瘤背石磺FMRFamide基因的克隆、分析及其在炎癥刺激下的表達變化

李稱奇，土志涵，吳榮宇，趙楓燊，賈晶晶，沈和定

（上海海洋大學水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室/水產科學國家級實驗教學示范中心/海洋動物系統(tǒng)分類與進化上海高校重點實驗室，上海 201306）

神經肽是從神經系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)產生和釋放，參與調節(jié)生物個體的生理活動，維持生物體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一類重要信號因子，是NEI系統(tǒng)中最重要的調節(jié)因子之一，在脊椎和無脊椎動物中均有免疫調節(jié)功能。其中FMRFamide (Phe-Met-Arg-Pheamide) 是一種酰胺化四肽，是類 FMRF酰胺肽(FMRFarmide-related peptides, Farps或FMRFamide-like peptide, FLPs) 家族的成員。其在神經系統(tǒng)中合成并釋放，能通過神經元直接傳遞信號，并作為神經遞質、神經調質和神經激素發(fā)揮作用[1]，是無脊椎動物中含量最豐富的一類神經肽[2]。此外，該神經肽也能通過內分泌系統(tǒng)調節(jié)攝食和運動行為[3]。近年來，FMRFamide的生理功能受到普遍關注，如Marciniak等[4]研究發(fā)現其具有特異性的心臟活性，能有效調節(jié)甲蟲內臟肌肉的內源性收縮活性。Kim等[5]研究皺紋盤鮑 (Haliotis discus hannai) 發(fā)現，FMRFamide神經肽對海洋腹足類動物生殖調節(jié)有重要促進作用。FMRFamide也被發(fā)現能夠通過抑制有絲分裂來保護細胞免受凋亡[6]。而作為無脊椎動物中特有的神經肽，一些研究也表明其可能參與了海洋無脊椎動物的免疫應答。如Li等[7]通過對太平洋牡蠣 (Crassostrea gigas) 炎癥刺激后的FMRFanide多肽治療，發(fā)現FMRFamide多肽不僅由神經內分泌系統(tǒng)合成，而且還在血細胞中合成加工，首次證實了該多肽存在于血細胞中。Guan等[8]對加利福尼亞海兔 (Aplysia california) 的研究發(fā)現FMRFamide可以通過激活P38絲裂原激活蛋白 (MAP) 激酶來調節(jié)突觸的可塑性和調節(jié)免疫效應物。

瘤背石磺 (Onchidium reevesii) 隸屬于軟體動物門、石磺科，又名土雞、海賴子、涂龜、土海參等[9-10]，常棲息在灘涂上的石縫中、植被的根部和陰暗潮濕的角落，主要分布于我國東部沿海地區(qū)[11-12]。瘤背石磺的中樞神經系統(tǒng) (Central nervous system, CNS) 是一個簡單的環(huán)狀結構，體積大且易獲得[13]。瘤背石磺不僅是研究無脊椎動物神經系統(tǒng)功能的模式種，而且由于其生活在潮間帶，有良好的應激耐受機制，能適應波動的生存環(huán)境、各種重金屬離子和病原體[14]，對于研究無脊椎動物應對外界環(huán)境變化和病原入侵的免疫反應機制也有顯著優(yōu)勢。為此，本研究在實驗室瘤背石磺高通量轉錄組測序的基礎上克隆得到了OrFMRFamide基因的全長，分析該基因的分子特征及其mRNA和多肽在組織中的分布，研究其在炎癥刺激后的反應，從而為探究FMRFamide基因在瘤背石磺免疫機制中的作用提供了理論依據，也為進一步理解生活在潮間帶的兩棲類動物對惡劣環(huán)境的適應機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2020年6月初在江蘇省鹽城市沿海灘涂采集成體鮮活瘤背石磺，帶回實驗室后暫養(yǎng)于70 cm×120 cm×50 cm的塑料養(yǎng)殖箱內，養(yǎng)殖箱底部覆蓋5～10 cm厚的海泥，種植灘涂采集的植被，放上瓦片，放養(yǎng)灘涂捕捉的螃蟹在泥中打洞，為石磺提供休息躲避的巢穴，盡可能地模擬自然生態(tài)環(huán)境，消除實驗外干擾。每天早晚定時投喂玉米粉和噴灑海水保持土壤濕潤，定期檢查瘤背石磺生長狀況，以確保其較高的成活率。暫養(yǎng)1周后，取5只體態(tài)均勻、健康有活力的瘤背石磺 [ 體長 (43.55±1.32) mm，體質量 (15.73±0.78) g]，用超純水清洗表面的泥沙，取血細胞、神經節(jié)、肝胰腺、肌肉、性腺、皮膚和腹足等組織用液氮速凍后放入–80 ℃冰箱備用，用于組織cDNA模板的制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 實驗所用器皿均經180 ℃高溫殺菌處理3 h或使用DEPC處理過后進行高壓滅菌。實驗開始前將所有器材預冷備用，全程在冰上操作，取–80 ℃保存的瘤背石磺各組織，按照Trizol (Invitrogen, 美國) 說明書提取各組織的總RNA。配制質量濃度為10 mg·mL?1的瓊脂糖凝膠，135 V、電泳15 min檢測RNA提取質量，在核酸檢測儀上標定提取RNA的濃度和純度。將神經節(jié)RNA按照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa) 說明書合成cDNA第一鏈，作為后續(xù)實驗的RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 模板。將提取所得的各組織RNA按照 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa) 試劑盒說明書進行反轉錄，將獲得的cDNA于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2OrFMRFamide基因的克隆 根據筆者實驗室測得的轉錄組數據庫 (未發(fā)表) 篩選得到目的基因的部分基因片段，使用Primer Premier 5.0軟件設計2對引物，進行PCR擴增反應，反應產物用10 mg·mL?1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用D2000 Ladder作為Maker，產物條帶單一且清晰，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，測序結果在NCBI上BLAST比對，確認為FMRFamide基因片段，然后按照SMARTER? RACE5'/3'Kit及3'Full RACE Core Set With PrimerScriptTMRTase試劑盒的說明書在Primer Premier 5.0軟件上設計5'和3' RACE特異性引物，通過RACE技術得到產物，產物經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序，將所得到的全部測序結果通過Sequebcher 5.0軟件拼接得到OrFMRFamide基因的序列全長。

1.2.3OrFMRFamide基因的序列分析 把拼接得到的基因序列全長在NCBI上用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 在線工具對Or-FMRFamide基因開放閱讀框 (Open reading frame,ORF) 及編碼氨基酸進行預測，得到預測的編碼氨基酸后在NCBI上用在線工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進行同源性比較，使用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 在線工具確定糖基化位點，理化性質用 ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 在線工具分析，使用NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos–2.0/) 在線工具查找磷酸化位點，使用Signal 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 在線工具查找信號肽。用MEGA-X軟件基于比鄰法，以1 000次Bootstraps構建瘤背石磺與其他物種FMRFamide基因的系統(tǒng)進化樹。

1.2.4OrFMRFamide基因在不同組織中的表達 通過在線工具Genscrip (https://www.genscript.com/tools/real–time–pcr–taqman–primer–design–tool)根據OrFMRFamide基因全長序列設計熒光定量引物 (表1)，以18S作為內參基因，以上述驗證過的瘤背石磺各組織cDNA為模板，使用 ChamQ Uni-versal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme，美國) 試劑盒在CFX-96 (Bio-Rad，美國) 進行熒光定量反應，每個樣品和內參都設置3個平行對照，以Rnasefree雙蒸水 (ddH2O) 為陰性對照，實時熒光定量PCR 數據用 2–ΔΔCT法進行分析。

1.2.5 免疫組織化學分析 免疫組織化學取養(yǎng)殖箱暫養(yǎng)未經處理的5只瘤背石磺進行實驗。采集未經處理的新鮮的神經節(jié)、肝胰腺、性腺、腹足、肌肉和皮膚，用4%的多聚甲醛固定6 h，轉移至20%的蔗糖溶液固定過夜，然后轉移至40%的蔗糖溶液固定到組織沉底，使用冰凍切片機 (萊卡CM1950)切片后貼在黏附載玻片上，按照一步法免疫組化試劑盒 (凱基) 說明書完成免疫組化實驗，用顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 LPS刺激 在養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)7 d后隨機選取100只瘤背石磺，平均分為2組，暫養(yǎng)在2個養(yǎng)殖箱中，分別給每只瘤背石磺注射100 μL磷酸鹽緩沖溶液 (Phosphate buffered saline, PBS) 和 100 μL脂多糖 (LPS, 0.5 mg·mL–1，溶于 PBS)，經處理的瘤背石磺分別放回養(yǎng)殖箱暫養(yǎng)，分別在注射后第0、第6、第12、第24、第48小時取樣，每次隨機抽取9只石磺，將3只的血細胞、神經節(jié)、肝胰腺、肌肉、性腺、皮膚和腹足合并為1個樣本，每個時間點采集3個平行樣本。血細胞的采集是使用1 mL注射器從瘤背石磺腹部抽取血液，在800 ×g、4 ℃條件下離心10 min，獲得血細胞后將其溶解在trizol中，用液氮速凍，于–80 ℃保存。其他組織取樣后放入液氮速凍，于–80 ℃保存。用trizol法提取各組織RNA，用HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper, Vazyme，美國) 試劑盒進行反轉錄，得到的cDNA于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 OrFMRFamide基因在炎癥刺激后的時空表達 按照上述方法，以各組織各個時期刺激前后的cDNA為模板，18S為內參，進行實時熒光定量RT-PCR擴增實驗，數據使用2–ΔΔCT法進行分析。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 26.0軟件對熒光定量的數據進行處理，單因素方差分析結果以“平均值±標準差 ( X ±SD)”表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 OrFMRFamide的cDNA序列特征

根據瘤背石磺轉錄組測序結果獲得的OrFMRFamide基因片段，通過3'和5'-RACE擴增得到該基因全長序列為2 618 bp，開放閱讀框 (Open reading frame, ORF)為882 bp，基因序列末端加尾信號AATAA與Poly (A) 之間有17個堿基 (圖1)。ProtParam推測編碼1個含有293個氨基酸的蛋白，分子量為33 847.88 kD，理論等電點 (pI) 為9.25，不穩(wěn)定指數為57.00，預測為不穩(wěn)定蛋白，溶脂指數為55.67，平均疏水指數為–0.890。Server預測該蛋白不存在糖基位點。NetPhos 2.0 Server預測該蛋白含有12個磷酸化位點 [ 絲氨酸(Ser)：4；蘇氨酸 (Thr)：2；酪氨酸 (Tyr)：6]。信號肽軟件預測該基因有1個N端信號肽 (1～24)。

圖1 FMRFamide基因的氨基酸序列及cDNA全長淺灰色陰影部分是該基因編碼信號肽部分，起始密碼子和終止密碼子用方框標出，深灰色陰影是磷酸化位點，末端加尾信號AATAAA用下劃線標出，poly (A) 用斜體表示Figure 1 Amino acid sequence and full length cDNA of FMRFamide geneThe light grey shaded portion is the signal peptide portion of the gene; the start and stop codons are boxed; the dark grey shaded portion is the phosphorylation site; the end plus tail signal AATAAA is underlined, and poly (A) is in italics.

2.2 系統(tǒng)進化樹分析

將預測得到的OrFMRFamide基因的氨基酸序列放到NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現其與其他物種的FMRFamide基因有較高的同源性，下載這些物種的氨基酸序列，使用MEGA-X軟件構建進化樹 (圖2)。結果顯示，瘤背石磺和靜水椎實螺(Lymnaea stagnalis) 聚為一支，再與加利福尼亞海兔、棕蝸牛 (Cornu aspersum) 等腹足綱軟體動物聚為一大支，與雙殼綱海洋貝類聚為一大支，與環(huán)節(jié)動物和節(jié)肢動物各聚為一支。瘤背石磺與靜水椎實螺進化關系最為接近。

圖2 利用MEGA-X軟件基于NJ法構建的FMRFamide系統(tǒng)進化樹Figure 2 NJ phylogenetic tree of FMRFamide by MEGA-X

2.3 OrFMRFamide在不同組織中的表達分析

熒光定量RT-PCR結果顯示，OrFMRFamide基因在神經節(jié)中的表達量極顯著高于在其他組織的(P＜0.01)，此外，該基因也在血細胞、肝胰腺、皮膚、性腺組織中表達，幾乎不在肌肉和腹足中表達 (圖3)。以性腺的表達量為參照，血細胞、神經節(jié)、肝胰腺和皮膚的表達量分別約為性腺的2.33、1 025.47、36.96和6.86倍。

圖3 OrFMRFamide在各組織的相對表達量**. 極顯著性差異 (P＜0.01)Figure 3 mRNA relative expression of OrFMRFamide in different tissues**. Very significant at 0.01 level (P＜0.01)

2.4 FMRFamide多肽免疫組織化學分析

利用免疫組織化學的方法分析瘤背石磺FMRFamide神經肽在神經節(jié)、肝胰腺、肌肉、性腺、皮膚和腹足中的分布情況 (圖4)，結果顯示OrFMRFamide基因在不同組織中的表達模式和FMRF-amide神經肽的分布水平相一致，在神經節(jié)中大量表達，在性腺、皮膚和肝胰腺中微量表達，在腹足和肌肉中幾乎不表達。

圖4 免疫組化結果a. 神經節(jié)；b. 腹足；c. 肝胰腺；d. 肌肉；e. 皮膚；f. 性腺；箭頭表示FMRFamide多肽Figure 4 Immunohistochemistry resultsa. Ganglia; b. Pleopod; c. Hepatopancreas; d. Muscle; e. Skin; f. Gonad; arrows represent FMRFamide polypeptides.

2.5 OrFMRFamide在LPS刺激后的時空表達分析

基于瘤背石磺OrFMRFamide基因在不同組織中的相對表達量，研究該基因在LPS刺激后48 h內的表達變化 (圖5)。LPS組肝胰腺中OrFMRF-amide基因的表達量在注射后第12小時達最高值，與PBS組差異顯著 (P＜0.05)，皮膚中OrFMRFamide基因的表達量隨時間變化差異不大，但LPS組整體的表達量顯著高于PBS對照組 (P＜0.05)，神經節(jié)中該基因的表達量在第12 小時達最高值，整體表達水平顯著高于PBS對照組 (P＜0.05)，血細胞中該基因的相對表達量在第12小時達最高值，性腺中的表達量隨時間變化的差異不顯著，且LPS組和PBS組差異也不顯著 (P＞0.05)。

圖5 OrFMRFamide基因在炎癥刺激后在不同組織中的相對表達量圖中不同字母表示差異顯著 (P＜0.05)Figure 5 Relative expression of OrFMRFamide gene in different tissues after inflammatory stimulationDifferent letters in the figure indicate significant difference (P＜0.05).

3 討論

本研究克隆了瘤背石磺FMRFamide基因，系統(tǒng)進化樹顯示其與靜水椎實螺、棕蝸牛聚為一支，說明其與軟體動物門腹足綱貝類的親緣關系非常近，與軟體動物雙殼綱貝類明顯區(qū)分開來。

神經節(jié)、肝胰腺和血細胞屬于NEI (神經節(jié)、肝胰腺、血細胞) 系統(tǒng)，有報道指出NEI系統(tǒng)在應激和感染過程中能維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，有效清除病原體，調節(jié)機體平衡，減少對宿主的傷害[15]。FMRFamide作為軟體動物神經系統(tǒng)中的重要組成部分[16]，實時熒光定量結果顯示OrFMRFamide在神經節(jié)、血細胞和肝胰腺組織中均有較高的表達，在神經節(jié)中表達量最高，可能因為其參與神經系統(tǒng)中神經遞質的合成和釋放及神經內分泌系統(tǒng)的可塑性調節(jié)。楊金龍等[17]在研究厚殼貽貝 (Mytilus coruscus) 早期幼蟲發(fā)育時也發(fā)現，FMRFamide大量存在于神經系統(tǒng)中。在其他軟體動物如雙殼綱[7,18]、腹足綱[19]、頭足綱[20]中，FMRFamide多肽也被報道主要存在于神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和血細胞中。FMRFamide在瘤背石磺NEI系統(tǒng)中的高表達說明該基因可能對瘤背石磺的穩(wěn)態(tài)起重要作用，推測FMRFamide可能在神經節(jié)、肝胰腺和血細胞中合成和加工，然后通過自分泌/旁分泌信號通路釋放到血細胞中來調節(jié)機體。熒光定量結果顯示瘤背石磺FMRFamide還存在于皮膚中，高鳳娟等[21]和Allan等[22]對花背蟾蜍 (Bufo raddei) 和北美木蛙(Rana sylvatica) 的研究表明，兩棲類動物皮膚具有先天免疫功能，說明瘤背石磺作為無貝殼的兩棲型貝類，為適應潮間帶惡劣的生存環(huán)境，FMRFamide多肽可能參與了其先天免疫。FMRFamide應用免疫組化學進一步證實了OrFMRFamide在不同組織中的分布和FMRFamide多肽的分布一致，這與Terrnina等[23]對貓肝吸蟲 (Opisthorchis felineus) 和Allan等[22]對星蟲 (Themiste lageniformis)中FMRFamide的定位結果相似。

炎癥刺激實驗結果顯示，瘤背石磺神經節(jié)、肝胰腺和血細胞中FMRFamide基因相對表達量變化趨勢為先上升后降低，在注射脂多糖12 h后的表達量達最大值，說明FMRFamide可能參與了免疫防御反應。在無脊椎動物中，血細胞被認為是宿主在免疫防御反應中起重要作用的免疫相關細胞[24]，更有研究表明免疫細胞可以通過自分泌信號途徑重新合成神經肽來調節(jié)肌體免疫反應[25-27]。Wang等[28]用寄生蟲感染光滑雙臍螺 (Biomphalaria glabrata)，發(fā)現FMRFamide相對表達量高于對照組，FMRFamide表達量上升以抵抗寄生蟲感染，這和本研究結果一致，可以推測FMRFamide多肽能保護機體免受侵害，響應免疫刺激，在維持機體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。炎癥刺激后瘤背石磺性腺中FMRFamide相對表達量變化不顯著，Hada等[29]研究發(fā)現FMRFamide還能影響根結線蟲 (Meloidogyne graminicola) 的繁殖因子，Kerbl等[30]的研究也證實FMRFamide能作用于生殖腺，影響動物的交配行為，推測瘤背石磺性腺中的FMRFamide可能對瘤背石磺的繁殖有影響，但不參與維持自身穩(wěn)態(tài)。