張雙奇，劉 琳，何念武，趙 穎

（1商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛726000；2丹鳳縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，陜西商洛726000)

0 引言

天麻(Gastrodia elata Bl.)為蘭科天麻屬多年生草本植物，生長(zhǎng)于海拔400～3200 m潮濕冷涼的沙質(zhì)土壤林地，其塊莖可入藥且是中國(guó)的名貴中藥材[1-3]。天麻中的化學(xué)成分主要有酚類(lèi)及其苷類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾醇類(lèi)以及多種氨基酸和人體所需的微量元素等[4-5]。例如天麻素（對(duì)羥甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷）、天麻多糖(GBP-Ⅰ、GBP-Ⅱ)[6]、天麻苷元（對(duì)羥基苯甲醇）、對(duì)羥基苯甲醛、巴利森苷C、巴利森苷A、腺苷、胡蘿卜苷、對(duì)羥芐基乙基醚、對(duì)羥芐基甲醚、β-谷甾醇、棕櫚酸、鄰苯二甲酸二甲酯等[7-8]。

目前的研究結(jié)果表明，天麻素和天麻多糖是天麻主要的有效成分，天麻素具有鎮(zhèn)靜催眠、保護(hù)腦部神經(jīng)和減輕由興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)引起的興奮性毒性作用[9-11]；天麻多糖具有抗氧化性，且可有效延緩骨骼肌衰老[12-13]。目前常用的天麻多糖提取方法主要有熱水浸提法、酶解法及回流醇沉法等，多糖的得率總體為9%～23%[14-15]，而當(dāng)在提取過(guò)程中加入超聲波輔助后，天麻多糖得率可提高到30%[16-17]。

另外有研究結(jié)果表明，由于海拔、溫濕度、光照、土壤等自然條件的限制，不同產(chǎn)地天麻的有效活性成分、水分、粗脂肪、粗纖維等含量存在顯著差異[18-19]。陜西商洛地處中國(guó)中緯度偏南地帶，位于秦嶺南麓，分布在北亞熱帶和暖溫帶交界區(qū)域，平均海拔800～1200 m，土壤有效磷含量為中磷水平且富含有機(jī)質(zhì)[20-21]，因此商洛也屬于高品質(zhì)天麻的主產(chǎn)地之一。商洛天麻的水分、總灰分含量均低于《中國(guó)藥典》（2015年版）標(biāo)準(zhǔn)，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量則達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)的2.5倍以上[22]，但針對(duì)商洛天麻的理化特性而進(jìn)行的研究非常少，故本文以商洛春麻為原材料，以超聲波輔助熱水浸提法對(duì)天麻多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，再進(jìn)行天麻多糖的體外抗氧化活性的研究，以期為商洛當(dāng)?shù)靥炻榈纳罴庸ぬ峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻，購(gòu)于陜西商洛（經(jīng)鑒定為蘭科天麻屬腐生草本植物）。DPPH（上海源葉生物科技有限公司）；抗壞血酸（北京索萊寶科技有限公司）；苯酚、乙醇、濃硫酸、三氯甲烷、葡萄糖、水楊酸鈉、亞硫酸亞鐵等均為分析純?cè)噭?。該試?yàn)于2019年11月—2020年4月，在商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)（KH-300DE，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司），紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T2600，上海佑科儀器儀表有限公司），高速離心機(jī)（HC-3018，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），多功能粉碎機(jī)（ME204E，濟(jì)南安環(huán)醫(yī)療器械有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-301，上海況勝科技有限公司），電子分析天平（GL1004C，上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.3 提取工藝優(yōu)化方法

1.3.1 提取方法 本試驗(yàn)在借鑒已有提取方法的基礎(chǔ)上，提出了超聲波輔助熱水浸提法，具體流程見(jiàn)圖1。

圖1 超聲波輔助熱水浸提流程

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法。分別吸取1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6、7 mL定容至50 mL備用，分別量取1 mL上述容液于不同錐形瓶中，各加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，40℃水浴20 min，在490 nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 天麻多糖含量的測(cè)定 量取1.3.1節(jié)方法中制得的天麻粗多糖樣品，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的天麻粗多糖溶液，按照1.3.2節(jié)方法測(cè)定吸光度，按照公式(1)計(jì)算天麻多糖含量[23]。

其中P為天麻多糖含量(mg/g)，C為樣品溶液中天麻多糖質(zhì)量濃度(μg/mL)，V為樣品定容體積(mL)，M為原料質(zhì)量(g)。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)以料液比(1:25、1:30、1:35、1:40、1:45)、水提溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、水提時(shí)間(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min)作為主要影響因子，并在每個(gè)因素中篩選效果顯著的3個(gè)水平量，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，分析得出超聲波輔助熱水浸提法提取天麻多糖的最優(yōu)參數(shù)。

1.4 體外抗氧化活性測(cè)定方法

1.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 取1 mL不同質(zhì)量溶度的樣品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)分別放于試管1、2、3、4、5、6、7中，然后依次加入3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液，充分混勻，避光靜置20 min后，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A，以乙醇代替樣品為空白對(duì)照測(cè)得吸光度A0，以無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液測(cè)得吸光度A1，Vc作陽(yáng)性對(duì)照，再按照公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率[24]。

其中D為DPPH自由基清除率，A為3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液+1 mL樣品溶液的OD值；A1為3 mL無(wú)水乙醇+1 mL樣品溶液的OD值；A0為3 mL無(wú)水乙醇+1 mL無(wú)水乙醇的OD值。

1.4.2 羥基自由基清除能力測(cè)定 利用Feton體系法測(cè)定，取1 mL不同質(zhì)量溶度的樣品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)分別放于試管1、2、3、4、5、6、7中，依次加入10 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液、10 mmol/L亞硫酸亞鐵溶液、8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各1 mL，充分混勻，于37℃下恒溫水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后于510 nm處測(cè)定樣品吸光值A(chǔ)。以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)得A0，以蒸餾水代替過(guò)氧化氫溶液測(cè)得A1，按照公式(3)計(jì)算羥基自由基清除率[25]。

其中E為羥基自由基清除率，A為1 mL樣品溶液+1 mL水楊酸鈉-乙醇溶液+1 mL亞硫酸亞鐵溶液+1 mL過(guò)氧化氫溶液；A1為1 mL樣品溶液+1 mL水楊酸鈉-乙醇溶液+1 mL亞硫酸亞鐵溶液+1 mL蒸餾水；A0為1 mL蒸餾水+1 mL水楊酸鈉-乙醇溶液+1 mL亞硫酸亞鐵溶液+1 mL過(guò)氧化氫溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=0.0094x-0.0232，R2=0.9973，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)天麻多糖提取率的影響 料液比對(duì)天麻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。在提取溫度為60℃，提取時(shí)間為40 min時(shí)，提取率隨液料比的增大呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，在料液比為1:40 g/mL多糖提取率達(dá)到峰值?？赡苁且?yàn)殡S著溶劑的增大，天麻粉末與溶劑的接觸面積變大，導(dǎo)致可溶性多糖溶出比率升高，但當(dāng)料液比超過(guò)1:40 g/mL后，溶液已達(dá)飽和，故溶出比率提升不明顯[26]，故初步確定料液比為1:40 g/mL。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.2.2 水提溫度對(duì)天麻多糖提取率的影響 水提溫度對(duì)天麻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。在提取時(shí)間為35 min，料液比為1:40 g/mL的條件下，提取率隨溫度的增加而增加，但在溫度高于60℃后，提取率增加趨于平緩。隨著水提溫度的升高，多糖的溶解度逐步增大，但溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致多糖的糖鏈斷裂，致使多糖難于回收[27]，故初步確定水提溫度為60℃。

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3 水提時(shí)間對(duì)天麻多糖提取率的影響 水提時(shí)間對(duì)天麻多糖提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。在提取溫度為60℃，料液比為1:40 g/mL的條件下，提取率隨時(shí)間的增加而增加，但在提取時(shí)間大于40 min后，提取率增加效果不顯著。多糖長(zhǎng)時(shí)間處于高溫提取環(huán)境下，可能會(huì)發(fā)生多糖的降解，造成多糖雜質(zhì)較多[28]，故初步確定水提時(shí)間為40 min。

圖5 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 因素與水平的確定 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)影響超聲波輔助熱水浸提法提取天麻多糖工藝的最優(yōu)參數(shù)，并以其作研究對(duì)象，以提取率作研究指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.3.2 正交試驗(yàn)分析 以通過(guò)公式(1)得到的天麻多糖含量為研究指標(biāo)，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，對(duì)于超聲波輔助法提取天麻多糖的影響最大的因素依次為料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(A)。

表2 超聲波輔助提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 方差分析 超聲波輔助法提取天麻多糖正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，A因素(F0.05＜F＜F0.01)為有顯著意義，B和C因素(F0.1＜F＜F0.05)為較顯著意義。故根據(jù)k的變化率可得到各因素的優(yōu)先順序?yàn)锳＞C＞B，即最優(yōu)工藝組合為提取溫度取65℃，料液比為1:40 g/mL，提取時(shí)間為45 min。

表3 方差分析表

2.4 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果 由表4可以看出，在一定濃度下，天麻多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨著天麻多糖溶液濃度的增大而逐漸提高，當(dāng)天麻多糖溶液濃度變?yōu)?.5 mg/mL時(shí)，天麻多糖粗提物的清除率達(dá)到38.63%，天麻多糖的清除率達(dá)到40.52%，說(shuō)明天麻多糖含量在一定范圍內(nèi)有良好的清除DPPH自由基的效果。

表4 DPPH自由基清除能力結(jié)果

2.4.2 清除羥基自由基能力測(cè)定結(jié)果 由表5可得，在一定濃度下，隨著天麻多糖溶液濃度的增大，其羥基自由基清除效果也隨之增強(qiáng)，當(dāng)天麻多糖溶液濃度變?yōu)?.5 mg/mL時(shí)，天麻多糖粗提物的清除率最高達(dá)到30.36%，天麻多糖的清除率能達(dá)到36.52%。說(shuō)明天麻多糖含量在一定范圍內(nèi)有良好的清除羥基自由基的效果。

表5 羥基自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用熱水浸提法并以超聲波粉碎進(jìn)行輔助，通過(guò)單因素分析法設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間為45 min、液料比為1:40 g/mL、提取溫度為65℃時(shí)，天麻多糖的含量最高，可達(dá)32.83 mg/g，遠(yuǎn)高于采用回流醇沉法提取的云南昭通天麻多糖含量(25.04 mg/g)、陜西略陽(yáng)天麻多糖含量(23.46 mg/g)、四川汶川天麻多糖含量(23.41 mg/g)、貴州青龍?zhí)炻槎嗵呛?20.67 mg/g)、湖北神農(nóng)架天麻多糖含量(20.28 mg/g)[29]，但略低于同樣采用超聲波輔助法提取的貴州省德江天麻多糖含量(33.4 mg/g)[30]，這說(shuō)明在合適的工藝條件下，超聲波輔助熱水浸提法可顯著優(yōu)化商洛天麻多糖的提取工藝。

本試驗(yàn)分別采用DPPH法和Feton體系法測(cè)定天麻多糖的DPPH自由基和羥基自由基的清除效率，并以此分析判斷天麻多糖的體外抗氧化活性能力。其試驗(yàn)結(jié)果顯示，天麻多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有一定的清除作用，且清除能力與濃度成正比。當(dāng)天麻多糖溶液濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基分別達(dá)到40.52%和36.52%，這說(shuō)明天麻多糖具有良好的體外抗氧化能力。但這個(gè)結(jié)果略低于陳琛采用酶提法提取的天麻多糖的體外抗氧化指標(biāo)（DPPH自由基44.5%，羥基自由基39.5%）[31]。這可能是因?yàn)槎嗵堑纳锘钚耘c其結(jié)構(gòu)性質(zhì)具有一定的相關(guān)性，而本試驗(yàn)中的超聲波處理和加熱導(dǎo)致多糖的部分糖鏈斷裂，進(jìn)而改變了部分多糖的結(jié)構(gòu)和分子量，影響了其體外抗氧化活性[32]。

綜上所述，與熱水浸提法、酶提法及回流醇沉法等方法相比，超聲波輔助熱水浸提法可顯著提升商洛產(chǎn)天麻的多糖提取率，達(dá)32.83 mg/g。另外，本方法提取的天麻多糖具有一定的體外抗氧化活性，當(dāng)溶液濃度為3.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基分別達(dá)到40.52%和36.52%。