甘勇輝 連建技

(1 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院 福建漳州363000;2 儒蘭(福建)生物科技有限公司 福建南靖 363600)

植物葉綠素含量與植物光合作用、營養(yǎng)吸收狀況等密切相關(guān)，是植物生長期間對環(huán)境條件反應(yīng)敏感的生理指標(biāo)之一，被廣泛作為栽培植物生長的常測指標(biāo)項目。適時對植物葉綠素含量進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，能及時掌握植物生長狀況，尤其是林下或大棚種植的陰生植物［1-2］。葉綠素a、葉綠素b在單色光區(qū)（紅光區(qū)）具有不同吸收反應(yīng)最敏感波長（峰）。根據(jù)朗伯-比爾定律，最大吸收光譜峰不同的兩個組分的混合液，其各組分濃度與吸光度值之間可建立聯(lián)立方程，通過測定混合液在相應(yīng)波長的吸光度值，即可求得提取液中葉綠素a、b 含量，進(jìn)而計算出單位葉片（嫩技段等）含葉綠素的量。分光光度計測定是目前葉綠素測定最常用方法［3-4］。金線蓮（Anoectochilus roxburghii）為蘭科開唇蘭屬，是名貴的中藥材，因富含多糖、黃酮、生物堿等成分而廣受消費者喜愛［5-6］。目前野生金線蓮資源日益枯竭，現(xiàn)以人工大棚及林下仿野生栽培為主要種植生產(chǎn)方式。金線蓮是陰生草本植物，因種植環(huán)境條件尤其是光照差異葉色變化輻度大，葉綠素含量變化測定是監(jiān)測其生長狀況的指標(biāo)之一。葉綠素提取液制備傳統(tǒng)方法是研磨法，此法存在葉綠素易見光分解、操作繁瑣、洗滌容器易造成誤差等不足，已有不少研究者采用浸提法，取得了較好效果，但已有報道均以陽生植物葉片為研究材料［2，7-12］。本研究同時采用5種葉綠素浸提劑，并對陰生植物金線蓮葉片葉綠素進(jìn)行浸提測定，比較分析其浸提效果，以篩選適宜的葉綠素浸提液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

供試品種為金線蓮紅霞，2019 年10 月以組培苗移栽于儒蘭（福建）生物科技有限公司南靖云水瑤洋頂崠林下種植基地，于2020 年5 月16 日采樣測定。

1.1.2 儀器及試劑

紫外可見分光光度計（UV-1800，PC 型，上海翱藝儀器有限公司）；甲醇、95%乙醇、80%丙酮、丙酮-乙醇混合液（按體積比1∶1 混合）、二甲基亞砜。上述藥品除95%乙醇（上海國藥）外均為分析純或由分析純藥品與純凈水按體積比配制。

1.2 方法

1.2.1 提取液制備

選取生長一致的林下種植金線蓮植株，剪取倒數(shù)第2 葉，擦凈葉片。選取90 片葉隨機(jī)分成3份，編號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，每份30 片。取第Ⅰ份30 片葉以打孔器（直經(jīng)12 mm）在每張葉片主脈兩側(cè)對應(yīng)部位各取2個圓片并分開放至兩個燒杯中，依次打取完30 個葉片，則共得2 小份，每小份30 個葉圓片。取其中1小份按圓片材料的多少由高到低分組為10、8、6、4、2 個圓片，分別作為1、2、3、4、5 五個處理，并把圓片剪成2 mm 細(xì)絲無損放入標(biāo)記好的5 個具塞刻度試管中，5 個試管分別加入甲醇提取液至20 mL；取剩下的另1小份同樣按10、8、6、4、2 個圓片分成1、2、3、4、5 五個處理，并把圓片剪成2 mm細(xì)絲無損放入標(biāo)記好的5個具塞刻度試管中，5 個試管分別加入95%乙醇至20mL。取第Ⅱ份30 片葉片以上述同樣方法取葉圓片并分做2 小份，每份分成5 個處理，同樣地分別加入80%丙酮、丙酮-乙醇混合液（1∶1）至20 mL；再以第Ⅲ份30 片葉片以相同方法取2 小份，取其中的1 小份分成5 個處理，同樣5 個試管分別加入二甲基亞砜至20 mL。把刻度試管封口后置室溫暗處浸泡提取，待材料變白后吸取清液用紫外可見分光光度計比色測定吸光度值。分別以各對應(yīng)提取液為空白調(diào)零。

1.2.2 指標(biāo)測定

甲醇提取液用紫外可見分光光度計在665、650 nm 波長下測定吸光度，95%乙醇提取液在665、649 nm波長下測定吸光度，并依據(jù)文獻(xiàn)［13］中的公式計算葉綠素含量。

80%丙酮、丙酮-乙醇提取液在663、645 nm 波長下測定吸光度，并依據(jù)文獻(xiàn)［13］［14］中的公式計算葉綠素含量。

二甲基亞砜提取液在665、649 nm 波長下測定吸光度，并依據(jù)文獻(xiàn)［14］［15］中的公式計算葉綠素含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用成對法t測驗進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素a浸提含量差異

由表1 可知，5 種提取液提取的金線蓮葉綠素a含量：80%丙酮＞二甲基亞砜＞丙酮-乙醇＞甲醇＞95%乙醇。5 種浸提液中80%丙酮、二甲基亞砜兩者的葉綠素a 含量都極顯著高于甲醇和95%乙醇；丙酮-乙醇的葉綠素a 含量也顯著高于甲醇和95%乙醇（表2、圖1）。表明80%丙酮、二甲基亞砜、丙酮-乙醇等浸提金線蓮的葉綠素a 的效果優(yōu)于醇類。

2.2 葉綠素b浸提含量差異

由表1 可知，5 種提取液提取的金線蓮葉綠素b 含量：80%丙酮＞丙酮-乙醇＞95%乙醇＞甲醇＞二甲基亞砜。80%丙酮、丙酮-乙醇和95%乙醇的葉綠素b含量極顯著高于二甲基亞砜，甲醇的葉綠素b 含量顯著高于二甲基亞砜（表2、圖2）。在葉綠素a、b提取效果上，80%丙酮都有最好的表現(xiàn)，而二甲基亞砜則表現(xiàn)出較大的差異，對葉綠素b的提取不完全。

表1 五種提取液提取測定金線蓮葉綠素含量

表2 金線蓮葉綠素含量測定結(jié)果分析

圖1 五種浸提液浸提葉綠素a含量

圖2 五種浸提液浸提葉綠素b含量

2.3 葉綠素a+b浸提含量差異

由表1 可知，5 種提取液浸提測定的葉綠素a+b 含量：80%丙酮＞丙酮-乙醇＞二甲基亞砜＞95%乙醇＞甲醇。80%丙酮的葉綠素a+b 含量顯著高于二甲基亞砜、極顯著高于95%乙醇及甲醇，丙酮-乙醇的葉綠素a+b 含量顯著高于95%乙醇、極顯著高于甲醇（表2、圖3）。結(jié)果表明：80%丙酮、丙酮-乙醇浸提測定葉綠素a+b 的效果好于二甲基亞砜、95%乙醇和甲醇。

圖3 五種浸提液浸提葉綠素a+b含量

2.4 葉綠素a/b值差異

由表1 可知5 種提取液浸提測定的葉綠素a/b值：二甲基亞砜＞甲醇＞丙酮＞丙酮-乙醇＞95%乙醇。二甲基亞砜浸提測定的a/b值極顯著高于甲醇、丙酮、丙酮-乙醇和95%乙醇（表2、圖4）。二甲基亞砜（DMSO）浸提測定的葉綠素a/b值極顯著偏高應(yīng)與其提取葉綠素b效果差有關(guān)。

圖4 五種浸提液浸提葉綠素a/b值

3 討論

根據(jù)比爾定律，用于比色測定的溶液濃度不宜太高，否則會影響透光率，導(dǎo)致吸光度讀數(shù)不準(zhǔn)確，進(jìn)而影響葉綠素含量測定的準(zhǔn)確性［8，16］。本研究以5 種提取劑并采用5 個浸提濃度浸提測定金線蓮葉片葉綠素含量值，結(jié)果顯示由各處理濃度的吸光度讀數(shù)計算的測定值勻較為穩(wěn)定，說明在本試驗葉綠素濃度范圍內(nèi)符合比爾定律的測定濃度要求。5 種提取劑浸提測定結(jié)果表現(xiàn)為80%丙酮、丙酮-乙醇混合液（1∶1）浸提測定的葉綠素a+b 值在5 種浸提液中居第一和第二位，且兩種提取液浸提測定的葉綠素a+b、葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b 值等差異均不顯著。說明丙酮或丙酮-醇混合液是浸提測定金線蓮葉綠素的比較好的浸提液，浸提效果優(yōu)于醇和DMSO。醇類浸提測定的金線蓮葉綠素a+b值顯著偏低，可能是醇類對葉部細(xì)胞浸透性較差，對相關(guān)色素萃取溶解不完全導(dǎo)致。

在本研究的5種提取液中，DMSO浸提測定的葉綠素a/b 值極顯著偏高，這應(yīng)該與葉綠素b 的分子結(jié)構(gòu)特點有密切關(guān)系。葉綠a 與葉綠素b 結(jié)構(gòu)上的差異在于第Ⅱ吡咯環(huán)上由一個甲基（-CH3）取代成一個羰基（-CHO），因此葉綠素b的極性增強(qiáng)了，而5 種浸提液中只有DMSO 是非極性溶劑，浸提葉綠素b的作用受到影響，浸提效率顯著或極顯著低于酮、酮-醇、醇提取液，進(jìn)而影響了葉綠素a+b測定值（顯著低于80%丙酮浸提測定值）及葉綠素a/b 值，此結(jié)果也可能與葉綠素b 在非極性溶劑DMSO 浸提液中穩(wěn)定性較差、易分解有關(guān)，另外DMSO 也有一定的毒性。上述因素說明在選用DMSO作為葉綠素浸提劑時應(yīng)慎重。

在本試驗5種提取液浸提測定金線蓮葉綠素含量中，葉綠素a+b 值最高為80%丙酮浸提，表明金線蓮葉部具有較高的葉綠素a+b值和較低的葉綠素a/b 值（＜3.0），與陰生植物生長于遮陰環(huán)境下，要依賴較高密度的聚光色素以捕獲更多的光能、完成必要的光合作用，以完成其生長周期的現(xiàn)象基本一致［17］。而金線蓮組培種苗在移栽后對光照適應(yīng)能力有所增強(qiáng)，且在較強(qiáng)光照條件下種植的金線蓮植株木質(zhì)化程度高，多糖含量相應(yīng)提高，致于能承受多強(qiáng)的光照強(qiáng)度、葉綠素含量會呈現(xiàn)怎樣的相應(yīng)變化及其與生物量關(guān)系等，則有待進(jìn)一步的研究。