林列坤,盧春生,周應生,鄭 義,楊菊紅,鄒繼彬,張仁超,梁旭競
組蛋白去乙?;?histone deacetylase,HDAC)是機體組蛋白乙?;{(diào)節(jié)的重要組成部分,乙?;揎検悄壳翱寡字委熝芯康男路较騕1-3]。HDAC抑制劑被廣泛應用于抗炎治療[4-7]。本文采用D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)聯(lián)合誘導建立小鼠慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)模型[8],觀察了HDAC抑制劑干預對小鼠肝組織HDAC mRNA水平的影響,以探討HDAC在ACLF發(fā)病過程中的作用,現(xiàn)報道如下。
1.1 動物、試劑、儀器與引物 4周齡SPF級雄性BALB/c小鼠28只,由武漢云克隆動物有限公司提供【動物生產(chǎn)許可證:SCXK(鄂)2015-0091,動物質(zhì)量合格證編號:42816300001640】,適應性飼養(yǎng)1 w。遵循3R原則使用動物,并經(jīng)過動物倫理委員會(IACUC)審核批準(編號為:IACU18-0077); 檢測血生化試劑由南京建成生物公司提供;美國Thermo提供RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為#K1622(第一鏈cDNA合成試劑),Roche提供FastStart Universal SYBR Green Master為04913914001(qPCR 染料)及其他一些提取RNA和RNA轉錄試劑;美國Omni 牌Bead Ruptor 12多樣品研磨珠均質(zhì)儀;北京DragonLab D3024R臺式高速冷凍微量離心機;美國ABI 7300熒光定量PCR儀。病理學檢測儀器由浙江省金華市科迪儀器設備有限公司提供;qPCR各種引物名稱及其序列見表1。
1.2 動物模型的建立 隨機將動物分為7組,每組4只。A組:對照組;B組:模型組;C組:曲古抑菌素 A(trichostatin A,TSA)處理組(0.5 mg.kg-1);D組:大劑量正丁酸鈉處理組(2000 mg.kg-1);E組:小劑量正丁酸鈉處理組(500 mg.kg-1);F組:大劑量NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbarmate, PDTC)處理組(200 mg.kg-1);G組:小劑量PDTC處理組(50 mg.kg-1)。除A組外,給予其他組小鼠20%CCL4油溶液5 ml.kg-1腹腔注射,2次/w,連續(xù)注射12 w,構建慢性肝功能受損小鼠模型。在12 w末,給予不同藥物處理組小鼠藥物經(jīng)尾靜脈注射,給予A組和B組注射等體積的生理鹽水。在藥物干預3 d后,給予D-Gal 1 g.kg-1和LPS 10 μg.kg-1腹腔注射,誘發(fā)急性肝衰竭,完成構建ACLF小鼠模型。給予各組模型小鼠戊巴比妥注射麻醉,無菌取血和肝臟。取肝組織,經(jīng)固定、脫水、包埋后,制作石蠟切片,HE染色,顯微鏡下觀察。
1.3 肝組織HDAC mRNA水平檢測 采用熒光定量PCR法,取肝組織100 mg,在勻漿器中研磨,得到RNA,加入無RNA酶水15μl溶解RNA,使其終濃度為200 ng/μl。加入RNA溶液2 μg,反轉錄,獲取cDNA。取0.2 ml PCR管,配制如下反應體系,每個反轉錄產(chǎn)物配制3管: 2× qPCR Mix 12.5μl,7.5μM基因引物2.0μl,反轉錄產(chǎn)物2.5μl, ddH2O 8.0μl。95℃,10 min;95℃,15 s,60℃,60 s,循環(huán)40次;再75℃~95℃,每20 s升溫1℃。以ΔΔCT法:A=CT(目的基因,待測樣本)- CT(內(nèi)標基因,待測樣本),B=CT(目的基因,對照樣本)- CT(內(nèi)標基因,對照樣本), K=A-B ,表達倍數(shù)=2-K。
表1 qPCR各種引物名稱及其序列
2.1 各組小鼠血清AST、ALT和TBIL水平比較 B組血清AST、ALT和TBIL水平顯著高于A組(P<0.05),不同HDAC抑制劑干預組血清AST、ALT和TBIL水平顯著低于B組(P<0.05,表2)。
表2 各組小鼠血生化比較
2.2 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn) A組肝小葉結構清晰,肝細胞呈條索狀排列,細胞無腫脹,匯管區(qū)無炎細胞浸潤;B組表現(xiàn)為肝細胞體積增大,呈彌漫性濁腫,匯管區(qū)見融合性壞死,小葉周邊充血和炎細胞浸潤;C組/D組/E組/F組/G組:肝細胞體積稍增大,輕度濁腫,匯管區(qū)見片狀或碎片狀壞死,少量炎細胞浸潤(圖1)。
2.3 各組小鼠肝組織Ⅰ類HDAC mRNA水平變化 四種HDAC水平一致,B組較A組顯著上升,而C、D、E、F和G組較B組顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表3)。
2.4 各組小鼠肝臟組織Ⅱ類HDAC mRNA擴增倍數(shù) 除DHAC4和DHAC10外,其他四種HDAC表現(xiàn)一致,B組較A組顯著上升, C、D、E、F、G組比B組明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表4)。
圖1 各組小鼠肝組織病理學表現(xiàn)(HE,200×)
表3 各組小鼠肝組織Ⅰ類HDAC mRNA水平比較
表4 各組小鼠肝組織Ⅱ類HDAC mRNA水平比較
HDAC是機體組蛋白乙?;秸{(diào)節(jié)的兩大組成之一,它與組蛋白乙?;?histone acetyltransferase,HAT)蛋白結構和酶活性保持高度的平衡[9-11], 稱為“乙?;瘎討B(tài)平衡”,對于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和平衡有重要的作用[12-15]。文獻報道,在疾病發(fā)生時,組蛋白乙?;胶獗淮蚱?,HDAC活性或含量升高[16]。本課題按實驗設計建立小鼠慢性肝損傷模型,然后給予不同劑量的HDAC抑制劑作為乙酰化調(diào)控藥物干預模型小鼠,再建立小鼠ACLF模型[8]。檢測小鼠肝臟組織Ⅰ類和Ⅱ類HDAC mRNA水平,從而明確HDAC在肝衰竭乙?;{(diào)控過程中的作用。HDACs共有18個成員,包括兩大家族,可分為四類[17]。本課題以常見的Ⅰ類和Ⅱ類HDAC為研究內(nèi)容。
本研究證明HDAC抑制劑的應用保護了肝衰竭動物,改善了肝組織學損傷[18],再次印證了乙酰化調(diào)控能有效保護肝衰竭。急性肝衰竭動物肝組織HDAC mRNA水平顯著上升,在乙?;深A后,各干預組肝組織HDAC mRNA水平顯著性下降,與相關研究結論一致。
HDAC代表機體去乙?;饔谩8嗡ソ邥r肝組織HDAC表達上升,機體去乙酰化作用增強。如果乙?;{(diào)控平衡被破壞,使用HDAC抑制劑干預后,肝組織HDAC表達大幅度下降,機體去乙?;饔脺p弱,乙?;饔迷鰪?,被破壞失衡的乙?;瘎討B(tài)平衡被調(diào)控,再次趨向平衡,這個過程能有效保護肝衰竭動物。由此可見,HDACs對ACLF有促進作用,而HDAC抑制劑對ACLF則具有保護作用。HDAC mRNA是應用乙?;{(diào)節(jié)治療肝衰竭時HDAC轉化表達的重要指標,代表肝臟的去乙?;饔茫琀DAC mRNA水平越低,表示HDAC表達越低,提示乙?;{(diào)節(jié)干預肝衰竭越有效。
從實驗結果可見,雖然肝衰竭動物肝組織Ⅰ類和Ⅱ類HDAC mRNA變化明顯,但也不是所有的HDAC mRNA均參與了肝臟的乙?;{(diào)控。在Ⅱ類HDAC中,HDAC4和HDAC10 mRNA水平在干預前后改變不明顯,可能意味著其在肝臟乙?;{(diào)控中作用不大。所以,我們可以發(fā)現(xiàn),不是所有的Ⅰ類和Ⅱ類HDAC都參與了肝臟的乙?;{(diào)控,各種HDAC的具體功能還有待進一步細化。在本實驗D組較E組或F組較G組均使用種類相同而大劑量的HDAC抑制劑,但HDAC mRNA水平未見明顯變化。我們認為肝臟啟動乙酰化調(diào)控是一種特殊的模式,與外加干預的抑制劑種類有關,而與抑制劑的濃度關系不大。
在真核細胞中,乙酰化修飾是最常見的共價修飾,其作用譜廣泛,在細胞內(nèi)發(fā)揮重要的修飾作用,目前應用最廣泛的為抗炎治療的應用。本研究應用乙?;{(diào)控干預肝衰竭動物,就是其抗炎功效發(fā)揮了作用。HDAC mRNA是乙?;揎椀呢撓嚓P指標,在肝衰竭干預治療過程需要增強機體的乙?;饔?,減弱去乙?;饔?,從而促進肝衰竭病情的緩解[6]。乙?;{(diào)控在肝臟衰竭干預過程中的作用日漸明顯,首先通過乙?;{(diào)控降低HDAC mRNA在靶向器官中的表達。在干預肝組織炎癥,促進肝臟功能恢復和誘導肝衰竭病情好轉方面發(fā)揮作用。本研究進一步佐證了控制肝臟的炎癥反應能阻斷肝衰竭進展。定量檢測受損器官HDAC mRNA擴增水平是監(jiān)測機體乙?;潭戎匾慕M分。