潘麗梅　付金娥　萬凌云　宋利沙　韋樹根

摘要：分析國內(nèi)外近10年來頑拗性種子研究的最新概況，并對(duì)其保存技術(shù)及脫水、低溫敏感性的生理生化機(jī)制和分子機(jī)制等方面進(jìn)行綜述。種子保存方面，主要是集中在低溫保存與超低溫保存技術(shù)及其保存過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的研究，保存成功案例較少;脫水及低溫敏感性方面，生理生化的研究主要集中在可溶性糖、可溶性蛋白及酶等變化的研究，不同的植物在其脫水或低溫過程中有各自的變化特點(diǎn)。頑拗性種子脫水與低溫致死是一個(gè)復(fù)雜的生理生化及內(nèi)部基因變化過程，其機(jī)制尚未完全清楚，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析，可為頑拗性種子的保存與繁育提供理論基礎(chǔ)，也將為頑拗性種子的脫水修復(fù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：頑拗性種子;保存;脫水敏感性;低溫敏感性;分子機(jī)制

中圖分類號(hào)：S184 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）04-0001-07

作者簡介：潘麗梅（1982—），女，廣西藤縣人，博士，高級(jí)工程師，主要從事藥用植物栽培與遺傳育種研究。E-mail：plimei2006@163.com。

通信作者：韋樹根，博士，研究員，主要從事藥用植物栽培與遺傳育種研究。E-mail：weishugen2@163.com。

全球452個(gè)科的39.2萬種維管束植物中有428個(gè)科的95%種是種子植物，種子植物是地球上最成功的現(xiàn)存陸地植物[1]，而種子保存是種子植物長期保存以及后續(xù)利用的最理想方式[2]。根據(jù)種子收獲后的生理狀況，可將種子劃分為正常性種子（orthodox）、中間性種子（intermediate）和頑拗性種子（recalcitrant）三大類型[3-4]。正常性種子在成熟過程中經(jīng)歷成熟脫水，能長期保存在低溫條件下，且大部分可實(shí)現(xiàn)超低溫保存;中間性種子則處于兩者之間，可以干燥到一定程度，但干燥并不能延長種子壽命，對(duì)低溫也存在一定程度的敏感性，難以在低溫條件下長期保存;頑拗性種子則不耐脫水和低溫，種子脫落后仍保持高含水量，因此仍代謝活躍，且在零度以下易遭受冰晶損傷，常溫下一般僅能存放數(shù)天而已[5]。通常處于熱帶、亞熱帶地區(qū)的一些木本植物，隨著環(huán)境進(jìn)化產(chǎn)生頑拗性種子，少數(shù)溫帶植物也有頑拗性種子。頑拗性種子自發(fā)現(xiàn)以來一直是種子研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，國內(nèi)外專家和學(xué)者做了大量的研究，而植物頑拗性種子在綜述方面的報(bào)道甚少。因此，本文對(duì)頑拗性種子的保存、脫水及低溫敏感性等方面進(jìn)行綜述。

1 保存技術(shù)研究

1.1 頑拗性種子的保存

正常性種子可以在干燥狀態(tài)下存放較長時(shí)間，因此可以在低含水量和零度以下的低溫成功保存;且正常性種子具有多種保護(hù)過程和機(jī)制以及脫水耐性，其中重要的是代謝關(guān)閉和細(xì)胞內(nèi)去分化。相反，頑拗性種子不耐脫水且對(duì)低溫敏感，常規(guī)的種子庫無法實(shí)現(xiàn)長期保存。主要原因是頑拗性種子在保存期間不經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)的去分化，且能繼續(xù)維持代謝活性并進(jìn)行新陳代謝活動(dòng)。諸多學(xué)者認(rèn)為超低溫保存仍是長期保存頑拗性種子的唯一可行方法，但該方法并不容易實(shí)現(xiàn)，仍面臨許多挑戰(zhàn)，比如存在需要部分脫水以防止冰晶損傷、低溫保存后如何恢復(fù)生長等問題[6-7]。目前的報(bào)道中，低溫保存獲得成功的也只能以胚或胚芽進(jìn)行保存，但重新發(fā)芽的成功率不高[8];在高度頑拗性的長葉金柑（Fortunellapolyandra）種子組織中，經(jīng)冷凍和液氮保存后，其胚軸成活率就較低[9-10]。部分研究也認(rèn)為超低溫保存是頑拗性種子的理想方式，但由于種子的頑拗性特質(zhì)，這也成了植物種質(zhì)資源超低溫保存領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。要真正實(shí)現(xiàn)頑拗性種子的超低溫保存還需要開拓更多的研究[11]。而要實(shí)現(xiàn)低溫保存則要使材料盡快處于玻璃化狀態(tài)[12]，如山鳳果（Garciniahombroniana）、山竹（Garciniamangostana）等利用玻璃化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了莖尖的超低溫保存[13-14]?？梢?，要實(shí)現(xiàn)頑拗性種子的長期保存，材料處理至關(guān)重要。

超低溫保存前需要進(jìn)行部分脫水，但種子含水量又不能過低，Lan等研究了見血封喉樹種子的貯藏情況，表明種子的含水量越低，種子存活所需的貯藏溫度越高，越不利于超低溫保存[15]。種子對(duì)脫水的反應(yīng)取決于脫水速率，在高含水量下緩慢脫水會(huì)導(dǎo)致種子生活力喪失，如果冷卻速度足夠快，快速脫水的材料在短期內(nèi)可以存活到足夠低的水分含量以允許剩余細(xì)胞內(nèi)水的玻璃化，而不是冰晶的形成。但頑拗性種子大部分個(gè)頭較大，不利于玻璃化所需的脫水和冷卻速率，因此最佳的保存部位是莖尖或者胚尖[12]。蒲葵（Livistonachinensis）種子的種胚經(jīng)超低溫保存2年后仍有活力[16-17]，布迪椰子（Butiacapitata）種子的種胚也能在液氮等超低溫條件下保存一段時(shí)間[18]。AlZoubi等利用差示掃描量熱法（DSC）測定了長葉金柑（Fortunellapolyandra）胚軸成功冷凍保存的臨界含水量，并確定了其最佳含水量，經(jīng)超低溫保存后存活率為50%[19]。曾琳等分別對(duì)頑拗性益智種子、羯布羅香種子、降香種子進(jìn)行超低溫保存試驗(yàn)，表明這3種頑拗性種子超低溫保存可行且安全可靠[20-22]。不過，Wesley-Smith等的研究表明胞內(nèi)結(jié)冰并不是致命的，如果晶體較小且位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞則可以在細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰狀態(tài)下存活，因此需要進(jìn)一步了解含水量、冷卻速率、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和冰結(jié)構(gòu)之間的相互作用，以優(yōu)化冷凍保存處理[23]。超低溫保存時(shí)，保存的過程以及保存后取出都極易傷害植物材料，因此對(duì)材料的選擇和處理也有較高的要求。對(duì)于每種頑拗性種子，都需要去探索最佳的保存部位和保存方式，才能實(shí)現(xiàn)種子的超低溫保存。

此外，頑拗性種子除了超低溫保存外，其他保存方式也有報(bào)道。比如氣調(diào)法、隔水浸泡法、充氣吸漲法等適于短（中）期保存的方法，基本不損傷種子活力，并能盡量減少脫水以及蟲害、微生物等的干擾，可實(shí)現(xiàn)頑拗性種子的暫時(shí)保存，特別是一些不適合超低溫保存的頑拗性種子。筆者所在課題組的研究表明，桑寄生種子在2mg/L的脫落酸（ABA）溶液中浸種30min，在4℃條件下可有效延緩種子生活力的喪失從而實(shí)現(xiàn)短期保存[24-25]。竹柏種子、非洲馬鈴果種子、茶樹種子、黃連種子、北細(xì)辛種子、金絲李種子等也均可在4℃條件下保存一段時(shí)間[26-31]。Hathuru-Singha等[32]對(duì)紅厚殼種子的保存進(jìn)行研究認(rèn)為，其不適合低溫保存，但如果種子儲(chǔ)存在溫暖適宜和略微潮濕的環(huán)境中，而且不去除內(nèi)果皮，則可以在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)（>8個(gè)月）保持生活力。坡壘（Hopeahainanensis）頑拗性種子在15℃或20℃下貯藏14個(gè)月，發(fā)芽率為87%～91%[33]。藤黃屬的熱帶植物藤黃果（Garciniagummi-gutta）種子在密閉的容器中于15℃下保存1年半以上仍能保持較高萌發(fā)率[34]。無憂樹（Saracaasoca）種子在15℃條件下貯藏，種子的壽命可延長4年[35]。以上研究表明，對(duì)于頑拗性種子的初期保存來說，可以考慮在4℃條件下保存過渡，但若需要更長時(shí)期的保存，則要根據(jù)各種子特性進(jìn)行更深入的研究。

雖然頑拗性種子的短期保存策略有所成功，但仍然遭遇發(fā)芽率過低甚至無法發(fā)芽的問題，最重要的還是要通過了解種子特性來提升種子的耐脫水性。如頑拗性印加甜豆種子在-2.0MPa的聚乙二醇（PEG）溶液中進(jìn)行培養(yǎng)可增加其對(duì)脫水的耐受性，從而有利于保存[36]。而利用殺菌劑對(duì)印加甜豆種子進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)殺菌劑處理降低了最常見真菌病害的發(fā)生率，可將未干燥胚胎的壽命從90d延長到120d[37]。Woodenberg等通過觀察蘇鐵種子胚和胚乳的組織結(jié)構(gòu)來研究種子保存策略，認(rèn)為其種胚可用于低溫保存[38]。Oliet等通過研究頑拗性種子生長過程中的光溫條件等，來探索其保存依據(jù)[39]。Wesley-Smith等觀察頑拗性種子低溫處理后其胚胎軸的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)低溫所產(chǎn)生的凍結(jié)應(yīng)力可使細(xì)胞自噬降解，最終可能引起細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡（programmedcelldeath，PCD）信號(hào)從而影響保存[40]。Walters的研究表明，頑拗性種子在脫水情況下容易引起細(xì)胞液胞漿凝固，導(dǎo)致種子無法長期保存[41]。而Moothoo-Padayachie等對(duì)比Trichiliadregeana、海欖雌（Avicenniamarina）2種頑拗性種子的脫水和貯藏特性，表明其貯藏壽命主要受氧化還原代謝調(diào)節(jié)影響，但也有可能因物種而異[42]。以上所有研究均表明，脫水和低溫都會(huì)同時(shí)影響頑拗性種子的保存。實(shí)際上雖然同屬頑拗性種子，但很多因物種而異，只能通過試驗(yàn)摸索才有可能總結(jié)出最適合某物種的超低溫保存方法。因此需要更多更深入的研究去闡明頑拗性種子不耐脫水、低溫敏感的機(jī)制以及種子的抗旱和抗凍機(jī)制，才能為頑拗性種子的最佳保存方式提供基礎(chǔ)。不管如何，頑拗性種子保存的總體方向都是在追求更好的超低溫保存效果的同時(shí)，也能使材料得以恢復(fù)生長。

2 脫水及低溫敏感性研究

2.1 脫水敏感性研究

2.1.1 頑拗性種子脫水過程中生理生化變化

種子頑拗性是在脫離母體后在種子發(fā)育過程中形成的，但直到發(fā)芽才表現(xiàn)出來，頑拗性種子最重要的功能特征就是不耐脫水且對(duì)低溫敏感[43]。前人研究已證實(shí)頑拗性種子的種子結(jié)構(gòu)、糖含量、蛋白質(zhì)含量、脫落酸含量、各種酶活性以及基因等與脫水敏感性密切相關(guān)。種子是否能有效保存是由種子成熟過程中脫水耐性的獲得（即內(nèi)因）和此過程中容易引起種子老化、劣變的外部因素（即外因）綜合影響的結(jié)果。種子種胚在快速脫水時(shí)對(duì)呼吸能力、抗氧化活性、脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)合成率和胞內(nèi)物質(zhì)變化等生理生化都有影響，且呈正相關(guān)關(guān)系[44]，同時(shí)這些生理生化因子之間也會(huì)相互影響共同起到保護(hù)作用，但最終協(xié)同保護(hù)作用仍敵不過脫水所帶來的傷害，這是種子最終失活的主要原因[45]，頑拗性種子脫水過程中一系列的生理生化活動(dòng)與脫水耐性息息相關(guān)[46]。

2.1.2 脫水敏感過程對(duì)可溶性糖、可溶性蛋白等的影響

越來越多的研究表明，頑拗性種子對(duì)脫水的敏感性與種子體內(nèi)結(jié)構(gòu)、糖含量、蛋白質(zhì)含量等密切相關(guān)，大多數(shù)頑拗性種子對(duì)脫水敏感的原因是其種子組織中缺少棉籽糖、蔗糖及水蘇糖等。頑拗性黃皮種子經(jīng)歷脫水后其可溶性蛋白含量明顯增加，有可能是脫水導(dǎo)致內(nèi)部原有的貯存蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白[47]。有研究認(rèn)為海欖雌種子缺乏足夠的蔗糖來阻擋脫水傷害從而使種子在萌發(fā)過程中對(duì)脫水高度敏感，雖然海欖雌種子中也含有較高的水蘇糖[48]，可見糖類對(duì)頑拗性種子脫水耐性的獲得至關(guān)重要。但也有不一樣的報(bào)道，在枳種子脫水過程中糖類等內(nèi)含物的積累是失水細(xì)胞降低水勢、增強(qiáng)持水力的抗逆生理表現(xiàn)[49]。另有研究報(bào)道，脫水過程中寡糖的增加可引起胞內(nèi)玻璃化從而保護(hù)種子免受脫水傷害[50]。因此，關(guān)于種子內(nèi)含糖類對(duì)種子耐脫水性影響的作用還需要進(jìn)一步研究，才能明確其相關(guān)功能。

2.1.3 脫水過程對(duì)膜脂過氧化的影響

頑拗性種子遭受脫水傷害所引起的活力下降，與膜脂過氧化破壞膜結(jié)構(gòu)和功能及因抗氧化保護(hù)系統(tǒng)活性降低、自由基積累而導(dǎo)致的細(xì)胞代謝紊亂密切相關(guān)[44]。脂質(zhì)過氧化一直被認(rèn)為是加速種子衰老、劣變的主要原因之一，容易引起種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而導(dǎo)致種子電解質(zhì)大量外滲和膜脂過氧化產(chǎn)物的過度積累。蒲葵種子經(jīng)歷脫水傷害后，其抗氧化酶活性明顯降低，同時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，嚴(yán)重影響種子活力甚至導(dǎo)致種子活力喪失[51]。遭遇脫水的情況下，Madhucalatifolia頑拗性種子脫水誘導(dǎo)的活力降低與活性氧（ROS，reactiveoxygenspecies）的積累有關(guān)，ROS的積累促進(jìn)了膜脂過氧化相關(guān)膜的完整性喪失[52]。頑拗性三七種子的脫水試驗(yàn)表明，脫水過程中抗氧化活性降低及膜脂過氧化作用是導(dǎo)致三七種子脫水敏感的主要原因[53]。但也有相反的報(bào)道，宗梅等通過對(duì)不同發(fā)育階段的板栗種子進(jìn)行自然脫水，研究其脫水過程的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)脫水敏感性與膜完整性并不完全相關(guān)[54]。

針對(duì)膜脂過氧化帶來的不利影響，部分種子也利用一些措施以緩解不利影響。Pukacka等報(bào)道，在頑拗性種子萌發(fā)過程中，硒對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞活力和抗氧化保護(hù)細(xì)胞免受活性氧毒害方面有積極作用[55]。Sershen等利用聚乙烯袋密封儲(chǔ)存冬青櫟種子，通過限制袋子內(nèi)的氣體交換來維持H2O2水平，更有利于種子儲(chǔ)存[43]。茶樹頑拗性種子脫水過程中的氧化還原反應(yīng)表明，降低活性氧有利于減緩脫水傷害，從而提高種子萌發(fā)率[56]。木乃果種子隨著脫水程度的加劇，其相對(duì)電解質(zhì)滲透速率和膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物（TBARs）都呈升高趨勢，但慢速脫水和快速脫水的升高幅度差異明顯，前者更慢，更有利于種子萌發(fā)[57]。勐海大葉茶種子也通過慢速脫水在一定程度上減少了種子的脫水傷害[58]。因此，通過調(diào)節(jié)頑拗性種子的脫水速率來減緩膜脂過氧化程度是可行的。

2.1.4 脫水敏感過程對(duì)酶的影響

正常性種子通常通過完整的抗氧化系統(tǒng)來阻止因脫水而帶來的傷害，而頑拗性種子同樣具有完整的抗氧化系統(tǒng)。但由于頑拗性種子脫落后的高含水量及持續(xù)的代謝活動(dòng)導(dǎo)致過氧化作用的加強(qiáng)及系統(tǒng)活性的下降，從而引起種子喪失活力。頑拗性三七種子脫水敏感的重要原因之一，就是抗氧化系統(tǒng)酶活性降低從而無法消除氧化傷害甚至加劇了氧化傷害[53，59]。同樣的結(jié)論在板栗種子[60]、枳種子[49]、勐海大葉茶種子[58]、黃皮種子[47，61]、三七種子[62]等種子上也得到了證實(shí)。自然脫水過程中，種子細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷，而在異常的代謝活動(dòng)中，ROS特別是H2O2的積累導(dǎo)致頑拗性種子的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)有損傷，是頑拗性種子對(duì)脫水敏感的主要原因之一，但可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，將ROS降低到適當(dāng)濃度來增強(qiáng)頑拗性種子的脫水耐受性[56，63]。影響頑拗性種子脫水敏感性的因素很多，包括種子本身的物質(zhì)基礎(chǔ)，還有種子在生長過程中所經(jīng)歷的外部環(huán)境變化等[64]。此外，種子水分分布模式、細(xì)胞壁的厚度及硬度與脫水敏感性也密切相關(guān)[1]。如Podocarpushenkelii、鐮葉羅漢松（Podocarpusfalcatus）等種子的脫水敏感性可能是由于脫水后期胚漿膜不能在復(fù)水后恢復(fù)其原始構(gòu)象而造成的[65]。因此，研究頑拗性種子可以參考正常性種子脫水和萌發(fā)過程中的脫水、修復(fù)及自我保護(hù)機(jī)制，來研究種子頑拗性的機(jī)制。

2.2 低溫敏感性研究

對(duì)于頑拗性種子來說，種子脫水及低溫敏感性都是其重要的功能特征。脫水敏感的種子同時(shí)往往對(duì)低溫也敏感，與脫水敏感相比，低溫敏感主要發(fā)生在保存過程中，因此往往是伴隨超低溫保存而進(jìn)行的相關(guān)研究。顛茄頑拗性種子合子胚經(jīng)低溫保存后其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)畸形，種子活力也明顯衰退[43]。Wesley-Smith等觀察了頑拗性銀白槭（Acersaccharinum）種子低溫保存后胚和胚乳的組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰嚴(yán)重影響了種子的活力[23]。能實(shí)現(xiàn)超低溫保存的羯布羅香種子在超低溫冷凍后其過氧化物酶、過氧化氫酶活性都明顯降低，但α-淀粉酶活性提高，丙二醛含量則無顯著變化[21]。低溫往往容易使頑拗性種子活力喪失，因此如何提高頑拗性種子的低溫耐受性成了新的研究重點(diǎn)。Bai等對(duì)木乃果（Baccaurearamiflora）進(jìn)行一氧化碳（carbonmonoxide，CO）處理，認(rèn)為CO可作為外源調(diào)節(jié)因子，通過其介導(dǎo)的谷胱甘肽體內(nèi)穩(wěn)態(tài)來提高種子對(duì)低溫的耐受性[66]。溫度和水分是種子保存過程中最關(guān)鍵的因子，在不影響種子活力的前提下盡量降低種子的貯藏溫度及含水量，從而降低保存過程中的各項(xiàng)代謝活動(dòng)，同時(shí)考慮通過外源因子處理進(jìn)一步提高種子的脫水及低溫耐受性，才能實(shí)現(xiàn)種子長期保存的目的。

2.3 分子機(jī)制研究

頑拗性種子對(duì)脫水及低溫敏感，生理生化研究涉及較多，但在分子機(jī)制方面，過去研究少有提及。隨著近些年生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的生物技術(shù)手段被用于頑拗性種子的脫水及低溫敏感性研究，但更多開展于脫水敏感性研究。Julien等對(duì)比了正常的蒺藜苜蓿、栗豆樹頑拗性種子在脫水過程中LEA多肽的測定情況，正常性種子檢測到了17種LEA基因中的16種，而頑拗性種子中至少有12種是缺少或者急劇減少的，但其非種子特異性脫水蛋白卻積累到較高水平[67]。Wei等通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了桑寄生頑拗性種子脫水敏感過程中的基因表達(dá)變化，挖掘到了轉(zhuǎn)錄因子等一系列影響桑寄生頑拗性種子脫水敏感的重要基因[68]。Jin等使用RNA-Seq和數(shù)字基因表達(dá)（DGE）技術(shù)分析了茶樹頑拗性種子3個(gè)脫水階段的全基因組表達(dá)譜，最終確定了與茶葉種子脫水處理相關(guān)的12個(gè)基因的表達(dá)譜[69]。這些研究手段都為頑拗性種子的脫水及低溫敏感性機(jī)制的挖掘及頑拗性遺傳資源的保存提供了基礎(chǔ)。

除了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究外，蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)手段也被用于其中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究脫水敏感機(jī)制的有Trichiliadregeana種子[42]、南洋杉沙棗種子[70]、梧桐種子[71]等，這些研究都挖掘到了與脫水敏感密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和關(guān)鍵代謝通路，如熱休克蛋白等。Radwan等同時(shí)研究了頑拗性種子、正常性種子及中間性種子脫水過程中脫水蛋白（Dehydrins）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該蛋白在3類種子脫水過程中均有表達(dá)，但表達(dá)量有明顯差異，與種子的成熟度以及脫水情況密切相關(guān)[72]。此外，Plitta-Michalak等通過比較正常性種子和頑拗性種子在脫水過程中的甲基化水平變化，表明2種種子的胚軸、子葉在DNA甲基化水平下對(duì)脫水的反應(yīng)存在明顯差異[73]。Calvi等研究了大果番櫻桃（Eugeniastipitata）頑拗性種子脫水過程中的活力變化情況，發(fā)現(xiàn)脫水過程會(huì)導(dǎo)致谷胱甘肽（EGSSG/2）降低，從而影響種子的死亡[74]。Azarkovich等對(duì)七葉樹頑拗性種子脫水過程的水溶性蛋白及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，和正常性種子相比，干燥過程中頑拗性種子可能缺失由基因決定的典型的存儲(chǔ)蛋白[75]。而對(duì)于如何從分子角度降低脫水傷害也有部分研究。Mazlan等用代謝組學(xué)手段分析了山竹子（Garciniamangostana）頑拗性種子的發(fā)育過程，表明甘草酸A1、蕓香苷、綠原酸等水平的升高可能會(huì)增強(qiáng)種子的自我保護(hù)和防御[76]。而通過對(duì)比正常性種子和頑拗性種子的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)種子后期通過合成LEA蛋白、熱休克蛋白和糖類等物質(zhì)可獲得耐脫水能力[77-78]?？偟膩碚f，對(duì)于脫水敏感性的研究明顯多于對(duì)低溫敏感機(jī)制的研究，可能是低溫下種子更容易喪失活力從而影響了更多的后續(xù)研究。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子水平探討頑拗性種子的脫水及低溫敏感機(jī)制、原因及其脫水修復(fù)機(jī)制將成為可能。

3 展望

種子保存是最直接、最高效且經(jīng)濟(jì)的種質(zhì)資源保護(hù)方式。在自然界中，大部分植物的種子屬于正常性種子，都能實(shí)現(xiàn)有效的長期保存。而頑拗性種子對(duì)脫水和低溫都非常敏感，常規(guī)的低溫種子庫不僅不能有效保存頑拗性種子，相反還會(huì)導(dǎo)致種子活力喪失從而加速死亡。頑拗性種子和正常性種子以及中間性種子都是在長期的自然環(huán)境中進(jìn)化形成的種子特性。頑拗性種子植物多產(chǎn)于熱帶、亞熱帶中高溫而又濕潤的地區(qū)，且多為大型種子或大粒種子，已逐漸進(jìn)化出一套與其棲息地相適應(yīng)的生存機(jī)制，同時(shí)也是一種進(jìn)化選擇優(yōu)勢。而如何保存這些生產(chǎn)頑拗性種子的植物一直是植物種質(zhì)資源保護(hù)工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)，本文認(rèn)為可從以下3個(gè)方面考慮：

（1）開展頑拗性種子生態(tài)適應(yīng)機(jī)制研究。頑拗性種子的生態(tài)適應(yīng)性一直是種子科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。這些“特殊”的種群往往是整個(gè)植物生態(tài)系統(tǒng)里的重要組成部分，因此這些種群的延續(xù)和發(fā)展在一定程度上往往可以影響整個(gè)植物的生態(tài)環(huán)境。然而相關(guān)的研究多數(shù)僅涉及種子本身的發(fā)育及頑拗性的初步認(rèn)識(shí)，缺少對(duì)其生態(tài)適應(yīng)機(jī)制的探討。因此了解頑拗性種子的生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，特別是對(duì)干旱和低溫環(huán)境的生理生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，將為種子保存和利用提供新的視角。

（2）繼續(xù)深入開展超低溫保存研究。現(xiàn)階段來說，超低溫保存仍被認(rèn)為是長期保存頑拗性種子的最佳方式。然而，在過去的研究中，不少頑拗性種子的超低溫保存試驗(yàn)都未獲得成功，迄今為止僅有少數(shù)頑拗性種子能通過超低溫技術(shù)實(shí)現(xiàn)長期保存。其主要原因是，從超低溫環(huán)境中取出種子后會(huì)造成頑拗性種子活力喪失，造成超低溫傷害。盡管在超低溫保存過程中超低溫傷害是普遍現(xiàn)象，但頑拗性種子超低溫儲(chǔ)存及其低溫生理機(jī)制尚待探究，其背后的相關(guān)機(jī)制亟須更深入的研究。

（3）深入挖掘控制頑拗性種子具頑拗性的重要功能基因，利用分子手段揭示種子頑拗性形成的真正內(nèi)在原因。因此，應(yīng)進(jìn)一步系統(tǒng)性地研究頑拗性種子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、生理生化特質(zhì)、進(jìn)化機(jī)制等，并通過最新的組學(xué)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等）整合手段，同時(shí)加強(qiáng)施加外源影響因子的研究，這些對(duì)頑拗性種子的本質(zhì)認(rèn)識(shí)以及更好地解決頑拗性種子的貯藏具有重要意義。

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