鄧加艾，李霜，趙溪巖，勾洵通信作者)

（1.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199；2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

0 引言

阿茲海默癥（Alzheimer's disease, AD）是一種最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，起病隱秘，病程緩慢，罹患癡呆癥患者中50%～70%為此類(lèi)病癥[1]。阿茲海默癥的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確，其特征性病理改變?yōu)樵谀X組織內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積形成和tau 蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)等[2,3]。患者常表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患者學(xué)習(xí)記憶能力[4]。

研究學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)方法有多種，其中空間學(xué)習(xí)記憶研究方法常見(jiàn)的有Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris water maze,MWM），非空間學(xué)習(xí)記憶研究方法常見(jiàn)的有新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（Object Recognition Test, ORT）。Morris 水 迷 宮 實(shí) 驗(yàn) 由Morris 1981 年發(fā)明[5]，為一種迫使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠）在圓形池子里游泳，重復(fù)尋找水中特定平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)方法，常見(jiàn)于對(duì)空間位置和空間定位的測(cè)試。一般分有持續(xù)訓(xùn)練、定位航行和空間探索三個(gè)階段，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤與拍攝，采用相關(guān)軟件對(duì)運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì)[6]。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物先天具有對(duì)新物體探索傾向的能力而建立的學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方法[7]。在特定形狀（可為圓形、矩形、Y 型等）的場(chǎng)地內(nèi)放置對(duì)稱(chēng)的兩個(gè)完全相同的物體，一段時(shí)間內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（如小鼠）探索物體時(shí)長(zhǎng)與次數(shù)，幾天后將其中一個(gè)物體替換成新事物，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索新事物與舊物體的次數(shù)與時(shí)長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤與拍攝，記錄數(shù)據(jù)[8]。

現(xiàn)有研究[9-12]多為探討不同藥物對(duì)阿茲海默癥患者的治療效果，而其對(duì)不同類(lèi)型學(xué)習(xí)記憶影響的差異尚未可見(jiàn)，本研究通過(guò)阿茲海默癥對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶與非空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷的差異，探討阿茲海默癥對(duì)不同類(lèi)型學(xué)習(xí)記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌雄C57BL/6J SPF 小鼠，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2015-030]，（20±2）g，室溫：（20±2）℃，自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 儀器與藥品

Morris 水迷宮系統(tǒng)購(gòu)于淮北正華生物儀器設(shè)備公司，萬(wàn)分之一電子天平購(gòu)于北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)于湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，β-淀粉樣蛋白 (Aβ)購(gòu)于Sigma，戊巴比妥鈉與氨水均購(gòu)于北京索萊寶。

1.3 Aβ25-35 寡聚體的制備

取Aβ 1 mg，4℃靜置30 min，加入六氟異丙醇1 mL 溶解，靜置2 h，超聲；14000 rpm 離心20 min，取上清；液氮凍實(shí)后，冷凍干燥12 h，得到處理好的絮狀A(yù)β；200 L 1%氨水溶解，37℃孵育72 h；同時(shí)取4 mL 溶解后的液體用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度；取出孵育好的Aβ，依照測(cè)定濃度用0.01 M PBS稀釋至1 mg/mL。

1.4 分組與動(dòng)物模型構(gòu)建

取24 只小鼠，雌雄對(duì)半，隨機(jī)分為四個(gè)組：雌性AD 組，雌性對(duì)照組，雄性AD 組，雄性對(duì)照組，每組各6 只。小鼠在恒溫、恒濕的SPF 級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)性飼喂1 周，嚴(yán)格控制12 h光照/黑暗，環(huán)境溫度設(shè)定為24°C，適應(yīng)期間小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1 周后將小鼠稱(chēng)重麻醉后臺(tái)面上，用手術(shù)刀沿小鼠頭中逢做一小切口；使用腦定位儀確定小鼠頭部海馬區(qū)位置；用顱鉆鉆孔，左右各1 個(gè)，深度2 mm。旋轉(zhuǎn)腦定儀上的卡尺，移動(dòng)微量注射泵至小鼠雙孔上空，待進(jìn)樣針抵住小鼠頭皮后，進(jìn)針深度為3～4 mm；雄性AD 組與雌性AD 組小鼠以1 μL/min恒速注射1.5 μL Aβ25-35；雄性對(duì)照組與雌性對(duì)照組則注射同等計(jì)量含有氨水與PBS 相同比例的溶液；留針30 s，緩慢退針，退針后用牙科膠覆蓋小孔；縫合，術(shù)后3 d 連續(xù)腹腔注射青霉素鈉防止感染。一般有持續(xù)訓(xùn)練、定位航行和空間探索三個(gè)階段，

1.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

藥物干預(yù)4 周后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮深80 cm，直徑180 cm，液體為牛奶稀釋液，實(shí)驗(yàn)分為3 個(gè)階段。第一階段是為時(shí)3 d 的持續(xù)訓(xùn)練階段，小鼠面向池壁，從第一象限放入水中，讓其在90 s 內(nèi)自由尋找第三象限的平臺(tái)，每天3 次，不記錄實(shí)驗(yàn)時(shí)間；如果小鼠在90 s 內(nèi)無(wú)法找到平臺(tái)，需用木棍將小鼠以直線(xiàn)距離引導(dǎo)至平臺(tái)休息30 s。第二階段是連續(xù)5 d 定位巡航階段，同一位置面向池壁放入小鼠，記錄其找到并登上平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期，Escape Latency），重復(fù)3 次。第三階段是為時(shí)1 d 的空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，記錄小鼠在90s 內(nèi)穿越過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)。采用Morris 水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)的采集和處理。

1.6 新物體識(shí)別測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)采用40*40*50cm 白色開(kāi)口木箱。第1 d 木箱中不放置任何物體，將每只小鼠放入場(chǎng)地中央自由活動(dòng)5 min，以方便小鼠適應(yīng)新環(huán)境。第2～3 d 進(jìn)行訓(xùn)練，將A，B 兩個(gè)完全相同的物體以相互對(duì)稱(chēng)的方式放置在木箱的兩端，小鼠從A、B 兩個(gè)物體相等的位置以背對(duì)的方式放入場(chǎng)地內(nèi)并記錄小鼠探索情況，包括鼻子或嘴巴觸碰物體的次數(shù)和時(shí)間，試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為5 min，記錄小鼠的探索情況。第4 d 將場(chǎng)地內(nèi)的B 物體換作不一樣的C 物體，放入小鼠，記錄其對(duì)C 物體探索情況，觀察5 min。

新物體探究識(shí)別指數(shù)(RI)=探索新對(duì)象時(shí)間/(探索新對(duì)象時(shí)間+探索熟悉對(duì)象時(shí)間)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用Graphpad prism 5 處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行分析，組間顯著性差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 阿茲海默對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 阿茲海默對(duì)小鼠逃避潛伏期的影響

圖1（A）中1～5 d，雄性AD 組逃避潛伏期高于雄性對(duì)照組（P＜0.05），且天數(shù)越大，逃避潛伏期所用時(shí)間越長(zhǎng)；圖1（B）中前3 d，雌性AD 組逃避潛與其對(duì)照組小鼠沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），在第4～5 d，雌性AD 組逃避潛伏期高于其雌性對(duì)照組（P＜0.05）；圖2 可以看出，雄性對(duì)照組、雌性對(duì)照與雄性AD 組的逃避潛伏期曲線(xiàn)均有不同程度下降，而雌性AD 組曲線(xiàn)趨勢(shì)變化相對(duì)不明顯。

圖1 阿茲海默對(duì)小鼠逃避潛伏期的影響

圖2 不同天數(shù)小鼠逃避潛伏期趨勢(shì)圖

2.1.2 阿茲海默對(duì)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的影響

圖3 中，雄性對(duì)照組穿越平臺(tái)次數(shù)高于雄性AD組（P＜0.05），雌性對(duì)照組與雌性AD 組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

圖3 阿茲海默對(duì)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)的影響

2.2 阿茲海默對(duì)非空間學(xué)習(xí)記憶的影響

2.2.1 阿茲海默對(duì)小鼠新物體識(shí)別能力的影響

圖4 中可以看出，雄性對(duì)照組小鼠RI 值明顯高于雄性AD 組小鼠（P＜0.05），雌性亦然（P＜0.05）。

圖4 阿茲海默對(duì)RI 值的影響

3 討論

阿茲海默癥是神經(jīng)性退行性疾病中最主要的病癥之一，是危害中老年人健康的重要病癥[13-14]。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中雄性AD 組小鼠逃避潛伏期（圖1A）與穿越平臺(tái)次數(shù)（圖3）均明顯高于其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組，說(shuō)明阿茲海默癥對(duì)雄性小鼠的空間記憶功能有損傷。同時(shí)表明水迷宮實(shí)驗(yàn)可成為判斷雄性小鼠AD 模型建造是否成功的行為學(xué)檢測(cè)方法。

而雌性AD 組與其對(duì)照組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，第4～5 d，逃避潛伏期（圖1B）存在顯著性差異，而穿越平臺(tái)次數(shù)（圖3）無(wú)明顯差異。其中逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)需測(cè)試小鼠尋找到平臺(tái)并登上平臺(tái)的時(shí)間。而穿越平臺(tái)次數(shù)是將平臺(tái)隱藏，測(cè)試小鼠90 s 內(nèi)穿越隱藏平臺(tái)的次數(shù)，在該實(shí)驗(yàn)中，小鼠無(wú)需登上平臺(tái)。因此，逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)中造成結(jié)果顯著性差異的因素還包括實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于小鼠體力等因素導(dǎo)致爬上平臺(tái)所花費(fèi)時(shí)間差異，而不是單純測(cè)試小鼠對(duì)平臺(tái)位置記憶能力。雌性小鼠AD 組與對(duì)照組，在平臺(tái)穿越次數(shù)實(shí)驗(yàn)中無(wú)顯著性差異，由此說(shuō)明阿茲海默癥對(duì)雌性小鼠的空間記憶功能損傷程度較小或不明顯。同時(shí)，水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯蔀榕袛啻菩孕∈驛D 模型建造成功的行為學(xué)檢測(cè)方法有待進(jìn)一步探究。

在新物體識(shí)別測(cè)試中，小鼠對(duì)新物體觸碰的時(shí)間越長(zhǎng)說(shuō)明其對(duì)新物體的學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)，RI 值也越大[15]。兩組對(duì)照組的RI 值均明顯高于其對(duì)應(yīng)的AD 組（圖4），說(shuō)明AD 小鼠對(duì)新事物學(xué)習(xí)認(rèn)知能力比對(duì)相應(yīng)對(duì)照組照組差，揭示阿茲海默癥對(duì)雄性和雌性小鼠的非空間學(xué)習(xí)記憶均產(chǎn)生損傷。同時(shí)表明新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)可成為判斷雄性和雌性小鼠AD 模型建造是否成功的行為學(xué)檢測(cè)方法。

綜上實(shí)驗(yàn)，阿茲海默癥對(duì)雄性小鼠空間學(xué)習(xí)記憶與非空間學(xué)習(xí)記憶能力都存在影響，而對(duì)雌性小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響不顯著，對(duì)其非空間學(xué)習(xí)記憶能力影響較大。