周健，杜鳳，康秉文，殷草草，蔣杉，石瑩，王玥，周耿瑤，秦緒軍*，王楓*（.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系 軍隊健康教育與管理教研室，西安 7003；.陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽 7046）

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在非過度飲酒的情況下，肝臟發(fā)生的脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，并排除藥物、自身免疫、病毒等因素造成的肝臟疾病[1]，以過量的三酰甘油（triacylglycerol，TG）在肝臟中聚積為特征[2]。NAFLD 已成為全世界人們在慢性病領(lǐng)域關(guān)注的焦點，我國預(yù)計在2030年成為NAFLD導(dǎo)致肝臟相關(guān)疾病死亡率最高的國家[3]。對于目前重癥NAFLD 患者而言，除了改變不健康的生活方式之外，急需能夠有效治療NAFLD 的藥物。NAFLD 發(fā)病機制復(fù)雜，致病因素眾多。目前“多重打擊學(xué)說”認為形成NAFLD 的因素包括肝臟TG 沉積，胰島素抵抗（insulin resistance，IR），自噬能力減弱，炎性因子刺激以及氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）等[4]。有研究表明，當大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）發(fā)生OS 時，線粒體功能受到抑制，核因子相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）與其內(nèi)生的抑制劑Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein 1，keap1）的分離可能會受到抑制，影響抗氧化基因表達，形成惡性循環(huán)，使細胞功能受損，誘發(fā)脂質(zhì)沉積[5]。因此抗氧化是防治NAFLD 的重要研究內(nèi)容之一。

異鼠李素（isorhamnetin，Iso）由沙棘中分離而得，是黃酮類化合物槲皮素的直接代謝產(chǎn)物之一[6]。沙棘具有緩解咳嗽，促進食欲的功效，被廣泛用于治療輕癥的呼吸系統(tǒng)炎癥、高原肺病、食欲不振等[7]。近幾年，異鼠李素更是被證明具有保護心血管、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、緩解肝臟纖維化等多種作用[8-11]。此外，異鼠李素抗氧化能力較強[9，12-13]，能調(diào)節(jié)Nrf2 通路，從而增強血紅素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基（GCLM）、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）等抗氧化基因的表達，緩解超氧化物歧化酶（SOD）過分消耗，減少ROS產(chǎn)生，從而緩解OS，起到抗氧化保護作用[14-15]。異鼠李素是否可以通過調(diào)節(jié)Nrf2 通路來緩解OS造成的損傷從而減輕NAFLD，尚不明確。本研究采用游離脂肪酸（FFA）構(gòu)建體外脂質(zhì)沉積模型，觀察異鼠李素對細胞產(chǎn)生的ROS、抗氧化系統(tǒng)以及TG 沉積的變化影響，初步探討異鼠李素抗NAFLD 的可能性及其分子機制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

二氧化碳孵育箱（美國Thermo）；紫外線超凈臺（江蘇蘇凈安泰）；臺式離心機（陜西環(huán)宇）；CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus）；高速冷凍離心機5424 R（德國Eppendorf）；Infinite200 PRO 全波長多功能酶標儀（德國Tecan）；流式細胞儀（美國BD）；Trans Blot Turbo 蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

1.2 試藥

異鼠李素（美國TargetMol，純度≥98%，批號：T2836）；胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco）；蛋白定量分析試劑盒（美國Thermo）；青-鏈霉素溶液（上海源培）；油紅O、熒光探針（美國Sigma）；過氧化氫酶（CAT）試劑盒、總SOD 試劑盒（上海 Beyotime）；蘇木精（珠海貝索）；TG 試劑盒（日本W(wǎng)ako）；CCK-8試劑盒（上海漢恒）；漿蛋白核蛋白提取試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（江蘇凱基）；Actin、CAT、SOD1、GPx1、GCLM 兔 抗單 克隆抗 體、SOD2 鼠抗單克隆抗體（美國Santa Cruz）；Nrf2兔抗單克隆抗體（武漢 Proteintech）；GCLC 兔抗單克隆抗體（南京巴傲德）；HO-1 兔抗單克隆抗體（英國Abcam）；ML385（美國TargetMol）。

2 方法

2.1 L-02 細胞培養(yǎng)與處理

人肝L-02 細胞（由中科院上海細胞庫購買）接種于含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期細胞，均勻接種于96 孔板（用于CCK-8 實驗）與6 孔板（用于蛋白水平表達等其他測定）中。油酸與棕櫚酸按2∶1 的比例溶于BSA中配制成FFA[14]。將細胞分為3 組：對照（control）組，F(xiàn)FA 組，F(xiàn)FA ＋Iso 組。其中FFA 濃度為0.6 mmol·L－1，異鼠李素濃度為10 μmol·L－1，共處理7 d。每組設(shè)立3 個平行樣。

2.2 細胞活力檢測

采用CCK-8 細胞增殖試劑盒檢測細胞活力。取對數(shù)生長期細胞按說明書均勻接種于96 孔板，分別給予0、5、10、20、40、80 μmol·L－1的異鼠李素培養(yǎng)24 h，再用10 μL CCK-8 溶液進行反應(yīng)，37℃孵育2 h，在450 nm 處測定吸光度。

2.3 油紅O 染色

油紅O 充分溶于異丙醇中，過濾后配制5 g·L－1的儲存液，與超純水按3∶2 混合，過濾后配制成油紅O 工作液。4%多聚甲醛處理細胞30 ～60 min 用于固定，60%異丙醇孵育3 min，油紅O 工作液孵育5 min。蘇木素孵育1 min 后進行清洗，直到呈現(xiàn)紫藍色，顯微鏡下觀察[15]。

2.4 細胞TG 檢測

采用TG 試劑盒，通過GPO-DAOS 法測定細胞中TG 含量。按照試劑盒的說明進行操作：細胞用RIPA 裂解液常規(guī)裂解，4℃、14 000 g 離心20 min 后取上清液。檢測液A 與B 按1∶1 混合。取2 μL 上清液加入300 μL 混合好的檢測液，37 ℃孵育至少30 min，在600 nm 處測定吸光度。

2.5 細胞總ROS 檢測

采用2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA）熒光探針標記，流式細胞儀檢測熒光強度[16]。L-02 細胞消化重懸，加入濃度為10 μmol·L－1的DCFH-DA，37℃避光孵育30 min，孵育完成清洗3 次，重懸后用流式細胞儀FL-1通道測定平均熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

2.6 細胞MDA 含量、總SOD 活性和CAT 活性檢測

在樣品充分裂解后，按照說明進行操作，測定MDA、總SOD 活性及CAT 活性。MDA 熒光強度檢測采用激發(fā)波長515 nm、發(fā)射波長553 nm?？係OD 活性采用450 nm 波長測定吸光度，CAT 活性采用520 nm 波長測定吸光度。

2.7 核蛋白與漿蛋白提取

采用核蛋白、漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白及漿蛋白，在細胞中加入預(yù)冷的450 μL Buffer A與50 μL Buffer B，混勻，冰上放置30 min。4℃、3000 g 離心10 min，上清液即為胞漿蛋白。沉淀加入100 μL Buffer C，渦旋震蕩15 s，冰上裂解60 min。4 ℃、14 000 g 離心30 min，上清液即為核蛋白。

2.8 Western blot

依照BCA 法，測定蛋白濃度。配制相應(yīng)濃度的凝膠依次上樣，恒壓150 V 電泳60 min。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫孵育2 h。一抗在4 ℃孵育12 h，用TBST洗膜，共3次。二抗在25℃孵育2 h，TBST 洗膜，共4 次。發(fā)光液A 與發(fā)光液B 按1∶1 混勻，覆于PVDF 膜表面，并用凝膠成像進行成像。最后采用Bio-Rad Quantity One 軟件對條帶進行定量分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

通過SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件，實驗數(shù)據(jù)以±s形式表示。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），運用Dunnett’st檢驗比較實驗組與對照組之間的統(tǒng)計學(xué)差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 異鼠李素對L-02 細胞活力的影響

當 濃度≤20 μmol·L－1時，異鼠 李 素對細胞活力的影響無顯著區(qū)別；而當濃度≥40 μmol·L－1時，細胞活力顯著降低（見圖1）。因此，為了避免細胞活力受影響，選擇濃度為10 μmol·L－1的異鼠李素進行干預(yù)。

3.2 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中TG 水平的影響

與Control 組相比，經(jīng)FFA 處理的細胞紅色斑點大量生成，TG 水平顯著提高；而經(jīng)異鼠李素干預(yù)后，紅色斑點顯著減少，表明細胞內(nèi)TG水平顯著下降（見圖2）。

圖1 不同濃度的異鼠李素處理后對L-02 細胞活力的影響（24 h）Fig 1 Effect of different concentrations of isorhamnetin on the viability of L-02 cells（24 h）

圖2 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中TG 水平的影響（7 d）Fig 2 Effect of isorhamnetin on TG level in L-02 cells induced by FFA（7 d）

3.3 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中總ROS及MDA 水平的影響

與Control 組相比，F(xiàn)FA 組的總ROS 水平與MDA 水平均顯著增高，表明FFA 可誘導(dǎo)細胞發(fā)生OS，使細胞受損；而經(jīng)異鼠李素干預(yù)后，細胞總ROS 水平與MDA 水平均明顯降低，表明異鼠李素可以有效緩解FFA 造成的OS 損傷（見圖3）。

3.4 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中抗氧化酶的影響

與Control 組相比，F(xiàn)FA 組SOD1、SOD2、GPx1的表達水平均顯著下降；在異鼠李素干預(yù)后，SOD1、SOD2、GPx1 的表達水平顯著提高（見圖4A）。除此之外，F(xiàn)FA 可顯著降低L-02 細胞總SOD 活性，而異鼠李素干預(yù)后總SOD 活性顯著增加（見圖4B）。

3.5 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中Nrf2 蛋白及其下游蛋白水平的影響

圖3 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞的總ROS 與MDA 水平的影響（7 d）Fig 3 Effect of isorhamnetin on total ROS and MDA level in L-02 cells induced by FFA（7 d）

圖4 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞的抗氧化酶的影響（7 d）Fig 4 Effect of isorhamnetin on anti-oxidases in L-02 cells induced by FFA（7 d）

FFA 處理后L-02 細胞胞核內(nèi)的Nrf2 蛋白水平顯著下降，Nrf2 下游的GCLC、GCLM 的表達水平也顯著下降。與FFA 組相比，異鼠李素干預(yù)后細胞質(zhì)中的Nrf2 蛋白（cyt Nrf2）水平顯著下降，而細胞核中的Nrf2 蛋白（nuc Nrf2）水平則顯著升高（見圖5A）；Nrf2 下游的蛋白表達水平也有顯著提高（見圖5B）。

3.6 抑制Nrf2 后異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中TG 水平的影響

與Control 組相比，F(xiàn)FA 組TG 水平顯著升高，而異鼠李素進行干預(yù)后TG 水平有明顯的下降，表明異鼠李素可以減輕FFA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。而在應(yīng)用Nrf2 特異性抑制劑ML385（1 μmol·L－1）與異鼠李素共同處理后，細胞內(nèi)TG水平明顯回升，表明Nrf2 在受到抑制后，異鼠李素緩解脂質(zhì)沉積的作用下降，進一步表明異鼠李素可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2 通路緩解FFA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積（見圖6）。

圖5 異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中Nrf2 蛋白及其下游蛋白水平的影響（7 d）Fig 5 Effect of isorhamnetin on Nrf2 and its downstream proteins in L-02 cells induced by FFA（7 d）

圖6 抑制Nrf2 后異鼠李素對FFA 誘導(dǎo)的L-02 細胞中TG 水平的影響（7 d）Fig 6 Effect of isorhamnetin on the TG level in L-02 cells induced by FFA after the inhibition of Nrf2（7 d）

4 討論

OS 是ROS 生成超過抗氧化的能力時出現(xiàn)的一系列應(yīng)激反應(yīng)，與NAFLD 的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。過量的游離脂肪酸在肝細胞線粒體內(nèi)發(fā)生β氧化，造成ROS 的不斷聚積，影響線粒體的活性，導(dǎo)致脂肪酸轉(zhuǎn)化為TG 儲存在肝細胞內(nèi)，進一步破壞線粒體結(jié)構(gòu)與功能，產(chǎn)生更多的ROS[17]，大量TG 沉積在肝臟中最終形成NAFLD。而NAFLD 的形成也進一步使肝細胞受到脂質(zhì)毒性的侵害，加重線粒體的破壞，產(chǎn)生更多的ROS，從而誘導(dǎo)IR與炎癥的發(fā)生，進一步使OS 損傷加劇，形成惡性循環(huán)[18]。因此，通過減少ROS 成為預(yù)防或治療NAFLD 的潛在有效手段[19]。

異鼠李素具有保肝的作用，可以有效緩解多種因素引起的肝細胞壞死與凋亡，這其中的機制可能與抗氧化相關(guān)[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)FFA 可以誘導(dǎo)L-02 細胞發(fā)生脂質(zhì)沉積，并且可以引起細胞發(fā)生OS 損傷，產(chǎn)生大量ROS，消耗多種抗氧化酶。而異鼠李素則可以有效緩解FFA誘發(fā)的脂質(zhì)沉積，減少細胞中TG 的水平，并且緩解OS 損傷，減少ROS 與MDA 的水平，提高SOD1、SOD2、GPx1 的表達與活性，表明異鼠李素可能通過抗氧化來緩解脂質(zhì)沉積。Nrf2 是上游重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控機制尚不完全明確。但目前普遍的觀點認為，當遇到親電物質(zhì)攻擊或是發(fā)生磷酸化使其構(gòu)象發(fā)生改變[21]，Nrf2就會與keap1 分離進入細胞核，與一個小蛋白形成異二聚體，并識別抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant response element，ARE）序列，加強下游抗氧化蛋白表達，從而減輕ROS 帶來的破壞，維持細胞的穩(wěn)態(tài)[22]。此外，當keap1 發(fā)生構(gòu)象的改變或是Nrf2 mRNA 水平上調(diào)，都可以促使Nrf2 通路的激活。我們進一步的研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可以通過調(diào)控Nrf2 信號通路，促進Nrf2 進入細胞核，從而提高HO-1、GCLC、GCLM 的表達水平。這些結(jié)果表明異鼠李素可能是通過提高Nrf2 的轉(zhuǎn)錄活性，減輕了OS，從而緩解了FFA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積。接下來本課題組應(yīng)用Nrf2 的特異性抑制劑，發(fā)現(xiàn)異鼠李素緩解脂質(zhì)沉積的作用減弱，細胞中TG 水平增加，這進一步表明Nrf2 通路是異鼠李素緩解脂質(zhì)沉積的重要通路。Ganhold等[23]的研究證明異鼠李素可以緩解小鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積，其中的機制可能與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators activated receptorγ，PPARγ）通路有關(guān)。PPARγ通路與脂質(zhì)合成相關(guān)，而有文獻報道Nrf2 可以調(diào)控PPARγ通路，因此異鼠李素還有可能通過調(diào)控Nrf2 抑制脂肪從頭合成，從而緩解脂質(zhì)累積[24]。

綜上所述，本研究采用NAFLD 體外細胞模型，發(fā)現(xiàn)異鼠李素可顯著緩解FFA 引起的OS，提高細胞抗氧化的能力，降低FFA 誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積，而調(diào)控Nrf2 通路是其中抗氧化的重要機制。該研究結(jié)果為進一步研究異鼠李素防治NAFLD提供了實驗依據(jù)。