織內(nèi)代謝快速。

表2 多西環(huán)素在羔羊肌肉、腎、肝和脂肪中的回收率及變異系數(shù)

A. 鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 ng·mL-1); B.空白肌肉組織; C.空白肌肉組織添加50 ng·mL-1鹽酸多西環(huán)素A. Doxycycline hydrochloride standard solution(50 ng·mL-1); B. Blank muscle tissue; C. Blank muscle tissue with 50 ng·mL-1 doxycycline hydrochloride圖1 鹽酸多西環(huán)素色譜分析Fig.1 Chromatography of doxycycline hydrochloride

表3 內(nèi)服給藥后多西環(huán)素在各組織中的殘留量

2.5 休藥期計(jì)算

本試驗(yàn)藥物殘留濃度根據(jù)休藥期決策標(biāo)準(zhǔn)，將各組織中的殘留物低于各組織MRL的時(shí)間加上一個(gè)安全跨度值即為所求的休藥期。安全跨度值是10%～30%的時(shí)間周期值或者1倍～3倍的組織消除半衰期，且建議最小安全跨度值為1～2 d。綜上表明，為了保障消費(fèi)者食品安全，建議鹽酸多西環(huán)素片在羔羊體內(nèi)的休藥期為2 d[13-14]。

3 討 論

3.1 多西環(huán)素在羔羊組織中的分離提取

本試驗(yàn)所需檢測(cè)的羊組織：肌肉、腎、肝和脂肪。脂肪提取方法與其他3種組織的提取方法不同。在建立脂肪前處理方法的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)使用二氯甲烷對(duì)脂肪進(jìn)行溶解，EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液提取多西環(huán)素時(shí)，回收率極低，期間采用超聲、水浴加熱以及-80 ℃冷凍除脂等方法來提高回收率，并未有明顯改善。乙腈和甲醇是組織中殘留物的常用提取劑，都有很強(qiáng)沉淀蛋白質(zhì)的能力。甲醇屬于兩性物質(zhì)，在進(jìn)行樣品處理之后，雜質(zhì)峰增多，使用乙腈處理后雜質(zhì)峰減少，經(jīng)過不斷優(yōu)化提取方法，回收結(jié)果表明使用ACN∶H2O=1∶9的提取液提取，并通過渦旋、40 ℃超聲、4 ℃ 12 000 r·min-1離心以及冷凍除脂等過程顯著提高回收率，并使得回收率達(dá)到60%以上。

3.2 鹽酸多西環(huán)素片休藥期的制定

鹽酸多西環(huán)素在羔羊組織中的殘留消除規(guī)律還未被報(bào)道，且多西環(huán)素在羔羊組織中的最高殘留限量未被制定。參照我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部GB 31650—2019標(biāo)準(zhǔn)和歐盟發(fā)布的多西環(huán)素在豬、雞和牛等靶動(dòng)物組織中的最高殘留限量(MRL)均為皮+脂肪300 μg·kg-1、肌肉100 μg·kg-1、腎600 μg·kg-1、肝300 μg·kg-1 [2]。根據(jù)EMEA動(dòng)物源性食品中獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)分析指南說明可以將已知的反芻動(dòng)物有關(guān)MRL相互外推[8]，因此,羔羊的MRL以牛相關(guān)組織的最高殘留限量作為參考，即多西環(huán)素在羔羊組織中的最高殘留限量(MRL)為皮+脂肪300 μg·kg-1、肌肉100 μg·kg-1、腎600 μg·kg-1、肝300 μg·kg-1。

鹽酸多西環(huán)素不同制劑在豬、雞、蛋、魚和奶中的殘留消除研究已有不少報(bào)道[3-7]，其中，Croubles等[7]報(bào)道豬按體重以10.5 mg·kg-1的劑量連續(xù)飲水給藥5 d，經(jīng)簡(jiǎn)單決策法計(jì)算休藥期為3 d。劉欣等[9]使用50%鹽酸多西環(huán)素顆粒以10 mg·kg-1劑量在豬體內(nèi)使用，連續(xù)給藥5 d，使用WT 1.4軟件測(cè)得鹽酸多西環(huán)素顆粒在豬體內(nèi)的休藥期為12 d。黃耀凌等[10]使用鹽酸多西環(huán)素注射液以10 mg·kg-1劑量在豬體內(nèi)使用，連續(xù)給藥3 d，使用WT 1.4軟件測(cè)得鹽酸多西環(huán)素長(zhǎng)效注射液在豬體內(nèi)的休藥期為42 d。王金花等[11]測(cè)得鹽酸多西環(huán)素注射液的休藥期不低于16 d。李媚等[12]使用WT 1.4軟件測(cè)得多西環(huán)素注射液在豬體內(nèi)的休藥期不低于28 d。不同劑型的藥物通過不同的給藥方式所表現(xiàn)的藥物吸收及代謝消除規(guī)律不同，其制定的休藥期也不同。

為研究鹽酸多西環(huán)素片在羔羊組織中的殘留消除規(guī)律以及制定其休藥期，本試驗(yàn)采取高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測(cè)器法進(jìn)行多西環(huán)素的檢測(cè)。本研究結(jié)果不符合使用WT1.4計(jì)算休藥期的規(guī)定，因此，根據(jù)歐洲藥品評(píng)估機(jī)構(gòu)發(fā)布的《EMEA/CVMP/036/95》法規(guī)中的決策標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行本研究的休藥期計(jì)算。綜上表明，為保障食品消費(fèi)者安全，建議將鹽酸多西環(huán)素片在羔羊組織內(nèi)的休藥期定為2 d。

4 結(jié) 論

5 mg·kg-1體重內(nèi)服給予羔羊鹽酸多西環(huán)素片后，根據(jù)歐洲藥品評(píng)估機(jī)構(gòu)法規(guī)《EMEA/CVMP/036/95》，建議鹽酸多西環(huán)素片在羔羊組織中的休藥期為2 d。