牛鑫 柴倩囡 馮九海

摘要：鬼傘是一類菌柄能在短時(shí)間內(nèi)快速伸長并且傘蓋易自溶形成墨汁的蘑菇，菌柄在伸長過程中細(xì)胞壁以伸長生長為主，細(xì)胞壁組分β-1，3-葡聚糖發(fā)生重構(gòu)修飾，GH72家族的β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑤^低聚合度的寡糖轉(zhuǎn)化生成更高聚合度的糖鏈。β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶可能參與鬼傘菌柄細(xì)胞壁中β-葡聚糖組分的重構(gòu)修飾。以完成測序并有注釋信息的灰蓋擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）、擬鬼傘（Coprinopsis marcescibilis）、晶粒小鬼傘（Coprinellus micaceus）和小脆柄菇（Psathyrella aberdarensis）等4種鬼傘的β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)，采用TargetP、WOLF PSORT、SignalP、Sompa、TMHMM 2.0、Big-PI Fungal Predictor、MEME和SISS-MODEL等生物信息學(xué)分析工具對(duì)其開展蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、細(xì)胞信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋、糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點(diǎn)、基序以及三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)上述序列開展遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入開展該蛋白在菌柄伸長過程中細(xì)胞壁β-葡聚糖組分的重構(gòu)修飾研究作基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：真菌細(xì)胞壁;菌柄伸長;β-1，3-葡聚糖;細(xì)胞壁重構(gòu);多序列比對(duì);生物信息學(xué)

鬼傘（coprinoid mushrooms）是一類子實(shí)體形成后，菌柄能快速伸長，傘蓋易自溶形成墨汁的大型擔(dān)子菌傘菌[1]。舊的分類系統(tǒng)中鬼傘科（Coprinaceae）包含鬼傘屬（Coprinus）、小脆柄菇屬（Psathyrella）和斑褶菇屬（Panaeolus），依據(jù)第10版《真菌詞典》最新分子系統(tǒng)學(xué)研究表明，鬼傘屬已移至蘑菇科（Agaricaceae），小脆柄菇提升到科分類級(jí)別，舊的鬼傘屬中大部分成員被劃分至擬鬼傘屬（Coprinopsis）、小鬼傘屬（Coprinellus）和近地傘屬（Parasola），其與小脆柄菇屬（Psathyrella）等屬組成小脆柄菇科（Psathyrellaceae），也就是現(xiàn)在的鬼傘科[2-4]。鬼傘菌柄的生長方式是一種類似植物胚芽鞘的頂端生長，其主要特征是細(xì)胞主要進(jìn)行伸長生長，細(xì)胞基本不進(jìn)行分裂[5]。蘑菇菌柄細(xì)胞壁的伸長生長理論經(jīng)歷了“水解酶模型”[6-7]，“細(xì)胞膨壓理論”[8]以及“水解酶-膨壓折衷理論”[9]等，最新研究表明，特定的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶[10]和內(nèi)切 β-1，3-葡聚糖酶均能引起滅活菌柄的伸長[11]。

真菌細(xì)胞壁主要由葡聚糖、糖蛋白和幾丁質(zhì)組成，對(duì)真菌的生存、生長和真菌細(xì)胞的形態(tài)至關(guān)重要[12-13]。盡管它是剛性結(jié)構(gòu)，但它在細(xì)胞生長過程中具有可塑性，并能適應(yīng)環(huán)境，因此，真菌細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的、有個(gè)組分相互交聯(lián)在一起形成一個(gè)高強(qiáng)度的具有可塑性的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)[13]。有4個(gè)家族的糖基水解酶或者糖基轉(zhuǎn)移酶已被證明在細(xì)胞壁組分的交聯(lián)中發(fā)揮作用[12]。GH16家族水解酶（β-葡聚糖酶）已被證明可能參與葡聚糖和幾丁質(zhì)的交聯(lián)[14-15]。GH17家族水解酶（β-葡聚糖酶）在葡聚糖之間的交聯(lián)中起作用[16-17]。GH76家族的甘露聚糖酶在細(xì)胞壁的生物發(fā)生中起作用[18-19]。GH72家族葡聚糖轉(zhuǎn)移酶已被證明是形成正常細(xì)胞壁必不可少的，能夠與β-1，3-葡聚糖交聯(lián)在一起。這些細(xì)胞壁重構(gòu)酶中，尤其是GH72家族的β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶為細(xì)胞壁提供了可塑性[20]。這些酶主要參與真菌細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)多糖 β-1，3-葡聚糖的重構(gòu)修飾，它們能夠水解至少含10個(gè)葡萄糖單元的昆布寡糖中的β-1，3-糖苷鍵，并且把新形成的帶還原性末端的供體（含有5個(gè)以上葡萄糖單元）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)β-1，3-寡聚糖的非還原性末端（受體）形成聚合度更高的寡糖。除 β-1，3-葡聚糖合成酶合成延長葡聚糖鏈外，這種轉(zhuǎn)糖苷酶反應(yīng)產(chǎn)生新的β-1，3糖苷鍵為β-1，3葡聚糖鏈的延長提供了另一種作用或者是協(xié)同作用機(jī)制[21]。迄今為止，這類酶在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、白色念珠菌（Candida albicans）等酵母和絲狀真菌中具有廣泛的研究，釀酒酵母中這類蛋白被命名為Gasp（表面錨定糖酯類蛋白），煙曲霉中為Gelp（葡聚糖延伸蛋白），白色念珠菌中則為Phrp（pH值響應(yīng)蛋白）[22-23]。在酵母菌中，這些糖基轉(zhuǎn)移酶在孢子和菌絲的細(xì)胞壁組裝中具有重要作用，并在菌絲營養(yǎng)生長條件下維持細(xì)胞壁的完整性，是粟酒裂殖酵母生存不可缺少的[24]，煙曲霉中編碼Gel4蛋白的基因也是必需基因[21]，但在大型傘菌中對(duì)該基因的研究較少。

本研究選取已完成基因組測序且有注釋信息的4種鬼傘：灰蓋擬鬼傘（Coprinopsis cinerea）、擬鬼傘（C. marcescibilis）、晶粒小鬼傘（Coprinellus micaceus）和小脆柄菇（Psathyrella aberdarensis），對(duì)其β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行生物信息學(xué)和遺傳進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根據(jù)煙曲霉中已報(bào)道的β-1，3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶Gel1蛋白序列（登錄號(hào)：XP_749253.1），在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫中的組裝庫（Assembly）中分別檢索“Coprinopsis”“Coprinellus”“Psathyrella”，獲得CC3、Copmar1、Copmic2和ASM412641v1等4個(gè)基因組組裝數(shù)據(jù)，分別點(diǎn)擊“BLAST the assembly”選項(xiàng)進(jìn)入“BLAST”比對(duì)界面，點(diǎn)擊切換至tblastn，將Gel1蛋白登錄號(hào)XP_749253.1粘貼至文本框，點(diǎn)擊BLAST，對(duì)期望值小于10-3的結(jié)果點(diǎn)擊GenBank從Feature中查看CDS詳情獲得“protein_id”。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白信號(hào)肽預(yù)測 利用SignalP 5.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線預(yù)測蛋白的信號(hào)肽。

1.2.2 蛋白的基本理化性質(zhì)預(yù)測 利用ExPASy中的ProtParam（http：//web.expasy. org/protparam/）對(duì)蛋白的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族系數(shù)和總平均疏水指數(shù)等基本理化參數(shù)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.3 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測 利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用Sompa（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？ page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對(duì)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.6 糖基化磷脂酰肌醇（GPI）修飾預(yù)測 利用big-PI Fungal Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi _server.html）對(duì)蛋白的GPI修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.7 蛋白基序（motif）分析 采用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)蛋白序列中的基序進(jìn)行分析。

1.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 在NCBI中找尋Gel的同源序列，利用MEGA 7中的Clustal X進(jìn)行多重比對(duì)分析，然后以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.9 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SWISS-MODE（http：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)蛋白進(jìn)行同源建模預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gel蛋白序列及其信號(hào)肽、基本理化特性和亞細(xì)胞定位分析

通過煙曲霉Gel1對(duì)灰蓋擬鬼傘、擬鬼傘、晶粒小鬼傘、小脆柄菇的基因組數(shù)據(jù)CC3、Copmar1、Copmic2和ASM412641v1進(jìn)行tblastn比對(duì)，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，灰蓋擬鬼傘有2個(gè)Gel蛋白，擬鬼傘有4個(gè)Gel蛋白，晶粒小鬼傘和小脆柄菇各僅含有1個(gè)Gel蛋白。

由表1可知，各鬼傘Gel蛋白均含有信號(hào)肽，除晶粒小鬼傘和小脆柄菇的信號(hào)肽為N端前24個(gè)氨基酸，其他均為前20個(gè)氨基酸，結(jié)合WoLF PSORT 亞細(xì)胞定位分析，Gel蛋白均分泌到胞外。其氨基酸組成數(shù)量在520～550個(gè)之間，分子量為55 ku左右，等電點(diǎn)呈酸性，在4～5之間，除擬鬼傘的Gel（TFK21136.1和TFK21135.1）為不穩(wěn)定蛋白，其他均為穩(wěn)定蛋白，灰蓋擬鬼傘Gel（XP_001831707.1）的脂肪族指數(shù)最低，為69.89，而晶粒小鬼傘Gel（TEB39055.1）的脂肪族指數(shù)最高，為87.09。除晶粒小鬼傘Gel為疏水蛋白外，其他均為親水性蛋白。此4種鬼傘Gel蛋白的優(yōu)勢(shì)氨基酸均為絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly）。

2.2 Gel蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋以及GPI修飾位點(diǎn)預(yù)測

4種鬼傘的Gels蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，其次是延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角。α-螺旋比例在30%～36%之間，灰蓋擬鬼傘Gel蛋白 XP_001831707.1 的最高，為35.28%，擬鬼傘中TFK30742.1的比例最低，為3096%;延伸鏈的占比在13%～17%之間，擬鬼傘中TFK30742.1的比例最高，為1655%，而TFK21138.1的最低，為1369%;β-轉(zhuǎn)角占比最低，約為5%左右;無規(guī)則卷曲占比最高，在44%～50%之間。除擬鬼傘中TFK21138.1和小脆柄菇RXW23863.1在C端具有跨膜區(qū)域，其他Gel蛋白均不含跨膜結(jié)構(gòu)。所有Gel蛋白均含有GPI修飾，主要修飾位點(diǎn)發(fā)生在C段區(qū)域的絲氨酸殘基上（表2）。

2.3 Gel蛋白的基序分析、多序列比對(duì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

4種鬼傘的Gel蛋白序列中均含有3個(gè)基序（圖1）。4種鬼傘Gel蛋白具有較高的同源性，同源性矩陣分析結(jié)果表明其同源性均在50%以上（表3）。晶粒小鬼傘和小脆柄菇的Gel蛋白同源性最高，將近80%;其次是灰蓋擬鬼傘的2個(gè)Gel蛋白，其同源性為76.2%;晶粒小鬼傘的Gel與擬鬼傘的Gel（TFK21136.1）同源性最低，但也達(dá)到了51.6%。通過Gel蛋白的多序列比對(duì)（圖2）可以看出，4種鬼傘的Gel蛋白中含有177個(gè)保守氨基酸，其中包含甘氨酸（G）和亮氨酸（L）各17個(gè)，15個(gè)酪氨酸（Y），14個(gè)絲氨酸（S），半胱氨酸（C）和脯氨酸（P）各13個(gè)，以及11個(gè)天冬酰胺（N）等。4種鬼傘的Gel 序列中均包含糖基水解酶超家族 （Glyco_hydrosuper family）和8個(gè)半胱酸-盒子（Cys-box/X8）保守域， 在C端的絲氨酸或者甘氨酸或者天冬酰胺上發(fā)生GPI修飾。使用釀酒酵母β-1，3-葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶GAS2的晶體結(jié)構(gòu)（261.1.A）作為模板，采用Swiss-model對(duì)4種鬼傘Gel蛋白進(jìn)行在線同源建模預(yù)測分析，結(jié)果表明預(yù)測結(jié)構(gòu)與模板序列相似度均在35%左右，覆蓋度約為80%，各鬼傘Gel蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似（圖3）。

2.4 Gel蛋白的進(jìn)化分析

結(jié)合研究較多的子囊菌中的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的β-1，3-葡聚糖糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白以及擔(dān)子菌中的玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）和雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、平菇（Pleurotus ostreatus）、灰樹花（Grifola frondosa）以及靈芝（Ganoderma boninense）的Gel同源蛋白使用MEGA 7[25]進(jìn)行演化分析，采用鄰接（neighbor-joining）法推導(dǎo)其演化歷史[26]，得到分支長度和為8.760 563 63的最優(yōu)樹（圖4）。Bootstrap 測試設(shè)置1 000次重復(fù)，進(jìn)化距離采用基于JTT矩陣的方法[27]計(jì)算，以每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸取代數(shù)為單位。分析包括24個(gè)氨基酸序列。所有包含間隙和缺失數(shù)據(jù)的位置被消除。最終數(shù)據(jù)集中共有347個(gè)位置?？梢钥闯觯?種鬼傘的Gel蛋白基本按照種屬分類關(guān)系進(jìn)行聚類，擬鬼傘屬聚類為一組，小鬼傘屬和小脆柄菇屬聚為一組。根據(jù)序列C端是否有半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域，GH72家族可分為2個(gè)亞類：GH72+（含CBM43或者X8）和GH72-（沒有CBM43或者X8）[28]。所有擔(dān)子菌的Gel蛋白序列中均含有X8結(jié)構(gòu)域，因此屬于GH72+。

3 討論

眾所周知，GH72家族葡聚糖轉(zhuǎn)移酶是GPI錨定修飾的細(xì)胞壁蛋白。該類蛋白在子囊菌中有較多研究，在釀酒酵母中含有5個(gè)GAS基因，白色念珠菌中含有5個(gè)PHR基因，粟酒裂殖酵母含有4個(gè)GAS基因，煙曲霉中含有7個(gè)GEL基因，稻瘟病菌中含有5個(gè)GEL基因，粗糙脈孢菌中含有5個(gè)GEL基因[29]。在本研究中除擬鬼傘外，大部分擔(dān)子菌中僅有1～2個(gè)該類基因，明顯少于子囊菌。因此，擔(dān)子菌葡聚糖轉(zhuǎn)移酶基因的生理功能可能不完全等同于子囊菌。GH72酶可分為2類[30]，GH72+酶包含葡聚糖轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和1個(gè)來自轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的羧基末端第2個(gè)碳水化合物結(jié)合X8或CBM43結(jié)構(gòu)域。GH72-酶缺乏X8/CB43碳水化合物結(jié)合域。4種鬼傘的Gel蛋白均屬于GH72+，且均含有信號(hào)肽序列，因此，鬼傘的Gel可能在細(xì)胞周質(zhì)空間中對(duì)新添加的細(xì)胞壁組分β-1，3-葡聚糖進(jìn)行修飾。Hurtado-Guerrero等首次解析了GH72+與昆布五糖和昆布七糖水解產(chǎn)物有關(guān)的ScGas2轉(zhuǎn)糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)表明存在1個(gè)（β/α）8的催化核心，緊緊地和C端CBM43葡聚糖綁定結(jié)構(gòu)域相互作用，活性位點(diǎn)位于不常見的半胱氨酸富集的溝槽，有2個(gè)谷氨酸作為催化殘基。定點(diǎn)突變數(shù)據(jù)結(jié)合ScGas2-o寡糖復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，表明在受體位點(diǎn)產(chǎn)生綁定在調(diào)節(jié)水解和轉(zhuǎn)糖苷之間的平衡至關(guān)重要[31]。該酶作用的位點(diǎn)包含2個(gè)催化殘基（Glu176和Glu275），和3個(gè)酪氨酸殘基（Tyr107、Tyr244、Tyr307），這些位點(diǎn)在GH72家族中均是保守的。去除GPI修飾位點(diǎn)該酶的轉(zhuǎn)糖基活性不受影響，但去除X8結(jié)構(gòu)域后其不再具有轉(zhuǎn)糖基活性[30]。本研究基于已測序并有注釋信息的4種鬼傘的Gel蛋白序列，通過對(duì)鬼傘Gel蛋白的生物信息學(xué)分析，為擔(dān)子菌中Gel基因的生理功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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