虞鳳慧，成道泉，王祥傳，周 倩，吳文雷，張 騫，楊傳倫，韓立霞，吳 磊，劉海玉，徐澤平,4

（1黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東濱州256500；2京博農(nóng)化科技有限公司，山東濱州256500；3山東京博控股集團有限公司，山東濱州256500；4濱州市環(huán)境微生物技術(shù)工程研究中心，山東濱州256500）

0 引言

番茄是中國設(shè)施（溫室）栽培面積最大的蔬菜，溫室番茄種植過程中常見的病害包括病毒病[1-2]以及灰葉斑病、葉霉病[3]、早疫病[4-6]、晚疫病[7-8]等真菌性病害。由于溫室小氣候具有高濕、低通風、溫度高等特性，適合病原微生物生長、繁殖和擴散，使得病害易發(fā)、疊發(fā)、病情嚴重。高頻次、高劑量施藥是生產(chǎn)實踐中通常采用的病害防治方法，但也帶來農(nóng)藥抗性增強、農(nóng)藥殘留、勞動量大等問題，同時對番茄品質(zhì)和產(chǎn)量造成很大影響。殼寡糖鋅是殼寡糖（又名氨基寡糖素[9]）與無機鋅經(jīng)過特定反應(yīng)形成的螯合物或配合物，是一種新型功能性肥料。殼寡糖鋅既保留了殼寡糖的原有活性，又為作物提供了生長必需的鋅元素，并呈現(xiàn)出協(xié)同增效作用。因此，施用殼寡糖鋅可顯著增強作物抗病能力，促進作物生長，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，且有助于化肥、農(nóng)藥減量增效，提高農(nóng)產(chǎn)品安全性和農(nóng)戶經(jīng)濟效益，對綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。近年來，已有一些關(guān)于殼寡糖鋅及其相關(guān)產(chǎn)品在抑菌、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面的應(yīng)用報道[10-14]，如侯華民[15]等研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖鋅可使油菜產(chǎn)量提高16.5%。Higazy等[16]以殼聚糖(160000 Da)為原料，制備了殼聚糖鋅配合物，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑制活性[17]。盧琪潔等[17]以殼寡糖(500～1000 Da)為原料，制備了殼寡糖鋅配合物，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌效果較好。劉文歡等[18]將殼寡糖與硫酸鋅等營養(yǎng)成分復(fù)配，于小麥上噴施，可分別提高小麥產(chǎn)量和千粒重15.05%和12.39%以上。但總體來看，尚未有人對殼寡糖鋅防治作物病原菌的效果進行系統(tǒng)評價，也缺乏殼寡糖鋅在經(jīng)濟作物上的應(yīng)用表現(xiàn)數(shù)據(jù)，在一定程度上限制了該類產(chǎn)品的開發(fā)和推廣。而且，從已上市的產(chǎn)品來看，國內(nèi)外生產(chǎn)殼寡糖鋅的廠家較少，國內(nèi)主要有北京標馳農(nóng)業(yè)科技開發(fā)中心（產(chǎn)品為寡糖鋅）和海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司（產(chǎn)品為海洋寡糖鋅），國外主要為以色列海法農(nóng)業(yè)化學(xué)集團。其他相關(guān)產(chǎn)品多為含鋅的殼寡糖復(fù)配產(chǎn)品。本研究產(chǎn)品為殼寡糖鋅螯合物，鋅與殼寡糖糖鏈中的-NH2結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的螯合物，有別于殼寡糖與鋅鹽復(fù)配產(chǎn)品，螯合態(tài)的鋅更容易被作物吸收利用[19-22]。殼寡糖鋅屬于安全、綠色、環(huán)保型農(nóng)用產(chǎn)品，目前，關(guān)于殼寡糖鋅在作物抗病、促生、增產(chǎn)方面的報道較少。本研究以溫室番茄為供試作物，自番茄幼苗期開始施用殼寡糖鋅，研究其對番茄的防病效果及果實品質(zhì)和產(chǎn)量的影響。期望為綠色農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試番茄：‘粉德利618’，購于壽光市金農(nóng)種業(yè)。

供試藥劑：殼寡糖鋅（有效物質(zhì)含量3.45%），本實驗室自制；氫氧化銅制劑、苦參總堿、稻瘟酰胺（有效物質(zhì)含量20%），市售產(chǎn)品。

供試病原菌：黃瓜角斑病原菌(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)、姜瘟病原菌(Ralstonia solanacearum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、辣椒疫霉病原菌(Phytophthora capsiciLeonian)、蘋果腐爛病原菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)、小麥赤霉病原菌(FusaHum graminearumSehw)、水稻紋枯病原菌(Rhizoctonia solaniKühn)和棉花枯萎病原菌(Fusarium oxysporumf.sp.Vesinfectum)，本實驗室保存。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，煮沸30 min，紗布過濾，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，121℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-Q全溫振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼寡糖鋅對細菌的抑制作用 選取黃瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌、大腸桿菌3種細菌為抑菌對象，活化菌種，確定最適菌液濃度。配制LB固體培養(yǎng)基、滅菌，培養(yǎng)基冷卻至40～50℃時，加入不同濃度的藥劑，制成含藥平板。以不加任何藥劑的LB培養(yǎng)基作為空白對照。取1×106CFU/mL的菌液100 μL均勻涂布于平板上，每個處理3個重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)，根據(jù)菌落個數(shù)確定最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.2 殼寡糖鋅對真菌的抑制作用 選取辣椒疫霉病原菌、蘋果腐爛病原菌、小麥赤霉病原菌、水稻紋枯病原菌和棉花枯萎病原菌為抑菌對象，活化菌種。配制PDA固體培養(yǎng)基，滅菌，培養(yǎng)基冷卻至40～50℃時，加入不同濃度的藥劑，制成含藥平板。以不加任何藥劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對照。用直徑6 mm的打孔器取已活化的病原菌菌塊，菌絲面朝下，接種于含藥平板中央，每個處理3個重復(fù)，28℃培養(yǎng)5天。用十字交叉法量取菌落直徑并計算抑制率，確定最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 殼寡糖鋅對番茄病害的防治效果 試驗在山東博華高效生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司蔬菜基地的番茄溫室中進行。供試土壤肥力中等，長期以種植蔬菜為主。試驗組噴施殼寡糖鋅，對照組未噴施殼寡糖鋅（溫室正常管理），面積各0.067 hm2。采用莖葉噴霧法，分別在番茄幼苗期（定植1周后）、開花尾期、結(jié)果期施藥，每個時期各施藥2次，每次間隔7～10天，殼寡糖鋅用量為2.25 L/(hm2·次)。每次施藥前后，觀察番茄植株發(fā)病情況。

1.3.4 殼寡糖鋅對番茄植株生長、果實品質(zhì)及產(chǎn)量的影響 在溫室番茄生長的整個時期，觀察番茄的生長情況，測量番茄株高和莖粗，確定相對增長量。同時，隨機取樣，測定成熟番茄中可溶性固形物、總酸、還原糖、維生素C、鋅的含量，計算固酸比，評價番茄品質(zhì)，測定產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖鋅對細菌的抑制作用

由表1可知，在對細菌性病原菌的抑菌實驗中，殼寡糖鋅與對照藥劑—殼寡糖、氫氧化銅制劑和苦參總堿對黃瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌和大腸桿菌均有不同程度的抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，抑菌效果增強。根據(jù)平板上菌落數(shù)量確定各藥劑的最低抑菌濃度(MIC)，如表2所示。

表1 不同藥劑對細菌的抑制效果 菌落數(shù)/個

由表2可知，與作物細菌性病害常用的防治農(nóng)藥—氫氧化銅制劑和植物性殺菌劑—苦參總堿相比，殼寡糖鋅對黃瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌和大腸桿菌的抑制效果最好，MIC值均為0.05%，較對照藥劑降低50%～75%。同時，殼寡糖鋅對3種病原菌的MIC值僅為殼寡糖的1/2～1/4，這可能與兩者不同的抑菌機制有關(guān)。殼寡糖在中性環(huán)境中帶正電荷，正電荷與微生物細胞膜表面的負電荷之間的相互作用，改變了微生物細胞膜的通透性，引起微生物細胞死亡[23]，這種作用具有高度的劑量依賴性。殼寡糖鋅呈電中性，容易穿過細胞膜進入胞內(nèi)，并在胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)闅す烟呛弯\，殼寡糖能夠與胞內(nèi)核酸、蛋白等大分子結(jié)合，干擾細胞正常代謝，引起細胞死亡。

表2 不同藥劑對細菌的最低抑菌濃度(MIC)

2.2 殼寡糖鋅對真菌的抑制作用

由表3可知，在對真菌性病原菌的抑菌實驗中，殼寡糖鋅對辣椒疫霉病原菌、蘋果腐爛病原菌、小麥赤霉病原菌、水稻紋枯病原菌和棉花枯萎病原菌均有一定抑制作用，且隨著藥劑濃度的增加，抑菌效果增強。而稻瘟酰胺的抑菌效果次之，隨著藥劑濃度的增加，稻瘟酰胺對小麥赤霉病原菌、水稻紋枯病原菌和棉花枯萎病原菌的抑菌效果無明顯增強，且藥劑效果不穩(wěn)定。根據(jù)菌絲抑制率確定各藥劑的MIC，如表4所示。

表3 不同藥劑對真菌的抑制效果

表4 不同藥劑對真菌的最低抑菌濃度(MIC)

由表4可知，與作物真菌性病害常用的防治農(nóng)藥—稻瘟酰胺相比，雖然殼寡糖鋅對真菌性病原菌的MIC無明顯降低，但其抑菌譜相對較廣，對5種病原菌均有抑制作用。而稻瘟酰胺僅對辣椒疫霉病原菌和蘋果腐爛病原菌有較好抑制作用。由此可見，殼寡糖鋅綜合抑菌效果優(yōu)于對照藥劑—稻瘟酰胺。

鑒于殼寡糖鋅對細菌性和真菌性病原菌均有較好的抑制作用，因此，通過田間試驗驗證殼寡糖鋅對溫室番茄病害的防治效果，以及對番茄植株生長、果實品質(zhì)及產(chǎn)量的影響。

2.3 殼寡糖鋅對番茄病害的防治效果

在番茄生長的各個時期施藥前后，觀察植株發(fā)生病害情況。如圖1所示，番茄成熟期，試驗溫室的番茄植株發(fā)生了較為嚴重的病害，相比于對照組，噴施殼寡糖鋅的番茄植株發(fā)病數(shù)量明顯減少，且病情較輕，整片葉子幾乎無明顯的斑點。比較而言，殼寡糖鋅對溫室番茄病害呈現(xiàn)出明顯的防治效果。

圖1 殼寡糖鋅對番茄病害的防治效果

2.4 殼寡糖鋅對番茄植株生長、果實品質(zhì)及產(chǎn)量的影響

2.4.1 殼寡糖鋅對番茄植株生長的影響 在番茄幼苗期，于噴施藥劑前后（施藥2次），分別隨機選取20株番茄植株，利用卷尺和游標卡尺分別測量株高和莖粗，并計算平均相對增量，結(jié)果見表5。后期番茄植株太高，測量誤差較大，不再統(tǒng)計生長量。

由表5可知，與對照組相比，噴施殼寡糖鋅的實驗組番茄株高增長17.11%，莖粗增長53.89%。

表5 殼寡糖鋅對番茄植株生長的影響

2.4.2 殼寡糖鋅對番茄品質(zhì)的影響 在番茄成熟期，隨機選取成熟度一致的番茄，測定可溶性固形物、總酸、還原糖、維生素C、鋅的含量，方法分別為NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》、GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定酸堿滴定法》、DNS法、GB 6195-86《水果、蔬菜維生素C含量測定（2,6-二氯靛酚滴定法）》、ICP-MS，并計算固酸比。

與對照組相比（見表6），在番茄生長整期，噴施殼寡糖鋅使番茄酸度降低了5.38%，同時，顯著提高了番茄的可溶性固形物、還原糖、維生素C、鋅含量及固酸比，相對增量依次為5.88%、27.88%、51.60%、87.91%、11.90%。其中，鋅含量大幅增加。

表6 殼寡糖鋅對番茄品質(zhì)的影響

2.4.3 殼寡糖鋅對番茄產(chǎn)量的影響 在番茄收獲階段，分別統(tǒng)計試驗組和對照組番茄總產(chǎn)量以及一級果、二級果、次果的總量，見圖2。

如圖2所示，噴施殼寡糖鋅后，番茄總產(chǎn)量和一級果產(chǎn)量顯著高于對照組，分別增產(chǎn)23.35%和30.73%，且未見二級果和次果。由此可見，自番茄幼苗期至結(jié)果期噴施殼寡糖鋅，可明顯提高番茄果實品質(zhì)及產(chǎn)量。

圖2 殼寡糖鋅對番茄產(chǎn)量的影響

3 討論

本實驗室將殼寡糖與鋅有機結(jié)合，開發(fā)出殼寡糖鋅螯合產(chǎn)品。本文研究了殼寡糖鋅對多種植物病原菌的抑制效果及其在溫室番茄上的應(yīng)用效果。從室內(nèi)抑菌實驗來看，殼寡糖鋅對多種植物細菌性和真菌性病原菌均具有較好的抑制效果，其MIC值與常用化學(xué)殺菌劑相比明顯降低。從對溫室番茄病害的防治效果來看，自番茄幼苗期開始，多次噴施殼寡糖鋅可明顯減少和減輕番茄植株病害的發(fā)生，與對照組差異顯著。從對番茄植株生長的影響來看，殼寡糖鋅可同時促進番茄株高和莖粗增長，增量明顯高于對照組。從對番茄果實品質(zhì)及產(chǎn)量的影響來看，殼寡糖鋅可提高番茄果實中可溶性固形物、還原糖、維生素C、鋅含量及固酸比。其中，鋅含量增加幅度最大，說明鋅元素被番茄植株有效吸收、利用，并在番茄果實中富集。同時，總酸含量降低，使番茄品質(zhì)和口感更佳。而且，施用殼寡糖鋅能夠明顯提高番茄總產(chǎn)量和一級果產(chǎn)量，降低二級果和次果產(chǎn)量。這與侯華民等[15]公開的含有機鋅的組合物（殼聚糖鋅或殼寡糖鋅等）對多種作物具有增產(chǎn)、改善品質(zhì)等作用相一致，且部分效果更優(yōu)。

綜上可知，殼寡糖鋅對抑制植物病原菌及對作物防病、增產(chǎn)等多方面具有明顯作用。本研究僅初步探索了單獨、多次噴施殼寡糖鋅在溫室番茄上的良好應(yīng)用效果，但具體的作用機理仍有待進一步研究。同時，后續(xù)仍需在其他作物上推廣應(yīng)用，并根據(jù)作物不同生長階段的營養(yǎng)需求及病害防治情況，考察殼寡糖鋅單獨沖施及其與葉面肥、腐植酸水溶肥、氨基酸水溶肥、化藥等復(fù)配應(yīng)用的效果，明確殼寡糖鋅的施用方式和應(yīng)用范圍。

4 結(jié)論

殼寡糖和鋅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有良好的應(yīng)用效果[24-30]，其中，殼寡糖作為一種植物免疫誘抗劑，對人、畜安全，長期或多次使用不會使植物產(chǎn)生特異性抗藥性[31]。但二者分別存在速效性差、不易被吸收利用等弊端，降低了其本身所具有的良好功效。本實驗室開發(fā)的殼寡糖鋅為真正的螯合產(chǎn)品，非殼寡糖與鋅元素的簡單混配。產(chǎn)品中未引入氯離子、硫酸根離子、硝酸根離子，因此，作為殼寡糖的衍生物，殼寡糖鋅不僅施用更安全，對作物和土壤均無不良影響，而且功能更全面、功效更好，又高效地為作物提供了生長必需的鋅元素。施用殼寡糖鋅可顯著提高作物體內(nèi)相關(guān)酶的活性，促進作物光合作用和植株生長，增強作物的抗病能力[32]，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量[33-34]。與已有報道相似，如周林媛等[27]將殼寡糖與鎂鋅混配，可較好抑制煙草花葉病毒(TMV)侵染和提高煙株抗性。王士奎等[13]研究的寡聚酸合鋅(Ⅱ)對煙草病毒病具有較強的防治作用。

為探討殼寡糖鋅在田間的抗病、促生、增產(chǎn)等應(yīng)用可行性，本研究中，首先針對性地選擇了幾種常見的植物細菌性和真菌性病原菌，明確殼寡糖鋅的抑菌效果。研究證明，殼寡糖鋅對所選病原菌的抑菌效果均優(yōu)于市售對照藥劑，其中，對細菌性病原菌的抑菌優(yōu)勢明顯，MIC值較對照藥劑降低50%～75%。同時，MIC值僅為殼寡糖的1/2～1/4。其次，以溫室番茄為供試作物，跟蹤了殼寡糖鋅的田間應(yīng)用效果。結(jié)果表明，噴施殼寡糖鋅的番茄植株發(fā)病數(shù)量較對照組明顯減少，且病情較輕，即殼寡糖鋅對溫室番茄病害防效明顯。同時，殼寡糖鋅促使番茄株高和莖粗增長17.11%和53.89%，番茄果實的可溶性固形物、還原糖、維生素C、鋅含量及固酸比分別增加5.88%、27.88%、51.60%、87.91%、11.90%。其中，鋅含量大幅增加，而番茄酸度降低了5.38%，使番茄品質(zhì)顯著提高，口感明顯提升。除此之外，番茄總產(chǎn)量和一級果產(chǎn)量分別增加23.35%和30.73%，顯著高于對照組，且無二級果和次果。

綜上所述，殼寡糖鋅抗菌譜廣，可有效防治番茄病害，促進番茄植株生長，提高番茄果實品質(zhì)和口感，增加產(chǎn)量。殼寡糖鋅兼具藥肥兩用的功效，且用量少、應(yīng)用成本低、安全環(huán)保、減藥（肥）增效，不易產(chǎn)生抗藥性，具有巨大的開發(fā)價值和市場前景。但仍需在作用機理及應(yīng)用的廣泛性方面做進一步研究。