河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心 河北省中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心

麻景梅 李葆林 王迎春 甄亞欽 任艷青 牛麗穎 (石家莊 050091)

提要 目的：建立中藥茵梔黃湯的HPLC指紋圖譜，并對(duì)單煎與共煎化學(xué)成分進(jìn)行對(duì)比分析，闡明單煎與共煎的差別。方法：色譜柱Agilent Eclipse plus-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，通過采集12批茵梔黃湯HPLC 指紋圖譜，建立指紋圖譜共有模式；對(duì)3批單煎混合液與共煎液指紋圖譜的相似度、峰面積進(jìn)行分析，闡明兩者化學(xué)成分是否存在差異。結(jié)果：建立茵梔黃湯HPLC對(duì)照?qǐng)D譜，標(biāo)定27個(gè)共有峰，指認(rèn)12個(gè)色譜峰，分別為4-新綠原酸、6-綠原酸、8-隱綠原酸、10-梔子苷、13-蘆丁、15-異綠原酸B、16-異綠原酸A、18-異綠原酸C、20-黃芩苷、25-千層紙素A苷、26-漢黃芩苷、27-黃芩素；3批單煎與共煎指紋圖譜相似度在0.960以上。結(jié)論：建立茵梔黃湯指紋圖譜，為其質(zhì)控提供有效的方法；單煎與共煎化學(xué)成分組成一致，但峰面積有一定的差別。

茵梔黃湯由經(jīng)方茵陳蒿湯(《傷寒論》)演變而成，由茵陳、梔子、黃芩、金銀花組成，具有清熱解毒，利濕退黃的功效，用于治療濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)所致的黃疸、急慢性肝炎[1-2]。茵梔黃湯主要含黃酮類、環(huán)烯醚萜類、有機(jī)酸類等化學(xué)成分[3]，目前相關(guān)研究主要集中在茵梔黃口服液等中成藥[4-7]，而對(duì)傳統(tǒng)湯劑化學(xué)成分報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜技術(shù)，對(duì)茵梔黃傳統(tǒng)湯劑進(jìn)行研究，建立茵梔黃湯指紋圖譜分析方法及對(duì)照?qǐng)D譜，并對(duì)單煎與共煎HPLC 指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，考察單煎與共煎化學(xué)成分的差異。在茵梔黃質(zhì)量控制基礎(chǔ)上，闡述單煎、共煎對(duì)其化學(xué)成分的影響，為該經(jīng)方的臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀；真空冷凍干燥機(jī)(Pilot5-8L北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；十萬分之一分析天平、萬分之一分析天平FA2204B(上海精科儀器有限公司)；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250型超聲波清洗器(功率250W，頻率40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芩苷(批號(hào)110715-201318，純度≥93.3%)，漢黃芩苷(批號(hào)112002-201702，純度≥98.5%)，綠原酸(批號(hào)110753-201415，純度≥96.2%)，購于中國食品藥品檢定研究院；梔子苷(批號(hào)MUST-16020401，純度≥99.03%)，新綠原酸(MUST-12113001，純度≥98%)，隱綠原酸(MUST-13013002，純度≥98%)，異綠原酸A(MUST-18040105，純度≥99.29%)，異綠原酸B(MUST-18031602，純度≥99.05%)，異綠原酸C(MUST-18031603，純度≥99.84%)，黃芩素(MUST-16031618，純度≥99.58%)，蘆丁(批號(hào)MUST-16031813，純度≥98.16%)購自成都曼斯特生物科技有限公司；千層紙素A苷(PS-011092，純度≥98.0%)購于成都普思生物科技有限公司。茵梔黃湯各樣品(自制)，乙腈、甲醇為色譜級(jí)、超純水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對(duì)照品溶液：分別取對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配成新綠原酸 0.010 mg/mL、綠原酸0.15 mg/mL、隱綠原酸0.024 mg/mL、梔子苷0.27 mg/mL、蘆丁0.078 mg/mL、異綠原酸A 0.060 mg/mL、異綠原酸B 0.012 mg/mL、異綠原酸C 0.072 mg/mL、黃芩苷0.31 mg/mL、千層紙素A苷0.050 mg/mL、漢黃芩苷0.72 mg/mL、黃芩素0.056 mg/mL的對(duì)照品混合溶液。

2.1.2 茵梔黃湯制備：按茵陳18 g，梔子12 g，黃芩、金銀花各8 g稱取，用傳統(tǒng)方法煎煮2次，一煎加水量為藥材量12倍，浸泡30 min，微沸煮30 min，二煎加水量為10倍，微沸煮20 min，過200目篩，合并濾液，減壓濃縮至料液比為1∶2，冷凍干燥得干膏粉。

2.1.3 供試品溶液的制備：取干膏粉約0.2 g，精密稱定，加70% 甲醇25 mL，超聲10 min，取出，放冷，補(bǔ)重，濾過即得供試品溶液。

2.1.4 茵梔黃湯單煎樣品溶液制備：稱取茵陳18 g，梔子12 g，黃芩、金銀花各8 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下工藝參數(shù)分別進(jìn)行煎煮，過濾后合并各單味飲片提取濾液，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備茵梔黃湯單煎樣品溶液。

2.1.5 單味藥材樣品溶液制備：分別稱取茵陳18 g，梔子12 g，黃芩、金銀花各8 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下工藝參數(shù)分別制備各單味藥材樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備茵梔黃湯各單味藥材樣品溶液。

2.1.6 缺味樣品溶液制備：分別按處方比按照“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備缺茵陳、缺梔子、缺金銀花、缺黃芩的缺味樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下制備茵梔黃湯缺味樣品溶液。

2.2 經(jīng)方茵梔黃湯HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，A相乙腈，B相0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～10 min，7%→10%A；10～15 min，10%A；15～40 min，10%→20%A；40～65 min，20%→23%A；65～90 min，23%→40% A；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；進(jìn)樣量為10 μL；流量1.0 mL/min；柱溫 30 ℃。

2.2.2 精密度：取同一供試品，按“2.2.1”下色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，以10號(hào)色譜峰梔子苷為S參照，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.05%～0.93%，相對(duì)峰面積 RSD為0.12%～2.78%，RSD小于3%，精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性：取同一供試品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定 0、2、4、8、16、24 h穩(wěn)定性 ，以10號(hào)色譜峰梔子苷為S參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 0.07%～1.27%，相對(duì)峰面積RSD 0.31%～2.74%，RSD小于3%，供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定 。

2.2.4 重復(fù)性：取同一批樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以10號(hào)梔子苷為S參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間 RSD 為0.08%～0.21%，相對(duì)峰面積 RSD 為0.16%～2.93%，RSD 小于3% ，重復(fù)性良好。

2.2.5 茵梔黃湯指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)：制備12批次茵梔黃湯樣品(S1～S12)供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，對(duì)12批 茵梔黃湯的HPLC 圖譜進(jìn)行分析，生成對(duì)照?qǐng)D譜，選擇27個(gè)色譜峰作為茵梔黃湯對(duì)照?qǐng)D譜共有峰，其中梔子苷(10號(hào)峰)作S參照峰，計(jì)算12批次樣品相似度，結(jié)果詳見表1。相似度在0.933以上，由整體性色譜峰可知，12批茵梔黃湯樣品未受不同產(chǎn)地藥材影響，化學(xué)成分組成相對(duì)穩(wěn)定[8-11]。

表1 12批茵梔黃湯指紋圖譜相似度

2.2.6 色譜峰指認(rèn)與歸屬：根據(jù)混合對(duì)照品與茵梔黃湯對(duì)照色譜圖比對(duì)，12個(gè)色譜峰得到確定，4-新綠原酸、6-綠原酸、8-隱綠原酸、10-梔子苷、13-蘆丁、15-異綠原酸B、16-異綠原酸A、18-異綠原酸C、20-黃芩苷、25-千層紙素A苷、26-漢黃芩苷、27-黃芩素。

將單味藥材茵陳、梔子、金銀花、黃芩以及各缺味樣品按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將茵梔黃湯與各單味藥材、缺味樣品色譜圖進(jìn)行疊加，進(jìn)行各色譜峰歸屬。其中茵陳貢獻(xiàn)8個(gè)色譜峰，梔子貢獻(xiàn)8個(gè)色譜峰，黃芩貢獻(xiàn)8個(gè)色譜峰，金銀花貢獻(xiàn)12個(gè)色譜峰；其中6號(hào)色譜峰為茵陳、梔子、金銀花共有；4、8、9、15、16號(hào)色譜峰為茵陳與金銀花共有，14號(hào)色譜峰為梔子與黃芩共有；2號(hào)色譜峰為茵陳特有，1、3、5、10、19、21號(hào)色譜峰為梔子特有，7、11、12、13、17號(hào)色譜峰為金銀花特有，20、22、23、24、25、26、27號(hào)色譜峰為黃芩特有。結(jié)果詳見表2。

表2 色譜峰歸屬結(jié)果

2.3 茵梔黃湯單煎與共煎化學(xué)成分比較 取3批藥材，分別制備3批單煎與共煎樣品，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)3批單煎與共煎的HPLC 圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果各指紋圖譜的相似度均在0.960以上，二者的化學(xué)成分基本一致。詳見表3。對(duì)單煎與共煎3批色譜峰面積均值大小以及相對(duì)峰面積比進(jìn)行比較，共煎后未發(fā)現(xiàn)新的化合物，單煎和共煎化學(xué)成分相同，而峰面積不同。單煎峰面積小于共煎的有13個(gè)，為3、5、6、7、8、9、11、12、13、15、16、17、18色譜峰，主要來源于茵陳與金銀花；單煎色譜峰面積值大于共煎的有9個(gè)，1、4、14、20、21、23、25、26、27主要來源于黃芩與梔子；單煎與共煎峰面積比值無明顯差異的有5個(gè)，為2、10、19、22、24色譜峰。

表3 茵梔黃湯單煎與共煎樣品指紋圖譜相似度

采用統(tǒng)計(jì)學(xué) Dunnett's T3對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05，差異具有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的色譜峰只有27號(hào)峰(黃芩素)，黃芩素為黃芩特有，其單煎中峰面積值為共煎液的2倍。詳見表4。

表4 茵梔黃湯單煎混合液與共煎樣品溶液HPLC圖峰信息 (n=3)

3 討論

3.1 茵梔黃湯指紋圖譜建立 本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法采集12批次樣品色譜圖，構(gòu)建了茵梔黃湯的指紋圖譜，12批樣品相似度較高(大于0.933)，說明藥材的不同產(chǎn)地及不同批次對(duì)茵梔黃湯所含化學(xué)成分未造成差異性影響，所含化學(xué)成分較穩(wěn)定。

3.2 單煎與共煎化學(xué)成分比較 采用3個(gè)不同批次藥材分別制備3份茵梔黃湯單煎混合與3份共煎樣品，單煎與共煎，相似度大于0.960，說明二者具有良好的相關(guān)性，處方藥味共煎并未產(chǎn)生新的化學(xué)成分。通過單煎與共煎相同量下峰面積值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者峰面積具有一定的差別，但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的色譜峰只有27號(hào)色譜峰(黃芩素)，單煎混合液中的峰面積值為共煎液的2倍，推測(cè)茵梔黃湯共煎液中某些成分抑制了黃芩素的溶出，其他色譜峰峰面積差異均無顯著性。

本實(shí)驗(yàn)建立經(jīng)方茵梔黃湯的HPLC指紋圖譜，共有色譜峰涵蓋了復(fù)方的所有藥味，各藥味均具有特有峰，不僅可反映茵梔黃湯的整體化學(xué)成分信息，并對(duì)所有藥味的質(zhì)量均具有控制，使其質(zhì)量評(píng)價(jià)科學(xué)合理。在指紋圖譜研究基礎(chǔ)上，通過相似度評(píng)價(jià)，分析茵梔黃湯單煎混合液以及共煎液的差別，二者在整體化學(xué)成分組成上無差異。