嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩哀老及促進(jìn)修復(fù)功效評(píng)價(jià)研究

鄭雅方 顏貴卉 姚雨辰 章鵬坤

嗜熱棲熱菌具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、延緩衰老、阻抗日光對(duì)皮膚的損害和修復(fù)皮膚的能力。本文采用高溫發(fā)酵制備嗜熱棲熱菌發(fā)酵液（Thermus thermoph.Ius fermentation broth），從細(xì)胞層面對(duì)其安全性、延緩衰老、防曬和創(chuàng)傷修復(fù)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，積分?jǐn)?shù)≤10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人永生化表皮細(xì)胞（HACAT）和人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）都是安全無(wú)毒的，并具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用;UVB光紫外照射損傷修復(fù)模型中，體積分?jǐn)?shù)為1%～ 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液均有較強(qiáng)的防曬能力和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)能力，且具有延緩細(xì)胞衰老的功效;在細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)模型中，體積分?jǐn)?shù)為1%～ 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液具有不同程度的創(chuàng)傷修復(fù)能力。上述結(jié)果表明嗜熱棲熱菌發(fā)酵液安全無(wú)毒，并具有一定的延緩衰老、防曬和創(chuàng)傷修復(fù)功效。

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，微生物發(fā)酵原料被廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域，也有將其用于皮膚微生態(tài)的研究。將微生物高效應(yīng)用制成的功能性化妝品（延緩衰老、美白、修復(fù)、保濕和輔助炎性皮膚改善等功效）受到人們青睞。一種生活在火山、深海熱巖等極端高熱環(huán)境下的嗜熱菌已成為人們?nèi)找嬷匾暡⒗玫奈⑸镔Y源[1]，嗜熱棲熱菌（ThermusThermophilus）廣泛分布于溫泉、地?zé)釁^(qū)土壤、海底火山口附近、廄肥等處[2]，是一種耐熱菌，含有特異性的超嗜熱蛋白（如taqDNA聚合酶、耐熱淀粉酶、嗜熱蛋白酶、分子馬達(dá)等嗜熱酶），這些蛋白具有耐熱特性和強(qiáng)穩(wěn)定性，可以耐受90℃以上的高溫而不失活[3]。

嗜熱棲熱菌中較為獨(dú)特的“生長(zhǎng)因子”以核酸、維生素A、維生素82、煙酰胺、β類(lèi)胡蘿卜素、谷胱甘肽、聚多氨（多聚氨基酸）等為主要成分，近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)其還合有煙酰胺單核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide）等延緩衰老的活性物質(zhì)。核酸是細(xì)胞代謝的必需物質(zhì)，有助于表皮細(xì)胞基因的營(yíng)養(yǎng)及其損傷的修復(fù)，對(duì)皮膚進(jìn)行深層滋潤(rùn)，使皮膚柔軟。維生素、谷胱甘肽、多聚氨為細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能夠恢復(fù)和促進(jìn)細(xì)胞生理機(jī)能，在慢性、非治療傷口（如糖尿病潰瘍的傷口）修復(fù)時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以減輕皮膚炎癥反應(yīng)和抵抗日光的損害。耐熱活性酶使嗜熱棲熱菌在高溫條件下仍具備超強(qiáng)的DNA保護(hù)與修復(fù)能力。利用該耐熱特性，K.B.Mullis將嗜熱菌中的taqDNA聚合酶應(yīng)用開(kāi)發(fā)了多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得了1993年的諾貝爾獎(jiǎng)，基因工程研究也因此技術(shù)得以飛速發(fā)展[4]。LINTNERK等研究表明，在嗜熱菌體內(nèi)提取到的一種對(duì)熱穩(wěn)定的酶可作為化妝品配方中維生素類(lèi)活性成分的有效替代和補(bǔ)充，從而保護(hù)皮膚免受A型紫外線(xiàn)（UV-A）誘導(dǎo)生成自由基的損害[5]。相比于從植物中萃取和化學(xué)合成的方法將有效成分提取和分離，通過(guò)微生物發(fā)酵可產(chǎn)生大量活性成分（如透明質(zhì)酸、氨基酸），發(fā)酵過(guò)程中還可能會(huì)伴隨某些成分的分解轉(zhuǎn)化而生成新的有效成分，從而發(fā)揮更佳的目標(biāo)功能;并且從能源經(jīng)濟(jì)角度來(lái)看，發(fā)酵法還是一種更加高效環(huán)保獲得的方法舊。

本文利用高溫發(fā)酵制備嗜熱棲熱菌發(fā)酵液（Thermusthermophi[us fermentation broth），從體外細(xì)胞安全性、延緩衰老和修復(fù)功效等三個(gè)方面對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)掘其在延緩衰老和修復(fù)化妝品中的應(yīng)用價(jià)值。

01 材料與方法

1.材料與儀器

嗜熱棲熱菌發(fā)酵液（杭州優(yōu)瑪達(dá)生物科技有限公司）;DMEM高糖培養(yǎng)基（上海典瑞生物科技有限公司）;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司）;0.25%胰酶，青一鏈霉素溶液（SK）（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）;噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（西格瑪奧德里奇中國(guó)有限公司）;地塞米松（Dexamethasone）標(biāo)準(zhǔn)品，（IGC公司）;人永生化表皮細(xì)胞（HACAT），人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）;磷酸緩沖鹽溶液（PBS），現(xiàn)用現(xiàn)配，裝瓶滅菌待用;凈化工作臺(tái)（BT-ICD）（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（XMTP203）（金壇市科析儀器有限公司）;二氧化碳培養(yǎng)箱（HF90）（上海力申科學(xué)儀器有限公司）;低速立式離心機(jī)（KA-1000C）（上海安亭科學(xué)儀器廠）;倒置顯微鏡（CKX31-12PHP）（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）;紫外線(xiàn)光療儀[SH4 （B） 1154T]（上海希格瑪高技術(shù)有限公司）;酶標(biāo)儀（Mu[tiskan FC），[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)

將人永生化表皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%SK的DMEM培養(yǎng)基，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液消化，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5% CO2上進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩衰老功效研究

①入永生化表皮細(xì)胞（ HACAT）毒性的測(cè)定

采用MTT法[7，8]檢測(cè)受試物對(duì)HACAT細(xì)胞存活率的影響。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用含10%FBS、1%SK的DMEM培養(yǎng)液制成HACAT細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為IX104個(gè)/mL接種于96孔板中，于37℃、5% CO2下培養(yǎng)，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白調(diào)零組，板四周孔用無(wú)菌PBS填充封邊。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至一定細(xì)胞個(gè)數(shù)，換液加入不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%）的樣品，以不含樣品的培養(yǎng)液為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孑L加入20 mL MTT溶液（5g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，每孔加100 mL DMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm處在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。

②人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）毒性的測(cè)定

采用MTT法檢測(cè)受試物對(duì)HSF細(xì)胞存活率的影響。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用合10%FBS、1%SK的RPMI 1640培養(yǎng)液制成HSF細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為ixi04個(gè)/mL接種200 mL/孑L96孔板中，于37℃、5% CO2下培養(yǎng)，以不合細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白調(diào)零組，板四周孔用無(wú)菌PBS填充封邊。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至一定細(xì)胞個(gè)數(shù)，換液加入不同體積分?jǐn)?shù)（0.05%、0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%）的樣品，以不合樣品的培養(yǎng)液為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20mL MTT溶液（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，每孔加100 m[ DMSO，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm處在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率[10]，用SPSS 16.O程序計(jì)算出IC50，并按表l判定毒性分級(jí)[11]：

x（%）= （A藥物-A調(diào)零）× 100%

（A對(duì)照-A調(diào)零）

X（%）一細(xì)胞存活率;

A藥物一加藥樣品測(cè)定孔的吸光度平均值;

A調(diào)零一空白孔的吸光度平均值;

A對(duì)照一對(duì)照孔的吸光度平均值;

（3）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液光損傷修復(fù)功效研究

通過(guò)模擬的UVB光源照射HSF細(xì)胞建立光損傷修復(fù)模型后加入受試物，檢測(cè)受試物對(duì)光損傷細(xì)胞的修復(fù)能力。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用含10%FBS、1%SK的RPMI 1640培養(yǎng)液制成HSF細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為5×104個(gè)/mL接種100 mL/孔96孔板中，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，板四周子L用無(wú)菌PBS填充封邊。共接種2塊96孔板，每塊板設(shè)置相同，分為正常對(duì)照組（不照射UVB，加細(xì)胞），對(duì)照組（照射UVB，加細(xì)胞）和空白調(diào)零組（不照射UVB，不加細(xì)胞）。

板1處理：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗一次，吸出培養(yǎng)液，再加入20 uL的PBS，進(jìn)行UVB光源照射[UVB照射時(shí)間：UVB燈，峰值311 nm，開(kāi)燈lOmin后用紫外線(xiàn)輻射強(qiáng)度為1.05mW/cm2。輻射劑量控制為30mJ/cm2，輻射時(shí)間（S）=輻射劑量（m J/cm2）/輻射強(qiáng)度（m W/cm2） =30sl，其中正常對(duì)照組和空白調(diào)零不需要輻照（用鋁箔紙遮蓋住）。板2處理與板1處理基本一致，UVB光源輻射強(qiáng)度為60s，兩板均換入不同體積分?jǐn)?shù)（0.5%、1%、3%、5%、10%）的樣品，以35 ppm地塞米松為陽(yáng)性對(duì)照組，以不合加藥樣品的培養(yǎng)液為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)（同嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩衰老功效研究）。記錄結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞存活率來(lái)評(píng)價(jià)樣品對(duì)光損傷的修復(fù)能力。

（4）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液劃痕修復(fù)功效研究

通過(guò)建立體外細(xì)胞創(chuàng)傷模型，加入受試藥物來(lái)觀察HSF細(xì)胞遷移面積，檢測(cè)受試物的劃痕修復(fù)能力。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用合10%FBS、1%SK的RPM11640培養(yǎng)液制成HSF細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為2×10⁵個(gè)/mL接種于6孔板中，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，RPMI 1640全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞單層融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)菌200 μL移液器槍頭在細(xì)胞層的標(biāo)記垂直劃痕，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板板底中央用MARK筆做標(biāo)記。建立體外細(xì)胞創(chuàng)傷模型，PBS反復(fù)沖洗，至劃痕區(qū)域干凈。6孔板加入不同體積分?jǐn)?shù)的不含胎牛血清的培養(yǎng)基及空白組加入不合胎牛血清的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含l0%FBS的培養(yǎng)基均2.0mL，設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。觀察0h、24h和48h，定性觀察愈合時(shí)間，利用SigmaPlot 14.O軟件計(jì)算愈合面積的大小，記錄結(jié)果，判斷受試物的愈合能力。

02 結(jié)果與討論

1.嗜熱棲熱菌發(fā)酵液延緩衰老功效研究

（1）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人永生化表皮細(xì)胞（HACAT）毒性的檢測(cè)

如圖1所示，在體積分?jǐn)?shù)0% - 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下，HACAT細(xì)胞存活率均在100%以上，計(jì)算IC50≥10 mg/mL，根據(jù)歐盟國(guó)家實(shí)驗(yàn)室化妝品毒性的標(biāo)準(zhǔn)中ICso >1.5 mg/ mL，表明此體積分?jǐn)?shù)0% -10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液無(wú)毒性作用，且具有促進(jìn)HACAT細(xì)胞增殖的能力。

（2）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）毒性的檢測(cè)

成纖維細(xì)胞是皮膚真皮中的主體細(xì)胞成分，它不僅能夠合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、基質(zhì)大分子物質(zhì)和某些生長(zhǎng)因子，同時(shí)還具有黏附特性和趨化性，對(duì)維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用。隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚逐漸老化、皺紋增多、彈性降低，這些表現(xiàn)都與成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、合成功能下降密切相關(guān)[9，10]。

如圖2所示，在體積分?jǐn)?shù)0%- 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下HSF細(xì)胞存活率在100%以上，計(jì)算IC50≥10 mg/mL，根據(jù)歐盟國(guó)家實(shí)驗(yàn)室化妝品毒性的標(biāo)準(zhǔn)中IC50>1.5 mg/ mL，表明此體積分?jǐn)?shù)O%- 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液無(wú)毒性作用，且具有促進(jìn)HSF細(xì)胞增殖的能力。

2.嗜熱棲熱菌發(fā)酵液修復(fù)功效研究

（1）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）光損傷修復(fù)能力的檢測(cè)

①由于長(zhǎng)期的紫外線(xiàn)輻射會(huì)加速皮膚的老化進(jìn)程，使皮膚提前衰老，所以防曬原料是延緩皮膚衰老產(chǎn)品中必不可少的一類(lèi)。

如圖3所示，模擬UVB光源照射HSF細(xì)胞30 s建立光損傷修復(fù)模型。在體積分?jǐn)?shù)0.5%- 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下，除體積分?jǐn)?shù)為0.5%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下HSF細(xì)胞存活率為80.41%，光損傷修復(fù)能力相對(duì)較低，其他體積分?jǐn)?shù)的HSF細(xì)胞存活率均在130%以上，光損傷修復(fù)能力均較強(qiáng)，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用：而陽(yáng)性對(duì)照組地塞米松和正常對(duì)照組的HSF細(xì)胞存活率為9.73%和19.03%，幾乎沒(méi)有光損傷修復(fù)能力。表明在體積分?jǐn)?shù)1% - 10%范圍內(nèi)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液均有較強(qiáng)的光損傷修復(fù)能力及延緩細(xì)胞衰老的作用。

②如圖4所示，模擬UVB光源照射HSF細(xì)胞60 s建立光損傷修復(fù)模型。在體積分?jǐn)?shù)0.5%- 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下，除體積分?jǐn)?shù)為0.5%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下HSF細(xì)胞存活率為63.76%，光損傷修復(fù)能力相對(duì)較低，其他體積分?jǐn)?shù)的HSF細(xì)胞存活率均在100%以上，光損傷修復(fù)能力均較強(qiáng)，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用;而陽(yáng)性對(duì)照組地塞米松和正常對(duì)照組的HSF細(xì)胞存活率為7.14%和11.97%，幾乎沒(méi)有光損傷修復(fù)能力。表明在體積分?jǐn)?shù)1% -10%范圍內(nèi)嗜熱棲熱菌發(fā)酵液均有較強(qiáng)的光損傷修復(fù)能力及延緩細(xì)胞衰老的作用。

（2）嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）創(chuàng)傷修復(fù)能力的檢測(cè)

如圖5所示，采用槍頭劃痕模擬HSF細(xì)胞創(chuàng)傷，根據(jù)HSF細(xì)胞遷移面積檢測(cè)受試物的劃痕修復(fù)能力。在體積分?jǐn)?shù)1% - 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作用下，有不同程度的修復(fù)能力，其中體積分?jǐn)?shù)10%修復(fù)能力最強(qiáng)，愈合面積達(dá)到21.39%：而對(duì)照組愈合面積為43.21%，體積分?jǐn)?shù)10%嗜熱棲熱菌發(fā)酵液的修復(fù)能力達(dá)到對(duì)照組修復(fù)能力的一半，表明體積分?jǐn)?shù)為10%有較強(qiáng)的創(chuàng)傷修復(fù)能力：而體積分?jǐn)?shù)在1% - 10%范圍內(nèi)的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液有不同程度的創(chuàng)傷修復(fù)能力。

03 結(jié)論

本研究結(jié)果在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表明，體積分?jǐn)?shù)≤10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人永生化表皮細(xì)胞（HACAT）和人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）是安全無(wú)毒的，且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

在光損傷修復(fù)模型中，通過(guò)不同的光照時(shí)間，體積分?jǐn)?shù)為1% - 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）均有較強(qiáng)的防曬能力及促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)能力，且具有延緩細(xì)胞衰老的功效：在細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)模型中，體積分?jǐn)?shù)在1% - 10%的嗜熱棲熱菌發(fā)酵液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）具有不同程度的創(chuàng)傷修復(fù)能力。

嗜熱棲熱菌發(fā)酵液作為延緩衰老和皮膚損傷修復(fù)的個(gè)人護(hù)理天然原料，應(yīng)用到延緩皮膚衰老和促進(jìn)皮膚疤痕修復(fù)功效的化妝品之中，應(yīng)用前景廣闊。

（作者任職于杭州優(yōu)瑪達(dá)生物科技有限公司）

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