劉嫦娥，肖艷蘭，譚佳欣，潘瑛，段昌群，孟祥懷，王朋，袁鑫奇

（1. 云南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/云南省高原山地生態(tài)與退化環(huán)境修復(fù)重點實驗室，云南 昆明 650091；2. 云南省高原湖泊生態(tài)修復(fù)及流域管理國際聯(lián)合研究中心，云南 昆明 650091）

隨著市場經(jīng)濟的高速發(fā)展，人類對重金屬的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造等工業(yè)活動日益增多，造成許多重金屬如鉛、鎘等大量進(jìn)入大氣、水體和土壤中，引起嚴(yán)重的環(huán)境污染問題?，F(xiàn)今全世界平均每年排放Hg約1.5×104t，Cu約340 t，Pb約500 t，Mn約1.5×107t，Ni約100×104t，世界各國幾乎均存在程度不一的土壤重金屬污染問題[1]；據(jù)《2014年中國土壤質(zhì)量調(diào)查公報》顯示，我國土壤鎘和鉛的點位超標(biāo)率分別為7.0%和1.5%，是幾種重金屬中排名第一和第五的污染物。調(diào)查表明，我國每千克土壤的鎘污染水平可達(dá)幾十毫克，北京市某菜地土壤鉛含量范圍為13.2～78.8 mg/kg[2]，并且土壤中鉛含量有逐年增加的趨勢。此外，從污染來源角度分析，鉛鎘復(fù)合污染普遍存在，是由于元素鎘主要伴生于鉛鋅礦中，鉛鋅礦床一直是鎘的冶煉主要來源，煉鉛鋅排放的“三廢”中含有大量鉛鋅鎘。然而研究表明，土壤中鉛、鎘濃度過高會對幾乎所有土壤生物的生存和生長產(chǎn)生負(fù)面影響[3]。

具有“生態(tài)系統(tǒng)工程師”之稱的蚯蚓具有重要的生態(tài)價值，在污染土壤治理及修復(fù)領(lǐng)域逐漸成為研究熱點對象。研究表明，蚯蚓在土壤結(jié)構(gòu)的形成、促進(jìn)土肥相融、提高植物營養(yǎng)[4]、改善土壤通透性、提高儲水與保肥能力、促進(jìn)土壤有機質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化[5]等方面起著十分關(guān)鍵的作用。同時，蚯蚓體表由于沒有堅硬的角質(zhì)層，因此對各種環(huán)境干擾和環(huán)境污染物都非常敏感。在這些環(huán)境變化下，蚯蚓行為、生理等均可以受到不同程度的影響。研究表明，蚯蚓的存活率、生長和攝食率等受到高重金屬濃度的負(fù)面影響[3]。即使在相對低濃度下，重金屬濃度與蚯蚓生理變化之間也存在顯著的劑量依賴關(guān)系[6]。在重金屬鉛鎘脅迫下，蚯蚓通過體表吸收和攝食土壤富集重金屬，積累到一定量后，蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性會升高，以便去除體內(nèi)多余的氧自由基；當(dāng)重金屬濃度過高時，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)就會受到抑制，抗氧化酶活性也隨之降低，這就是蚯蚓的生理適應(yīng)代價。當(dāng)然，蚯蚓除了生理調(diào)節(jié)外，還可以使用行為策略，如水平遷移，以避免嚴(yán)重的生理傷害[7]。但是目前對于蚯蚓行為研究有待深入。

以往對于蚯蚓洞穴網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的評估往往因為洞穴的不透明而面臨挑戰(zhàn)。為了彌補以上不足，圓柱體橫截面上洞穴結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)被用來分析和預(yù)測洞穴結(jié)構(gòu)[8]。但預(yù)測模型中參數(shù)的獲取較為復(fù)雜，剖面中洞穴結(jié)構(gòu)、洞穴面積百分比、有機質(zhì)含量及位置、洞穴深度等都要求十分準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)難以獲取，且在操作過程中受人為因素干擾較重。因此2D玻璃裝置被應(yīng)用于土壤中蚯蚓行為的研究，雖然2D裝置抑制了蚯蚓的橫向運動，但該裝置可快速便捷地觀察蚯蚓的掘穴過程、洞穴結(jié)構(gòu)以及洞穴內(nèi)的運動狀況，因此，2D裝置在蚯蚓行為觀察上的便利性被學(xué)者們所重視。目前，單一污染物對蚯蚓的急性毒性研究[9]與蚯蚓運動的最大深度、蚓穴長度日增加值[10]等方面的研究頗豐，但重金屬復(fù)合污染下急性毒性效應(yīng)研究及掘穴行為響應(yīng)的研究少見報道。

基于此，本文首先通過濾紙急性毒性試驗法[11]探討了鉛鎘單一及復(fù)合污染對赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)的急性毒性效應(yīng)，然后采用2D裝置[12]評價蚯蚓對鉛鎘的掘穴行為響應(yīng)，以期為土壤毒理診斷及科學(xué)評價鉛鎘的生態(tài)安全性提供理論支持，為蚯蚓掘穴行為的洞穴長度與深度作為潛在且有前途的生物標(biāo)志物提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用重金屬為CdCl2與Pb(NO3)2，均購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，99.0%分析純。

供試動物：赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），系寡毛目正蚓科愛勝蚓屬，食碎屑類表棲型蚯蚓，對外源污染物具有廣泛敏感反應(yīng)，購自云南圣比科技有限公司。選用體重約300～500 mg，兩月齡以上發(fā)育良好、環(huán)帶明顯、大小基本一致的健康蚯蚓于供試土壤馴養(yǎng)，前期培養(yǎng)一周后用于實驗。

自制2D裝置：由兩個30 cm×42 cm（W×H）間隔3 mm，三周（左、右、下）圍密封且上端開口的有機玻璃制成，詳見圖1。

實驗土壤：在云南大學(xué)呈貢校區(qū)選取無人為干擾及污染的地塊采集土壤，風(fēng)干后過2 mm篩。土壤pH為5.54±0.14、總氮為155.40±31.27 mg/kg、總磷為317.50±52.87 mg/kg、有機質(zhì)為8.77±0.58 g/kg 。攤成薄層與重金屬混勻后，用于2D裝置評價蚯蚓對鉛鎘污染的掘穴行為響應(yīng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蚯蚓的急性毒性研究 本研究參考?xì)W盟推薦的濾紙接觸法進(jìn)行48 h急性毒性試驗。將蚯蚓置于人工氣候箱（溫度20±2℃、濕度75%），清腸3 h，洗凈后用吸水紙擦干。在每個放有直徑9 cm濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中添加1條赤子愛勝蚓，上層敷保鮮膜以免蚯蚓逃脫，在保鮮膜上扎數(shù)個小孔用以透氣。將配置好不同濃度的CdCl2與Pb(NO3)2溶液加入培養(yǎng)皿中使濾紙剛好濕潤，置于無光條件下培養(yǎng)，每個處理15個平行。分別在24 h、48 h統(tǒng)計蚯蚓的存活數(shù)，通過回歸方程得到重金屬處理濃度與時間和存活數(shù)之間的相關(guān)性，并計算LC10、LC20、LC25、LC30、LC40、LC50。

鉛單一急性毒性研究的鉛濃度設(shè)置為：0.00、133.33、266.67、400.00、533.33、666.67、800.00 mg/L。鉛鎘復(fù)合污染急性毒性研究采用鉛鎘單一急性毒性 的24 h、48 h的LC10、LC20、LC25、LC30、LC40、LC50作為各自濃度并對應(yīng)地組成一組濃度。

1.2.2 采用2D裝置評價蚯蚓對鉛鎘污染的掘穴行為響應(yīng)研究 將土壤攤開成均勻薄層，噴施重金屬溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蛞源_保土壤中重金屬的均一性，固定兩周后開始實驗。根據(jù)急性毒性效應(yīng)的LC50設(shè)計土壤處理濃度，鉛濃度：0、50、100、150 mg/kg，鉛鎘復(fù)合處理為：0/0、48 mg/kg Pb+11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb+23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb+35 mg/kg Cd。將配置好處理濃度的土壤倒入2D裝置中，調(diào)節(jié)土壤水分為50%，使得裝置中土壤密度為1.25 g/cm3；然后在每個裝置中投加1條蚯蚓，每個處理設(shè)6個平行；將裝置置于黑暗且溫度為17±1 ℃的培養(yǎng)箱中。每隔24 h用不同顏色彩鉛筆在透明紙張描繪洞穴結(jié)構(gòu)，持續(xù)7 d。觀察蚯蚓洞穴結(jié)構(gòu)，測定蚯蚓洞穴總長度、活動的每日最大深度。

1.3 測定方法

1）蚯蚓死亡判斷方法。根據(jù)《化學(xué)品 蚯蚓急性毒性試驗》（GB/T 21809-2008），以蚯蚓前尾部對輕微機械刺激沒有反應(yīng)為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2）蚯蚓洞穴結(jié)構(gòu)的測定。用CorelDraw將描繪的蚯蚓洞穴結(jié)構(gòu)圖轉(zhuǎn)化為矢量圖，之后采用CAD測量洞穴總長度與每日最大深度。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用概率分析法計算24 h和48 h LC50及其相關(guān)的95%置信限（95%CI）。采用Marking相加指數(shù)法[13]對鉛、鎘聯(lián)合毒性進(jìn)行評價，公式為：S=Am/Ai+Bm/Bi。式中S為毒性相加之和，A、B分別為受試毒物，其中i、m分別為單一毒性LC50值及混合毒性中A、B的含量。若S≤1時，相加指數(shù)AI =1/S-1；S＞1 時，AI=1-S。當(dāng)AI ＞ 0時，為協(xié)同作用；AI ＜0時，為拮抗作用；AI =0時，為相加作用。

所得實驗數(shù)據(jù)用excel進(jìn)行統(tǒng)計與圖表處理；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析，實驗結(jié)果以mean ± SD表示；采用單因素和雙因素方差（ANOVA）統(tǒng)計分析差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛單一及鉛鎘復(fù)合污染下蚯蚓的急性毒性研究

蚯蚓剛接觸鉛鎘時行為活躍，四處竄動。鉛鎘高濃度處理時，蚯蚓滲出黃色黏液，環(huán)帶明顯腫大。隨著處理時間延長，少數(shù)蚯蚓出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡個體環(huán)帶破裂，滲出黃色黏液，體表呈現(xiàn)顆粒狀凸起，且存在蚯蚓斷裂現(xiàn)象，死亡個體腥臭味較濃。同時，觀察發(fā)現(xiàn)存活蚯蚓通過身體卷曲、減少活動等行為來減少與重金屬的接觸以維持生命。

2.1.1 鉛污染下蚯蚓的急性毒性研究 鉛污染下蚯蚓進(jìn)行的毒性研究結(jié)果顯示，24 h、48 h赤子愛勝蚓存活率與Pb2+濃度在0.05水平上雙側(cè)顯著相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.901和0.925（表1），表明兩者具有良好的相關(guān)性。

從表1可以看出，24 h和48 h的LC50分別為773.40 mg/L、439.33 mg/L。24 h和48 h的LC50值之比為1.76，低于暴露時間之比，表明Pb2+單一暴露下，暴露濃度增高，赤子愛勝蚓對Pb2+毒性的抵抗性略有增強，受到的毒性效應(yīng)減弱。

土壤中污染物毒性均略低于濾紙染毒，因此后續(xù)掘穴行為響應(yīng)研究結(jié)合鉛48 h LC10（220.28mg/L）及本團隊野外實地調(diào)查（礦區(qū)周圍土壤樣品）結(jié)果，以確保蚯蚓的存活，因此最終確定蚯蚓掘穴行為實驗Pb2+濃度為0、50、100、150 mg/kg。

2.1.2 鉛鎘復(fù)合污染下蚯蚓的急性毒性研究 根據(jù)鉛、鎘單一急性毒性試驗的結(jié)果[11]，使用兩重金屬污染物24 h、48 h的LC10、LC20、LC25、LC30、LC40和LC50值作為各自濃度并對應(yīng)地組成一組濃度，詳見表2。采用對數(shù)擬合對于混合物中Cd2+、Pb2+濃度與赤子愛勝蚓死亡率的擬合度極好（R2分別為0.938 6、0.998 0），因此LC50是科學(xué)合理的（表3）。

從表3可以看出，當(dāng)Cd2+和Pb2+聯(lián)合作用于赤子愛勝蚓時，24 h LC50為102.37 mg/L Cd2+和345.62 mg/L Pb2+；48 h LC50為84.20 mg/L Cd2+和239.55 mg/L Pb2+。根據(jù)鉛鎘聯(lián)合急性毒性結(jié)果，低于鉛48 h LC10（220.28 mg/L）和鎘48 h LC10（77.29 mg/L），以確保蚯蚓的存活，確定蚯蚓掘穴行為復(fù)合處理鉛鎘濃度為CK、48 mg/kg Pb+11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb+23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb+35 mg/kg Cd。

2.1.3 鉛鎘對蚯蚓的聯(lián)合毒性評價 采用指數(shù)相加法評價鎘離子和鉛離子的聯(lián)合毒性效應(yīng)，從表4可以看出，暴露時間24 h、48 h下，對蚯蚓的聯(lián)合毒性AI＜0，其聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗。研究表明，不管污染物的聯(lián)合毒性為相加作用，還是協(xié)同或拮抗作用，其毒性比單一污染物都有一個毒性增大倍數(shù)，按照吳聲敢等[14]研究提供的有關(guān)污染物混合前后毒性增大倍數(shù)（BI）的計算公式：當(dāng)AI≥0時,BI= AI+1.0；當(dāng)AI＜ 0時, BI= 1/（1.0-AI）。對本次試驗結(jié)果進(jìn)行計算，表明混合后兩種重金屬的毒性比單種重金屬毒性的增大倍數(shù)為0.25（24 h）和0.27（48 h）。

2.2 鉛鎘污染下蚯蚓的掘穴行為研究

圖2展示了由赤子愛勝蚓在鉛脅迫下掘穴行為中形成的洞穴系統(tǒng)。當(dāng)土壤受到污染時，洞穴系統(tǒng)會發(fā)生很大的變化，洞穴長度和每日深度可以定量測定，洞穴系統(tǒng)的一般形狀：每平方米的三節(jié)點數(shù)、四節(jié)點數(shù)、行動面積、彎曲度等可以定性描述。從圖2可以看出，沒有鉛脅迫的土壤環(huán)境中蚯蚓的掘穴深度較長，彎曲度較大；而150 mg/kg鉛脅迫下，蚯蚓的掘穴深度最短，且彎曲度較小。

表1 鉛單一暴露對蚯蚓的急性毒性統(tǒng)計分析結(jié)果Table 1 Statistical analysis of acute toxicity of Pb2+ to earthworms

表2 復(fù)合急性毒性實驗的濃度設(shè)置Table 2 The concentration of compound acute toxicity experiment setting

表3 鉛鎘復(fù)合暴露對蚯蚓的急性毒性統(tǒng)計分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis of acute toxicity of Pb2+ and Cd2+ to earthworms

表4 Cd2+和Pb2+對蚯蚓的聯(lián)合毒性評價Table 4 Evaluation of acute toxicity of Cd2+ and Pb2+ to earthworms

2.2.1 鉛污染對蚯蚓洞穴結(jié)構(gòu)的影響研究 蚯蚓洞穴總長度隨鉛處理濃度及暴露時間的變化關(guān)系如圖3所示。從圖3可見，蚯蚓洞穴總長度受處理時間的影響。對照組洞穴總長度其他暴露時間顯著高于第1 d，且第7 d的洞穴總長度最長，為第一天的7.01倍，顯著增加；50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg鉛脅迫下，蚯蚓洞穴第7 d比第1 d長121.19 cm、75.49 cm和20.86 cm，可以看出隨著處理濃度的增加，蚯蚓洞穴增加的總長度顯著降低（P＜0.05）；通過蚯蚓洞穴長度與處理時間的回歸分析，除了對照組外，蚯蚓洞穴長度與時間呈線性正相關(guān)關(guān)系（R2＞0.93）。

此外，蚯蚓洞穴總長度受處理濃度的影響。除處理第1 d外，其他時間蚯蚓洞穴總長度隨著處理濃度的增加顯著降低（P＜0.05）。除處理第一天外，其他處理時間的蚯蚓洞穴長度隨著處理濃度的增加顯著降低；50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg鉛脅迫下，處理第2 d，蚯蚓洞穴長度比對照組分別降低52.70%、61.74%和90.21%，處理第7 d，分別降低11.89%、46.35%和83.97%，可見隨著處理濃度的增加，洞穴長度降低越顯著，蚯蚓活動能力顯著降低。鉛脅迫下蚯蚓在土壤中的每日最大深度如圖4所示。

蚯蚓洞穴的最大深度受鉛污染的影響與蚓洞總長度相似。洞穴最大深度隨著時間的延長而增加。處理1～4 d，100 mg/kg 鉛脅迫下，蚯蚓每日最大深度高于50 mg/kg，且第3 d和4 d達(dá)到顯著水平，而5～7 d，蚯蚓每日最大深度低于50 mg/kg，但均不顯著。對照組蚯蚓的活動范圍為0～12 cm土層深度，主要是赤子愛勝蚓為表棲型蚯蚓類型。而暴露于鉛污染下的蚯蚓大多都在0～10 cm范圍內(nèi)活動，但150 mg/kg 鉛脅迫下蚯蚓每日最大深度為4.66 cm，活動性較差。

蚯蚓洞穴的最大深度隨著鉛濃度的升高而降低。處理第1 d時，蚯蚓大都在0～7 cm土層深度活動，各處理間差異性較小，但顯著低于對照組。第2 d時，鉛脅迫下蚓洞最大深度變化較小，且對照處理下大幅增加，150 mg/kg處理與對照組差異顯著，且隨著時間的延長該差異進(jìn)一步降低，150 mg/kg鉛脅迫下蚯蚓活動深度于7 d內(nèi)分別為對照組的85.87%、83.34%、75.90%、75.94%、66.66%、58.95%、59.66%。對照組處理下蚯蚓在第7 d達(dá)到最大深度，而鉛污染處理下蚯蚓均于處理第6 d達(dá)到最大深度。

通過鉛暴露濃度與時間對蚯蚓掘穴行為的分析詳見表5，洞穴長度、每日最大深度與掘穴時間、鉛處理濃度均存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01）；經(jīng)雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，鉛暴露濃度和時間對洞穴每日深度影響不顯著（P＞0.05），而對洞穴長度影響極顯著（P＜0.001）。

表5 鉛暴露濃度與時間對蚯蚓掘穴行為的雙因素分析Table 5 Two-way ANOVA of lead concentration and time on burrowing behavior of Eisenia foetida

2.2.2 鉛鎘復(fù)合污染對蚯蚓洞穴結(jié)構(gòu)的影響研究 蚯蚓洞穴總長度隨鉛鎘復(fù)合處理濃度及暴露時間的關(guān)系如圖5所示。由圖5可知，蚯蚓的洞穴總長度受重金屬濃度及掘穴時間雙重因素的影響。48 mg/kg Pb + 11.67 mg/kg Cd脅迫下，蚯蚓活動于第5 d就停止了；144 mg/kg Pb + 35 mg/kg Cd脅迫下，蚯蚓活動第6 d停止了。各處理蚯蚓的洞穴總長度與對照差異顯著，但各處理濃度間差異不顯著。

蚯蚓在土壤中的每日最大深度如圖6所示。蚯蚓洞穴的每日最大深度受鉛鎘復(fù)合污染的影響與蚓洞總長度相似。各處理蚯蚓的洞穴最大深度與對照差異顯著，但各處理濃度間差異不顯著。48 mg/kg Pb/11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb/23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb/35 mg/kg Cd脅迫下蚯蚓分別在0～6.76 cm、0～4.55 cm、0～4.54 cm的土層深度活動，顯著低于對照組。

鉛鎘暴露濃度與時間對蚯蚓掘穴行為分析詳見表6，洞穴每日最大深度與鉛鎘處理濃度存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.001）；經(jīng)單、雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)，鉛鎘處理濃度、鉛鎘處理濃度×?xí)r間對洞穴長度影響極顯著（P＜0.001）。

表6 鉛鎘暴露濃度與時間對蚯蚓掘穴行為的雙因素分析Table 6 Two-way ANOVA of co-exposure of lead andcadmium and time on burrowing behavior of Eisenia foetida

3 討論

3.1 鎘、鉛污染對蚯蚓的急性毒性危害

關(guān)于重金屬對赤子愛勝蚓的急性毒性研究很多。研究表明，48 h鎘離子對赤子愛勝蚓的LC50為23.41 ug/cm2、鉛離子為48.21 ug/cm2[14]，高于Liu等[11]研究結(jié)果179.80 mg/L（8.48 ug/cm2）和439.33 mg/L（20.717 ug/cm2）。造成結(jié)果差異較大的原因可能包括赤子愛勝蚓的購買來源、濾紙大小差異與數(shù)據(jù)處理時曲線擬合的方式不同，文獻(xiàn)中是將直徑為11 cm的一層濾紙放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，即濾紙包住培養(yǎng)皿邊緣，并采用一元一次直線方程進(jìn)行擬合分析；而本實驗數(shù)據(jù)采用擬合度較好的對數(shù)曲線進(jìn)行分析。也有研究表明，48 h鎘離子對赤子愛勝蚓的LC50為192.1mg/L[15]，認(rèn)為造成差異的原因主要為供試生物選取、處理蚯蚓的數(shù)量、數(shù)據(jù)處理方法與試驗儀器等方面有差別，文獻(xiàn)中選取體重200 mg左右的赤子愛勝蚓（30條）在直徑為12.5 cm的培養(yǎng)皿（墊5層濾紙）進(jìn)行染毒，與本研究所用供試蚯蚓（300～500 mg）、培養(yǎng)皿（9 cm）相比蚯蚓更小而培養(yǎng)皿更大，可能存在染毒不充分且蚯蚓來源差異、前期生境、實驗條件（溫度、濕度等）差異等原因造成LC50與本研究結(jié)果存在差異。本研究表明，Cd2+對于赤子愛勝蚓的毒性為Pb2+的2.4倍。當(dāng)然，不同重金屬的毒性差異與重金屬理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)不同、作用于機體的致毒機理不同有關(guān)，具體毒性作用機理有待進(jìn)一步研究。此外，研究顯示，鉛離子對赤子愛勝蚓的毒性小于鎘離子的毒性[14]，與本實驗結(jié)果相同。

當(dāng)污染物的物理化學(xué)性質(zhì)相近時，由于作用途徑和方式相似，其在生態(tài)介質(zhì)（土壤、水體等）、代謝系統(tǒng)及細(xì)胞表面結(jié)合位點都會存在競爭；然而競爭的結(jié)果與污染物的種類、濃度比和吸附性等性質(zhì)緊密相關(guān)。因此，關(guān)于鉛鎘對動物的急性毒性聯(lián)合效應(yīng)的研究結(jié)果不一。本研究采用指數(shù)相加法評價得出鎘離子與鉛離子的聯(lián)合毒性效應(yīng)為拮抗作用。研究表明：用鉛鎘聯(lián)合對小鼠進(jìn)行吸入染毒實驗，表現(xiàn)為明顯的協(xié)同作用[16]。此外，Cd與Pb表現(xiàn)為有協(xié)同作用或拮抗作用的，低濃度Pb與Cd復(fù)合作用的急性毒性效應(yīng)表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用，但高濃度的Cd與Pb聯(lián)合作用表現(xiàn)出拮抗作用，還有Cd與Pb對聯(lián)合毒性表現(xiàn)為相加效應(yīng)，原因尚不明確。許多學(xué)者認(rèn)為可能是實驗條件的不同理化性質(zhì)差異、供試生物購買批次或個體差異、金屬離子在生態(tài)系統(tǒng)相互作用與競爭過程中影響重金屬的可利用性、不同金屬離子間的聯(lián)合毒性、金屬離子在生物體靶位點和生物體吸收位點上的相互作用等造成的[17]。

濾紙接觸時蚯蚓染毒的實驗方法十分簡單快捷，可以快速的探究重金屬毒性并建立劑量效應(yīng)關(guān)系。但是濾紙染毒的操作方法只存在皮膚接觸，未考慮蚯蚓新陳代謝與行為，不能反映客觀自然環(huán)境的真實情況。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，濾紙染毒與人工土壤實驗中所得致死濃度差距較小，因此本研究濾紙染毒方法得到的LC50為后續(xù)掘穴行為響應(yīng)研究的土壤重金屬濃度設(shè)計提供參考。

3.2 重金屬污染對蚯蚓掘穴行為的影響

在以往關(guān)于蚯蚓對重金屬脅迫響應(yīng)研究中，大部分關(guān)注蚯蚓體內(nèi)重金屬的積累、蛋白含量變化、抗氧化酶活性等生理響應(yīng)。而蚯蚓掘穴行為更能直觀的反應(yīng)蚯蚓對污染土壤的響應(yīng)。有關(guān)蚯蚓行為的研究大多集中在兩室趨避效應(yīng)上，蚯蚓為了規(guī)避毒害作用往往表現(xiàn)出遠(yuǎn)離污染源的運動規(guī)律[18]。規(guī)避是一種行為測試，具有快速、簡單、便宜等優(yōu)點，雖然不是毒性的定性測定，但是一種逃避行為的定量測定。例如，眾所周知，蚯蚓會避開一些有氣味的植物，如洋蔥，這些植物實際上對它們沒有毒性。施用農(nóng)藥后，在田間觀察到蚯蚓的表面遷移也可視為規(guī)避的結(jié)果。隨著重金屬污染問題日益嚴(yán)重，作為土壤工程師的蚯蚓通過可調(diào)節(jié)性范圍與機制的應(yīng)對策略適應(yīng)環(huán)境變化，其掘穴行為極大程度上決定著土壤結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，比如增加土壤孔隙度[19]，影響土壤容重和土壤透氣性，從而導(dǎo)致土壤養(yǎng)分循環(huán)及植物生產(chǎn)力的變化[20]。

本文研究了重金屬脅迫下赤子愛勝蚓洞穴最大深度、洞穴總長度等發(fā)生顯著改變，與重金屬種類、濃度顯著相關(guān)，但規(guī)避效應(yīng)的生態(tài)意義有待詳細(xì)研究。當(dāng)然，采用蚯蚓洞穴最大深度、洞穴總長度、日增加洞穴深度與洞穴長度等可以表征蚯蚓掘穴能力與探索土壤的能力。蚓洞總長度代表了蚯蚓探索土壤的能力，在活動過程中能改變土壤有機質(zhì)的空間分布，混合有機質(zhì)與礦質(zhì)土，形成富含有機質(zhì)的土壤團粒結(jié)構(gòu)，是蚯蚓改善土壤質(zhì)量的主要影響因素，但重金屬等污染脅迫顯著抑制了蚯蚓對土壤掘穴的這一過程。本研究表明，50、100和150 mg/kg鉛脅迫下，處理第7 d，蚯蚓洞穴長度比對照組分別降低11.89%、46.35%和83.97%。也有研究表明，0.5 mg/L和1 mg/L的吡蟲啉顯著改變了蚯蚓行為的洞穴長度、一段時間內(nèi)的總行程和洞穴再利用率等[21]?？梢?，重金屬污染降低了蚯蚓的運動能力，進(jìn)而降低改良土壤結(jié)構(gòu)和團聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而土壤質(zhì)量的變化必然對蚯蚓腸道微生物和土壤微生物豐度與多度產(chǎn)生影響[22]，從而可能間接影響土壤生態(tài)功能及質(zhì)量。

蚯蚓通過取食、掘穴等行為在土壤生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)與能量流動中發(fā)揮生態(tài)功能，其取食行為加速了有機質(zhì)的破碎和分解，掘穴行為增加了微生物與凋落物的接觸面積的同時加速了有機質(zhì)的混合；分泌與排泄行為促進(jìn)了微生物的生長與繁衍[23]，同時蚯蚓攝食大量土壤微生物，加速微生物組織的礦化，提高了土壤中可利用氮和磷含量，改善了土壤質(zhì)量；蚯蚓掘穴運動不僅加速了表層凋落物向深層沉降，而且促進(jìn)了有機質(zhì)與礦質(zhì)土的混勻，促使土壤團聚體的形成[24]，提高了土壤團聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。而以上過程均受蚯蚓洞穴總長度以及最大深度的限制。除此之外，蚯蚓行為可以用蚯蚓洞穴系統(tǒng)的面積、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、彎曲度和深度等表征[12]。

總之，急性毒性研究可以通過建立劑量-效應(yīng)關(guān)系，對重金屬的直接毒性與潛在風(fēng)險進(jìn)行評估[25]。但是蚯蚓在土壤中的運動狀況及掘穴行為很難被觀察，2D裝置內(nèi)蚯蚓的掘穴行為研究能很好的彌補以上問題[26]。蚯蚓行為不僅在評估重金屬污染及風(fēng)險評價方面較致死劑量更為敏感，而且蚯蚓行為是蚯蚓健康狀況、對土壤改善能力、生態(tài)系統(tǒng)中能量轉(zhuǎn)化的重要影響因素，同時在土壤生態(tài)系統(tǒng)中尤其是凋落物分解及物質(zhì)循環(huán)方面具有重要意義。

隨著重金屬污染問題日益嚴(yán)重，作為土壤工程師的蚯蚓通過可調(diào)節(jié)性范圍與機制的應(yīng)對策略適應(yīng)環(huán)境變化，其掘穴行為極大程度上決定著土壤結(jié)構(gòu)的狀態(tài)，比如增加土壤孔隙度，影響土壤容重和土壤透氣性，從而導(dǎo)致土壤養(yǎng)分循環(huán)及植物生產(chǎn)力的變化。可見，蚯蚓行為是決定土壤生態(tài)過程的重要環(huán)節(jié)，通過分析蚯蚓行為的變化可以揭示土壤結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)變的具體機制。蚯蚓是一種典型的土壤動物，是土壤動物區(qū)系的代表類群。蚯蚓對某些污染物非常敏感，因此利用蚯蚓作為土壤環(huán)境的指示生物，將蚯蚓抗氧化酶、溶酶體、總免疫力、熱休克蛋白和DNA損傷等指標(biāo)，同時結(jié)合蚯蚓行為指標(biāo)作為土壤生物標(biāo)志物具有潛在的重要科學(xué)意義。

4 結(jié)論

1）鉛單一污染下赤子愛勝蚓的半致死濃度48 h LC50為439.33 mg/L，根據(jù)48 h LC50得出鎘對赤子愛勝蚓的毒性為鉛的2.4倍；鉛鎘復(fù)合污染時赤子愛勝蚓的48 h LC50為Cd2+84.20 mg/L和Pb2+239.55 mg/L，對蚯蚓的聯(lián)合毒性AI＜0，因此，在實驗條件下兩者對蚯蚓的聯(lián)合毒性效應(yīng)為拮抗作用。

2）重金屬脅迫下顯著影響蚯蚓洞穴最大深度、洞穴總長度、日增加洞穴深度與洞穴長度等。隨著鉛單一、鉛鎘復(fù)合處理濃度的增加，蚯蚓洞穴總長度和每日最大深度與對照相比顯著下降，50 mg/kg、100 mg/kg和150 mg/kg鉛脅迫下蚯蚓洞穴總長度第7 d比第1 d分別長121.19 cm、75.49 cm和20.86 cm；48 mg/kg Pb/11.67 mg/kg Cd、96 mg/kg Pb/23.34 mg/kg Cd、144 mg/kg Pb/35 mg/kg Cd脅迫下蚯蚓分別在0～6.76 cm、0～4.55cm、0～4.54 cm的土層深度活動，顯著低于對照組。