高宇豪,吳勇杰,朱亞鑫,付靜,徐建國(guó),王松濤,徐國(guó)強(qiáng),張曉梅,史勁松,許正宏

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 3(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 4(江南大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 5(無錫福祈制藥有限公司,江蘇 無錫,214100)

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種三肽活性物質(zhì),廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中,具有保護(hù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的作用[1]。GSH相對(duì)分子質(zhì)量為307.33,由谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸組成,在各種生物的體內(nèi)含量各不相同,其中在酵母和動(dòng)物內(nèi)臟中含量較高。GSH在肝病、腎病以及心血管疾病上都具有顯著的療效[2]。GSH的主要特征是其具有一個(gè)γ酰胺鍵和一個(gè)巰基基團(tuán)。在大多數(shù)原核和真核生物中由兩步反應(yīng)生成,第一步由谷氨酸和半胱氨酸在谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用下生成谷氨酰半胱氨酸,之后該產(chǎn)物再與甘氨酸在谷胱甘肽合成酶(GS)的作用下反應(yīng)生成GSH,第一步反應(yīng)的酶是生成GSH的關(guān)鍵酶,受產(chǎn)物的反饋抑制,兩步酶皆是ATP依賴型,反應(yīng)均需消耗1分子的ATP[3]。

目前,GSH合成方法有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法采用3種前體利用化學(xué)工藝合成GSH,成本高昂且對(duì)環(huán)境造成污染[4]。酶法采用3種前體、ATP及酶反應(yīng)生成GSH,此法核心是篩選出具有高活性的合成酶,但成本高[5-7]。發(fā)酵法是微生物利用廉價(jià)的原料生產(chǎn)積累高濃度的GSH,然后分離純化,成本低、純度高、無污染,是目前生產(chǎn)GSH的主要方法[8]。通常采用誘變或者基因工程來提高酶的活性,或通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高前體的利用[9-11]。由于酵母中GSH含量較高,遺傳背景清晰,所以經(jīng)常被用作生產(chǎn)GSH的優(yōu)良宿主。半胱氨酸是提高GSH的關(guān)鍵氨基酸，但在進(jìn)行高密度發(fā)酵生產(chǎn)時(shí),細(xì)胞通過代謝合成的半胱氨酸遠(yuǎn)不能滿足GSH合成的需要[10]。因此,外源添加半胱氨酸是一種有效策略,也確實(shí)實(shí)現(xiàn)了GSH的大規(guī)模生產(chǎn)[12]。然而當(dāng)半胱氨酸添加過量時(shí),使得充當(dāng)能量載體的ATP成為GSH生產(chǎn)的限制因素。

為解決此問題,研究人員通過在培養(yǎng)基中直接添加能量代謝底物或是通過代謝改造提高胞內(nèi)ATP的再生來提高胞內(nèi)GSH或是其余高耗能生物產(chǎn)物的積累[13-16]。GSH的合成一個(gè)巨大的耗能反應(yīng),高密度發(fā)酵的方式使ATP成為關(guān)鍵的限制因素。畢赤酵母是重組蛋白表達(dá)的優(yōu)良宿主,由于其較易實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵且具有食品安全級(jí)狀態(tài),近些年來常用作生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)為獲得高產(chǎn)GSH的畢赤酵母菌株,通過在畢赤酵母GS115中異源表達(dá)來自釀酒酵母的Scgsh1(編碼γ-GCS)和Scgsh2(編碼GS)以增強(qiáng)其合成路徑,在添加前體物質(zhì)的條件下獲得了GSH的過量積累,之后對(duì)輔能量底物檸檬酸鈉的條件進(jìn)行了優(yōu)化,并進(jìn)行放大發(fā)酵驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

菌株：PichiapastorisGS115、SaccharomycescerevisiaeBY4741、質(zhì)粒擴(kuò)增保藏菌株EscherichiacoliJM109。均來自實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保藏。

質(zhì)粒和引物：pPIC3.5K來自本實(shí)驗(yàn)室保藏,構(gòu)建所用質(zhì)粒皆為本課題組在此基礎(chǔ)上構(gòu)建。Scgsh1基因(Gene ID:853344)和Scgsh2基因(Gene ID:854108)經(jīng)S.cerevisiaeBY4741基因組PCR擴(kuò)增后獲取,載體構(gòu)建成功后的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)提取質(zhì)粒送去天霖生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序結(jié)果與NCBI上序列一致的重組質(zhì)粒將用于后續(xù)菌株的構(gòu)建。所用引物皆為金唯智生物科技公司合成,如表1所示。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶和試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶,Takara公司；ATP含量測(cè)定試劑盒,碧云天生物技術(shù)。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10；固體另加2 g/L的瓊脂。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨20；固體另加2 g/L的瓊脂。

MD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20,YNB 13.4；固體另加2 g/L的瓊脂。

種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基,搖瓶水平的發(fā)酵培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基。

YPDZ培養(yǎng)基(g/L)：在YPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,加入Zeocin使之質(zhì)量濃度為100 μg/L。

上罐培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50,酵母粉 5,(NH4)2SO411,K2HPO47,MgSO45,CaCl20.5,KCl 0.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建方法

構(gòu)建以PGAP為啟動(dòng)子、TAOX1為終止子的組成型表達(dá)菌株。首先以GAP-F/GAP-R為引物擴(kuò)增出基因組上的PGAP啟動(dòng)子序列。采用SacI及BamH I酶切pPIC 3.5K以去除PAOX1片段并用PGAP序列代替得到組成型表達(dá)的質(zhì)粒,將其命名為pPICKT。以S.cerevisiaeBY4741的基因組為模板,分別以GSH1F/GSH1R、GSH2F/GSH2R PCR擴(kuò)增出目的基因Scgsh1和Scgsh2片段連接至pPICKT中,構(gòu)成P1和P2質(zhì)粒。后用G1F/G1R和TF/TR分別擴(kuò)增P1質(zhì)粒上的PGAP-Scgsh1與TAox1片段,后采用諾唯贊C113多片段同源重組連接試劑盒連接入P2質(zhì)粒中,獲得同時(shí)含有Scgsh1和Scgsh2表達(dá)單元的質(zhì)粒pP-PGAP-Scgsh1-Scgsh2,即P3質(zhì)粒。以上構(gòu)建質(zhì)粒過程均轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中,在含有100 mg/L的氨芐青霉素LB抗性平板上進(jìn)行篩選,獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證及測(cè)序,得到正確的轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 電轉(zhuǎn)化及篩選方法

將質(zhì)粒pP-PGAP、P1及P3均用SalI線性化后采用根據(jù)手冊(cè)(Invitrogen)通過電轉(zhuǎn)法將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母,涂布于含有組氨酸缺陷型的MD平板,于30 ℃下孵育2～3 d。將長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)至高質(zhì)量濃度G418(4 mg/mL)中,長(zhǎng)出的較大的菌落并提交基因組驗(yàn)證后即可獲得含有高拷貝基因數(shù)的目的菌株。

1.2.3 培養(yǎng)方法

搖瓶發(fā)酵：種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均為YPD培養(yǎng)基。將菌株從甘油管挑至YPD平板上劃線,30 ℃培養(yǎng)2～3 d,長(zhǎng)出的單菌落挑至含有10 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中,30 ℃培養(yǎng)16～18 h,之后以適當(dāng)?shù)臐舛冉臃N至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

發(fā)酵罐發(fā)酵：將種子培養(yǎng)基培養(yǎng)16～18 h,以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接入100 L發(fā)酵罐中。待培養(yǎng)基pH降至5.5時(shí),流加50%氨水使發(fā)酵過程的pH始終維持在5.5。1 L培養(yǎng)基中含有10 mL PTM1,待初始培養(yǎng)基中的糖降至5 g/L時(shí),補(bǔ)加700 g/L的葡萄糖,使乙醇質(zhì)量濃度始終在3 g/L以下。當(dāng)發(fā)酵液OD600達(dá)到250,即發(fā)酵48 h時(shí),投料終濃度為10 mmol/L氨基酸前體混合液。定時(shí)取樣,測(cè)生物量、GSH質(zhì)量濃度、甘油、還原糖及乙醇質(zhì)量濃度。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)方法

生物量檢測(cè)：取適量檢測(cè)點(diǎn)的樣品稀釋至OD600值為0.2～0.8,于600 nm處測(cè)取吸光度。

GSH提取及檢測(cè)：將發(fā)酵液進(jìn)行12 000 r/min離心2 min以收集菌體。超純水振蕩懸浮2次以去除培養(yǎng)基的影響。采用40%乙醇提取,30 ℃ 220 r/min振蕩孵育2 h,8 000 r/min離心5 min,即得到富含GSH的上清液。GSH的檢測(cè)采用Alloxan法[17]。

ATP含量檢測(cè)：取適量16、20、24和28 h樣品,離心后用pH 6的Tris-HCl溶液振蕩懸浮2次,超聲破碎,上清液采用ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ATP[18]。

甘油、乙醇、還原糖檢測(cè)：離心后的上清液用SBA-40D檢測(cè)乙醇質(zhì)量濃度,使用西爾曼生物傳感器測(cè)甘油含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Scgsh1單獨(dú)表達(dá)及Scgsh1與Scgsh2共表達(dá)對(duì)畢赤酵母積累GSH的影響

2.1.1 釀酒酵母Scgsh1和Scgsh2的克隆

為獲得釀酒酵母谷氨酰半胱氨酸合成酶基因Scgsh1及谷胱甘肽合成酶基因Scgsh2,以釀酒酵母BY4741基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖1-a、圖1-b所示。產(chǎn)物回收后送至天霖生物科技有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI上序列(Gene ID:853344、Gene ID:854108)進(jìn)行比對(duì),序列完全一致,因此得到Scgsh1和Scgsh2的基因序列,按照1.2.1小節(jié)進(jìn)行菌株構(gòu)建。

2.1.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建

將pPIC3.5KT、pPIC3.5KT-Scgsh1、pPIC3.5KT-Scgsh1-Scgsh2線性化電轉(zhuǎn)至GS115中,使其整合在his4基因處,將其分別命名為G1、G2、G3。由于整合至基因組的質(zhì)粒帶有卡那抗性基因而使目的菌株帶有G418抗性,且隨著整合拷貝數(shù)的增加,菌株抗G418的能力越強(qiáng)。為此,將在組氨酸缺陷型平板上長(zhǎng)出的單菌落點(diǎn)板至高質(zhì)量濃度的G418(4 mg/mL)中,長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子經(jīng)提基因組驗(yàn)證正確后即為目的菌株。提取高抗G418菌株的基因組,分別采用YZGF、YZGR和YZGGF、YZGGR引物驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果如圖1-c、1-d所示,從NCBI數(shù)據(jù)庫得知Scgsh1和Scgsh2大小分別為2 037和1 476 bp,采用設(shè)計(jì)的驗(yàn)證引物從G2、G3基因組PCR理論應(yīng)得到2 240 bp和2 964 bp片段,電泳結(jié)果證明基因已整合入基因組中。

a-M-5 kb marker；1,2-Scgsh1基因PCR擴(kuò)增;b-M-5 kb marker；1,2-Scgsh2基因PCR擴(kuò)增;c-M-5 kb marker；1,2-G2菌株提基因組驗(yàn)證引物驗(yàn)證;d-M-5 kb marker；1,2-G3菌株提基因組驗(yàn)證引物驗(yàn)證圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增電泳圖和重組菌基因組驗(yàn)證圖Fig.1 Electrophoresis map of the target gene amplified by PCR and verification map of recombinant strain genome

2.1.3 重組菌發(fā)酵特性評(píng)價(jià)

對(duì)GS115、G1、G2、G3進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖2所示。從菌株生長(zhǎng)來看,菌株皆在20 h達(dá)到穩(wěn)定期。G1、G2、G3最高生物量較對(duì)照GS115分別提高6%、5.61%、10.7%,可能的原因是質(zhì)粒的整合彌補(bǔ)了GS115組氨酸缺陷的影響,且畢赤酵母在好氧發(fā)酵過程中胞內(nèi)氧化壓力較大,GSH的過量合成也可協(xié)調(diào)胞內(nèi)的氧化還原平衡。工程菌G2、G3在30 h的產(chǎn)量達(dá)到最高,G2菌株在發(fā)酵30 h 后的GSH質(zhì)量濃度為(120.47±0.61) mg/L,相較于GS115(61.52±0.31) mg/L提高了1.95倍。G3菌株發(fā)酵30 h后的 GSH質(zhì)量濃度為(141.96±2.15) mg/L,產(chǎn)量相較對(duì)照提高2.31倍。工程菌GSH在細(xì)胞內(nèi)的得率也獲得提高,G2、G3 最高達(dá)到4.48和5.07 mg/OD,較對(duì)照GS115(2.52 mg/OD)分別提高1.77倍和2.01倍。相比G2菌株而言,G3菌株GSH產(chǎn)量的提高幅度有限,其一可能是由于Scgsh1編碼的γ-GCS是GSH合成過程中的關(guān)鍵酶,對(duì)GSH的合成起決定性作用,GSH的過量積累會(huì)對(duì)其造成反饋抑制[19]。其二可能是胞內(nèi)3種前體的供應(yīng)不足,導(dǎo)致GSH的合成效率受限。

a-生物量；b-GSH質(zhì)量濃度；c-GSH得率；d-添加氨基酸前體時(shí)菌株發(fā)酵結(jié)果圖2 重組菌株搖瓶發(fā)酵性能圖Fig.2 Fermentation performance by recombinant strain

為提高GSH的合成效率,在發(fā)酵0 h時(shí)添加了終濃度為10 mmol/L的甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸的混合液。從圖2-d中可以看出氨基酸前體的加入對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定抑制作用,可能是前體物質(zhì)中的半胱氨酸對(duì)菌株有毒害作用所致,但前體的加入確實(shí)極大程度提高了菌體合成GSH的能力,這也與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[20]。在發(fā)酵30 h,G2、G3菌株產(chǎn)量分別達(dá)至(261.66±21.7)和(302.27±5.06)mg/L,較對(duì)照(104.96±3.19) mg/L分別提高2.49倍和2.88倍,且G3菌株胞內(nèi)GSH得率提升至11.79 mg/OD,故以G3為目的菌株做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 輔能量底物檸檬酸鈉對(duì)G3菌株積累GSH的影響

外源添加氨基酸前體是提高GSH產(chǎn)量有效手段,且上面實(shí)驗(yàn)結(jié)果也已證實(shí)。但外源氨基酸前體的過量添加會(huì)使得ATP成為主要的限制性因素。從外源直接添加不失為一種有效手段,但對(duì)于工業(yè)上的放大發(fā)酵是不經(jīng)濟(jì)的。在這里,我們外源添加廉價(jià)的輔能量底物檸檬酸鈉,探究能量對(duì)菌體合成GSH的影響,結(jié)果如圖3-a、3-b所示。

檸檬酸鈉的加入對(duì)G3菌株的生長(zhǎng)無明顯影響,對(duì)于菌株發(fā)酵產(chǎn)GSH有促進(jìn)作用,對(duì)檸檬酸鈉的添加時(shí)間及質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳添加時(shí)間為12 h,添加質(zhì)量濃度為4 g/L,產(chǎn)量由(308.97±5.51) mg/L提升至(371.12±8.47) mg/L,提升20.1%,得率最高可達(dá)到14.41 mg/OD,較添加前提高13.41%。

a-檸檬酸鈉添加時(shí)間優(yōu)化;b-檸檬酸鈉添加濃度優(yōu)化;c-胞內(nèi)ATP的變化曲線圖3 檸檬酸鈉添加對(duì)胞內(nèi)GSH和ATP含量影響圖Fig.3 Effect of sodium citrate addition on intracellular GSH and ATP content

之后探究了檸檬酸鈉添加后對(duì)胞內(nèi)ATP含量的影響,結(jié)果如圖3-c所示,添加檸檬酸鈉后菌株16～28 h內(nèi)胞內(nèi)的ATP的含量均比對(duì)照要高,這是由于檸檬酸鈉的加入,強(qiáng)化了三羧酸循環(huán)路徑,從而提高胞內(nèi)ATP的含量。其中在ATP含量20 h達(dá)到了最高值,之后迅速下降,這可能是由于在此時(shí)期菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期,此時(shí)大量的GSH被合成,消耗了大量的ATP。綜上,搖瓶中檸檬酸鈉的添加在一定程度上解除了氨基酸過量情況下ATP不足的限制。

2.3 重組菌株上罐發(fā)酵驗(yàn)證

為進(jìn)一步提高GSH產(chǎn)量,作者在100 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件下開展了畢赤酵母工程菌的罐上發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。由于氨基酸前體溶液的添加對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定抑制作用,在這里采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式先提高菌體生物量后單次補(bǔ)加前體混合液的兩階段合成GSH。發(fā)酵結(jié)果如圖4所示,全程控制乙醇含量調(diào)控補(bǔ)料速率,使乙醇含量始終在3 g/L以下。

圖4 G3菌株在100 L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵性能Fig.4 Fermentation profile of G3 in 100 L fermentor

酵母發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇時(shí),甘油是作為NAD+再生的主要副產(chǎn)物存在[21]。GSH是胞內(nèi)的協(xié)調(diào)氧化還原平衡的物質(zhì),為此,我們?cè)诎l(fā)酵過程中檢測(cè)甘油的含量,發(fā)酵液中甘油的含量始終在0.3 g/L,也就是說甘油并不是GSH合成時(shí)的主要副產(chǎn)物。G3菌株菌體生物量在40 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,在48 h到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期,此時(shí)的生物量OD600達(dá)到257,較搖瓶發(fā)酵水平的生物量OD600(28.4)提高9.05倍,同時(shí)葡萄糖在16 h時(shí)被迅速消耗盡,剩余量為0.36 g/L。GSH作為初級(jí)代謝產(chǎn)物伴隨菌體生長(zhǎng)積累,在投料氨基酸前體混合液之前在48 h達(dá)到728 mg/L。在此時(shí)投料氨基酸溶液,GSH的合成效率迅速增加,在68 h時(shí)GSH的產(chǎn)量達(dá)至最高為2 000 mg/L,較搖瓶水平最高產(chǎn)量(302.27 mg/L)提高了6.62倍。以上結(jié)果顯示,兩階段合成法對(duì)促進(jìn)GSH的產(chǎn)生有顯著作用。WANG等[20]通過控制呼吸熵優(yōu)化葡萄糖的補(bǔ)料速率,實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)與合成分開,使GSH含量顯著提高,本文的研究結(jié)果也與之相似。

3 結(jié)論

巴斯德畢赤酵母作為蛋白質(zhì)表達(dá)的強(qiáng)大系統(tǒng)而受到廣泛的關(guān)注。除蛋白質(zhì)外,近些年還用于生產(chǎn)其他增值產(chǎn)品,例如類胡蘿卜素、維生素K2等等,從而證明了巴斯德畢赤酵母從單個(gè)基因的有效表達(dá)已擴(kuò)展到合成途徑的表達(dá),以生產(chǎn)附加值高的化合物[22-23]。本研究以畢赤酵母GS115為宿主菌株,異源整合表達(dá)來源于釀酒酵母BY4741的Scgsh1及Scgsh2基因,從而強(qiáng)化了GSH在畢赤酵母中的合成路徑,再添加前體氨基酸的條件下使GSH的產(chǎn)量由(104.69±3.19) mg/L提升至(302.27±5.06) mg/L,且細(xì)胞內(nèi)的得率也大幅提高。之后為減輕氨基酸前體過量時(shí)能量的限制,采用添加輔能量底物檸檬酸鈉的策略,GSH產(chǎn)量進(jìn)一步提升至(371.12±8.47) mg/L。為進(jìn)一步提高GSH產(chǎn)量,采用了100 L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵,并控制乙醇質(zhì)量濃度優(yōu)化補(bǔ)糖速率,進(jìn)而使OD600最高可達(dá)至257,最高產(chǎn)量可達(dá)2 000 mg/L,較搖瓶水平分別提高9.05倍和6.62倍。綜上可以看出GSH合成路徑的強(qiáng)化及能量供應(yīng)對(duì)提升菌體內(nèi)GSH的積累具有顯著作用,同時(shí)也為內(nèi)源性代謝改造提升胞內(nèi)能量供應(yīng)促進(jìn)GSH積累提供了思路和理論基礎(chǔ)。但本研究尚未解除GSH過量積累對(duì)谷胱甘肽合成酶系的反饋抑制,今后將著重探究調(diào)控胞內(nèi)能量代謝及解除GSH對(duì)胞內(nèi)合成酶系的反饋抑制對(duì)GSH積累的影響。