馬季，李寶山, 王成強(qiáng)，王曉艷，喬洪金，王際英*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006； 3.魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

魚(yú)粉魚(yú)油適口性好、易消化吸收、必需營(yíng)養(yǎng)素全面，是水產(chǎn)飼料的優(yōu)質(zhì)蛋白源和脂肪源。近年來(lái)，由于全球氣候變化、環(huán)境污染及過(guò)度捕撈，魚(yú)粉、魚(yú)油產(chǎn)量已難以滿(mǎn)足行業(yè)發(fā)展的需求。減少飼料中魚(yú)粉及魚(yú)油的使用比例，對(duì)行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。而植物原料來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，是替代魚(yú)粉、魚(yú)油的理想原料。

研究表明，發(fā)酵菜粕替代飼料中75%的魚(yú)粉會(huì)降低真鯛Pagrusmajor的生長(zhǎng)性能及抗氧化能力[1]；大豆蛋白替代金鯛Sparusaurata飼料中40%魚(yú)粉，會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)及免疫能力產(chǎn)生負(fù)面影響，替代達(dá)到60%時(shí)會(huì)引起炎癥反應(yīng)[2]；亞麻籽油完全替代大菱鲆ScophthalmusmaximusL.飼料中的魚(yú)油會(huì)降低血清溶菌酶活性及總抗氧化能力[3]。全部替代魚(yú)粉魚(yú)油會(huì)降低歐洲狼鱸Dicentrarchuslabrax生長(zhǎng)性能[4]，而完全替代軍曹魚(yú)Rachycentroncanadum飼料中的魚(yú)粉魚(yú)油，則不會(huì)影響其生長(zhǎng)性能[5]?？梢?jiàn)，植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)的影響因魚(yú)而異，表明不同魚(yú)種對(duì)植物原料的適應(yīng)能力有所不同，因此，有必要對(duì)此進(jìn)行深入研究。

大菱鲆以其良好的肉質(zhì)及較快的生長(zhǎng)速度，在中國(guó)及歐洲被廣泛養(yǎng)殖。本試驗(yàn)中，探究了混合植物蛋白及芥花油、大豆油替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆幼魚(yú)生長(zhǎng)、體成分、生化、抗氧化及免疫指標(biāo)的影響，以期為替代大菱鲆日糧中魚(yú)粉及魚(yú)油提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大菱鲆幼魚(yú)購(gòu)自蓬萊宗哲養(yǎng)殖有限公司，養(yǎng)殖試驗(yàn)在山東省海洋資源與環(huán)境研究院循環(huán)水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)飼料的配制 試驗(yàn)飼料設(shè)置4個(gè)組，魚(yú)粉魚(yú)油組(對(duì)照)以魚(yú)粉為蛋白源，魚(yú)油為脂肪源；魚(yú)油組以混合植物蛋白(大豆分離蛋白、玉米蛋白粉、發(fā)酵豆粕、花生粕、谷朊粉)為蛋白源，魚(yú)油為脂肪源；芥花油組以混合植物蛋白為蛋白源，芥花油并補(bǔ)充必需脂肪酸純化油為脂肪源；大豆油組以混合植物蛋白為蛋白源，大豆油并添加混合藻粉(裂壺藻Schizochytriumsp.與擬微綠球藻Nannochloropsissp.的比例為1.2∶1)為主要脂肪源。各組必需脂肪酸含量均滿(mǎn)足大菱鲆幼魚(yú)生長(zhǎng)的需求量[6]。按照試驗(yàn)飼料配方，所有干物料經(jīng)粉碎過(guò)0.198 mm篩后充分混勻，然后依次加入油和蒸餾水混勻后，經(jīng)螺旋擠壓機(jī)加工成粒徑為3 mm的顆粒，60 ℃下烘干，于-20 ℃下保存待用。試驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1～表5，其中，魚(yú)粉含粗蛋白質(zhì)69%、粗脂肪6.5%；大豆分離蛋白含粗蛋白質(zhì)90%；玉米蛋白粉含粗蛋白質(zhì)66%；發(fā)酵豆粕含粗蛋白質(zhì)52%；花生粕含粗蛋白質(zhì)53%；谷朊粉含粗蛋白質(zhì)80%；DHA純化油含DHA 55%；ARA純化油含ARA 55%；裂壺藻(干物質(zhì))中含粗蛋白質(zhì)9.7%、粗脂肪25.35%；擬微綠球藻(干物質(zhì))中含粗蛋白質(zhì)45%、粗脂肪18.05%；誘食劑中含5’肌苷酸二鈉、谷氨酸鈉，二者的比例為1∶7。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及養(yǎng)殖管理 正式試驗(yàn)開(kāi)始前，將試驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)于養(yǎng)殖系統(tǒng)中以適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，期間投喂對(duì)照組與試驗(yàn)組混合的飼料。兩周后逐漸減少投喂飼料中對(duì)照組飼料的比例，直至為零。10 d后，挑選健康且規(guī)格統(tǒng)一的大菱鲆幼魚(yú)放入12個(gè)養(yǎng)殖桶(高80 cm，直徑70 cm，水深50 cm)中，每桶30尾魚(yú)(體質(zhì)量為35.95 g±0.05 g)，用每種飼料隨機(jī)投喂3個(gè)桶，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，養(yǎng)殖試驗(yàn)共進(jìn)行55 d。

表1 試驗(yàn)飼料一般營(yíng)養(yǎng)組成(干物質(zhì))

表2 試驗(yàn)飼料配方

表3 試驗(yàn)飼料氨基酸組成(干物質(zhì))

表4 試驗(yàn)飼料原料脂肪酸組成

表5 試驗(yàn)飼料脂肪酸組成

采取定時(shí)定量投喂(8:00和16:00)，初始投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的1%，之后根據(jù)攝食狀況及時(shí)調(diào)整投喂量，投喂后30 min排殘餌，記錄殘餌數(shù)量。養(yǎng)殖期間，控制水溫為(17.0±0.5)℃，鹽度為28～32，pH為7.8～8.2，溶解氧質(zhì)量濃度>7.0 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度<0.1 mg/L。

1.2.3 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束后，控食24 h，稱(chēng)重并計(jì)算增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)、攝食量(FI)、飼料系數(shù)(FCR)、蛋白質(zhì)效率(PER)、脂肪效率(LER)及存活率(SR)。從每桶隨機(jī)取8尾魚(yú)，尾靜脈取血，將血液于4 ℃冰箱靜置4 h后，4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，分離血清，分裝后置于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存待測(cè)。隨機(jī)取采血后的3尾魚(yú)，冰上分離肝臟，冰浴勻漿后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)中保存，用于相關(guān)酶活測(cè)定。每桶再取3尾全魚(yú)用于全魚(yú)氨基酸及脂肪酸組成測(cè)定。

1.2.4 樣品分析

1)飼料、全魚(yú)、肝臟氨基酸(除色氨酸外)與脂肪酸含量測(cè)定。稱(chēng)取一定量的凍干樣品，加入6 mL 6 mol/L HCl，80 ℃下金屬浴30 min，110 ℃下金屬浴24 h，趕酸后過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液收集于帶有旋塞的樣品瓶中，用氨基酸分析儀(HITACHI L-8900, 日本)分析氨基酸組成及含量。脂肪酸含量的測(cè)定步驟參考Qiao等[7]的報(bào)道，通過(guò)高效氣相色譜儀(SHIMADZU GC-2010, 日本)測(cè)定。

2)血清生化指標(biāo)的測(cè)定。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)(TP)、葡萄糖(Glu)、總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量，具體操作方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

3)血清及肝臟抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)，采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定丙二醛含量(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及溶菌酶(LZM)活性，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

4)生長(zhǎng)性能及飼料利用參數(shù)。計(jì)算公式為

WGR=(mt-m0)/m0×100%，

SGR=(lnmt/lnm0)/t×100%，

FI=F/[(m0+mt)/2×t]，

FCR=F/(mt-m0)，

PER=(mt-m0)/(F×P)×100%，

LER=(mt-m0)/(F×L)×100%，

SR=Nt/N0×100%。

其中：mt、m0分別為試驗(yàn)終末和試驗(yàn)初始魚(yú)體平均質(zhì)量(g)；F為飼料攝入量(g)；P、L分別為飼料粗蛋白質(zhì)和粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；Nt、N0分別為試驗(yàn)終末和初始魚(yú)數(shù)量(ind.)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆生長(zhǎng)性能及飼料利用指標(biāo)的變化

從表6可見(jiàn)：各組試驗(yàn)魚(yú)存活率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；豆油組增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率與魚(yú)粉魚(yú)油組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，二者均顯著優(yōu)于其他組(P<0.05)，魚(yú)油組、芥花油組各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；魚(yú)粉魚(yú)油組脂肪效率最高，豆油組次之，魚(yú)油組及芥花油組最低(P<0.05)。

表6 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響

2.2 大菱鲆體成分的變化

從表7可見(jiàn)：各組粗蛋白質(zhì)及水分含量無(wú)顯著性差異(P<0.05)；魚(yú)粉魚(yú)油組與豆油組粗脂肪含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于其他組(P<0.05)；魚(yú)粉魚(yú)油組粗灰分含量最高，魚(yú)油組、芥花油組次之，豆油組最低(P<0.05)。

表7 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆體組成成分的影響(濕物質(zhì))

2.3 大菱鲆全魚(yú)及肝臟氨基酸、脂肪酸組成的變化

從表8可見(jiàn)：大菱鲆全魚(yú)氨基酸組成中，氨基酸總量及必需氨基酸總量顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)；除Met及Phe外，其余各種必需氨基酸均有不同程度的提高，豆油組Met含量最高，各組Phe含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)；各組∑NEAA無(wú)顯著性差異(P>0.05)，魚(yú)油組、芥花油組、豆油組Gly、Pro、Ala含量總體上顯著低于魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)。

表8 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆全魚(yú)氨基酸組成的影響(干物質(zhì))

從表9可見(jiàn)：大菱鲆肝臟氨基酸組成中，芥花油組及豆油組Met含量較魚(yú)粉魚(yú)油組顯著下降(P<0.05)，魚(yú)油組、芥花油組及豆油組其余必需氨基酸較魚(yú)粉魚(yú)油組有一定程度的提高；對(duì)于非必需氨基酸，豆油組Ala含量顯著低于其他組(P<0.05)，魚(yú)油組、芥花油組及豆油組其余非必需氨基酸較魚(yú)粉魚(yú)油組有一定程度提高。

表9 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆肝臟氨基酸組成的影響(干物質(zhì))

從表10可見(jiàn)：大菱鲆全魚(yú)脂肪酸組成中，魚(yú)粉魚(yú)油組∑SFA顯著高于其他組(P<0.05)，魚(yú)油組次之，芥花油組最低；芥花油組C18:1n-9、∑MUFA顯著高于其他組(P<0.05)；魚(yú)油組、芥花油組及豆油組∑n-6PUFA顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)，豆油組C18:2n-6顯著高于其他組(P<0.05)；魚(yú)粉魚(yú)油組、魚(yú)油組∑n-3PUFA、EPA含量顯著高于其他組(P<0.05)，而芥花油組最低，魚(yú)粉魚(yú)油組DHA含量顯著高于其他組(P<0.05)，而魚(yú)油組最低。

表10 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆全魚(yú)脂肪酸組成的影響

從表11可見(jiàn)：大菱鲆肝臟脂肪酸組成中，芥花油組及豆油組∑SFA顯著降低(P<0.05)；芥花油組C18:1n-9及∑MUFA顯著高于其他組(P<0.05)，而豆油組∑MUFA則最低(P<0.05)；芥花油組及豆油組C18:2n-6及∑n-6PUFA顯著高于其他組(P<0.05)；芥花油組及豆油組EPA、DHA及∑n-3PUFA顯著低于其他組(P<0.05)。

表11 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆肝臟脂肪酸組成的影響

2.4 大菱鲆幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的變化

從表12可見(jiàn)：各組血清Glu、TP及T-CHO含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；各替代組TG含量顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)；芥花油組LDL-C含量顯著高于魚(yú)油組、魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)；魚(yú)粉魚(yú)油組、魚(yú)油組HDL-C含量顯著高于其他組(P<0.05)；各組間ACP、AST活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，芥花油組及豆油組AKP和ALT活性顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)。

表12 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

2.5 大菱鲆幼魚(yú)血清與肝臟抗氧化能力的變化

從表13可見(jiàn)：各組血清中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，芥花油組、豆油組血清中LZM活性顯著低于其他組(P<0.05)；豆油組肝臟SOD活性最低，但與其他3組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；芥花油組MDA含量顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組和魚(yú)油組(P<0.05)；魚(yú)粉魚(yú)油組的CAT和LZM活性顯著高于其他組(P<0.05)；魚(yú)油組、芥花油組GSH-Px活性顯著低于魚(yú)粉魚(yú)油組(P<0.05)。

表13 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆幼魚(yú)血清與肝臟抗氧化酶活力的影響

3 討論

3.1 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響

本試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)8周的養(yǎng)殖試驗(yàn)，魚(yú)油組、芥花油組試驗(yàn)魚(yú)生長(zhǎng)性能與飼料利用率均顯著低于魚(yú)粉魚(yú)油組、豆油組，而豆油組與魚(yú)粉魚(yú)油組增重率、特定生長(zhǎng)率、攝食量、餌料系數(shù)及蛋白效率無(wú)顯著性差異。魚(yú)粉不僅營(yíng)養(yǎng)全面，而且是天然的誘食劑。研究者對(duì)虹鱒Oncorhynchusmykiss[8]、黃尾魳Seriolaquinqueradiata[9]及金鯛[10]等的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低增重率主要是由魚(yú)粉替代后攝食量降低導(dǎo)致。本試驗(yàn)中，魚(yú)油組、芥花油組及豆油組攝食量顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組，可能與添加的誘食劑有關(guān)。充足的攝食是生長(zhǎng)的必然前提，然而并不一定帶來(lái)良好的生長(zhǎng)表現(xiàn)，如本試驗(yàn)中魚(yú)油組、芥花油組攝食量雖高于魚(yú)粉魚(yú)油組、豆油組，但餌料系數(shù)卻顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組、豆油組，即飼料效率(feed efficiency, FE)低于魚(yú)粉魚(yú)油組、豆油組，故導(dǎo)致魚(yú)油組、芥花油組增重率低于魚(yú)粉魚(yú)油組、豆油組。這一結(jié)果與對(duì)日本真鱸Lateolabraxjaponicus的研究結(jié)果一致[11]，以大豆蛋白替代75%的魚(yú)粉時(shí)，該組有較高的攝食量，但飼料效率較低，故增重率亦較低。

飼料由蛋白質(zhì)及脂肪兩大主要成分組成，蛋白質(zhì)效率、脂肪效率和飼料效率本質(zhì)均反映試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)飼料的利用情況。本試驗(yàn)中，由于魚(yú)粉魚(yú)油組添加了較其他組精細(xì)植物蛋白原料粗糙的魚(yú)粉，而豆油組添加了顆粒蓬松的裂壺藻粉，因此，這兩組飼料顆粒較魚(yú)油組及芥花油組蓬松，而魚(yú)油組、芥花油組飼料添加的精細(xì)植物蛋白料顆粒較硬，推測(cè)這可能會(huì)影響試驗(yàn)魚(yú)的攝食及消化吸收，進(jìn)而影響各組的增重率、餌料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率和脂肪效率。Andrew等[12]對(duì)金鯛的研究表明，相較于普通飼料，質(zhì)地柔軟的飼料更有利于消化吸收。Aas等[13]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)海水浸泡的飼料相較于干料能夠更快地從大西洋鮭的胃中轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸，更利于消化與吸收。由于飼料質(zhì)地對(duì)試驗(yàn)魚(yú)消化吸收的相關(guān)報(bào)道較少，因此，在這方面仍需進(jìn)一步的研究。此外，本試驗(yàn)中雖使用多種植物蛋白源，并補(bǔ)充相應(yīng)的晶體氨基酸，但由于魚(yú)體對(duì)晶體氨基酸與飼料蛋白質(zhì)中結(jié)合態(tài)氨基酸在消化吸收時(shí)間上的不同步，會(huì)造成氨基酸利用過(guò)程中的不平衡，另外，飼料在制作過(guò)程中，晶體氨基酸的損失也會(huì)影響氨基酸的平衡。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸缺乏會(huì)降低大菱鲆的生長(zhǎng)及飼料利用效果，且會(huì)對(duì)腸道有一定損傷。Peres等[15]研究表明，賴(lài)氨酸含量與大菱鲆的生長(zhǎng)密切相關(guān)。因此，氨基酸的不平衡也是導(dǎo)致各處理組生長(zhǎng)性能低于魚(yú)粉魚(yú)油組的原因。

3.2 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆營(yíng)養(yǎng)組成及氨基酸、脂肪酸組成的影響

本試驗(yàn)中，各組全魚(yú)水分含量及粗蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著性差異，說(shuō)明植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油并未對(duì)全魚(yú)粗蛋白質(zhì)及水分沉積造成影響。魚(yú)粉魚(yú)油組、豆油組全魚(yú)粗脂肪含量顯著高于魚(yú)油組、芥花油組，主要是由于魚(yú)油組及芥花油組脂肪效率較低導(dǎo)致，故此兩組魚(yú)脂肪沉積較少。此外，魚(yú)油組、芥花油組飼料效率低，可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少，在某種意義上魚(yú)處于饑餓狀態(tài)，養(yǎng)殖魚(yú)可能需要消耗更多脂肪以提供機(jī)體生命活動(dòng)的能量，故而減少了機(jī)體的脂肪含量。這與Yang等[16]對(duì)牙鲆Paralichthysolivaceus及Li等[17]對(duì)異育銀鯽Carassiusauratusgibeliovar.CAS III的研究結(jié)果類(lèi)似，本研究結(jié)果表明，饑餓會(huì)促進(jìn)脂肪分解產(chǎn)能。

相較于魚(yú)粉魚(yú)油組，魚(yú)油組、芥花油組及豆油組全魚(yú)氨基酸組成中的各必需氨基酸含量均有不同程度的提高，而與全魚(yú)氨基酸不同的是，芥花油組及豆油組肝臟中Met含量則顯著降低。本試驗(yàn)中，雖采用多種植物蛋白添加相應(yīng)的晶體氨基酸替代魚(yú)粉，使得氨基酸模式與對(duì)照組接近，但機(jī)體內(nèi)晶體氨基酸與蛋白質(zhì)消化吸收不同步[18-19]，未同步消化的氨基酸進(jìn)入魚(yú)機(jī)體主要代謝器官，而后繼續(xù)利用，重新分配，以保證機(jī)體正常生長(zhǎng)。肝臟是機(jī)體主要的營(yíng)養(yǎng)代謝器官，且是調(diào)節(jié)代謝的中樞器官，因此，推測(cè)肝臟氨基酸中Met顯著下降的原因有兩方面，一是飼料中缺乏Met；二是由于飼料中缺乏Met，而機(jī)體又無(wú)法合成Met，肝臟通過(guò)調(diào)節(jié)代謝，減少肝臟中Met的沉積，使Met更多的流向機(jī)體，以保證機(jī)體的正常生長(zhǎng)，從而對(duì)全魚(yú)氨基酸組成影響較小。根據(jù)Skiba-Cassy等[20]對(duì)虹鱒的研究，投喂缺乏Met的飼料，會(huì)提高與氨基酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)量，激活可以減少蛋白質(zhì)合成、促進(jìn)氨基酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)的GCN2/eIF2α(GCN2，general control non-derepressible 2; eIF2α，elongation initiation factor 2α)通路。而根據(jù)Panserat等[21]對(duì)虹鱒的研究，投喂100%植物源飼料時(shí)虹鱒肝臟57%的差異表達(dá)基因的功能與代謝相關(guān)，而其中37%和蛋白質(zhì)代謝緊密相關(guān)。氨基酸不平衡會(huì)影響肝臟氨基酸組成，同樣也影響到魚(yú)的生長(zhǎng)性能，具體表現(xiàn)在飼喂不同飼料的魚(yú)，若魚(yú)達(dá)到相同體質(zhì)量，氨基酸不平衡飼料組所用時(shí)間較長(zhǎng)，相同時(shí)間下，增重率及飼料效率均較低。

植物油缺乏魚(yú)油富含的多不飽和脂肪酸(PUFA)，尤其是海水魚(yú)生長(zhǎng)所必需的DHA及EPA[22]。裂壺藻富含DHA[23]，在魚(yú)油替代的試驗(yàn)中常作為DHA的重要來(lái)源[24]。擬微綠球藻富含EPA，常作為輪蟲(chóng)鹵蟲(chóng)的EPA供給源[25]，也作為EPA來(lái)源應(yīng)用在日本對(duì)蝦Marsupenaeusjaponicus[26]、牙鲆[27]幼體的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化中。本試驗(yàn)結(jié)果表明，全魚(yú)及肝臟脂肪酸組成反映了各組飼料的脂肪酸組成特點(diǎn)。這與利用植物油替代大菱鲆[28]、金鯛[29]和軍曹魚(yú)[30]飼料中魚(yú)油的研究結(jié)果一致。長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFA)的合成是一個(gè)以18個(gè)碳原子的脂肪酸長(zhǎng)鏈(亞油酸C18:2n-6、亞麻酸C18:3n-3)為底物，通過(guò)Δ6脂肪酸去飽和酶(Δ6fatty acyl desaturase, Fad)、延長(zhǎng)酶及Δ5去飽和酶(Δ5Fad)進(jìn)行合成的過(guò)程。 本試驗(yàn)中，替代組全魚(yú)脂肪酸中C20:4n-6、EPA及DHA的減少，反映了大菱鲆中C18:2n-6轉(zhuǎn)化成C20:4n-6，C18:3n-3轉(zhuǎn)化成EPA、DHA的能力有限。

3.3 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)中，魚(yú)油組、芥花油組及豆油組甘油三酯含量顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組，這與Li等[31]利用小麥胚芽油替代珍珠龍膽石斑魚(yú)Epinephelusfuscoguttatus♀ ×Epinepheluslanceolatus♂日糧中魚(yú)油的試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。LDL主要轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)自肝臟的內(nèi)源性膽固醇，并通過(guò)血液送至各個(gè)組織和器官，HDL的功能則與其相反，主要轉(zhuǎn)運(yùn)外源性膽固醇至肝臟。本試驗(yàn)中，魚(yú)粉魚(yú)油組、魚(yú)油組及豆油組LDL-C低于芥花油組，而HDL-C含量則與之相反，這與Li等[32]對(duì)金鯧的研究結(jié)果一致。該試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著飼料中n-3HUFA的升高，血清中TG、T-CHO及LDL-C含量顯著下降。由此可見(jiàn)，飼料中適宜的n-3PUFA含量能促進(jìn)脂肪的代謝，這也是導(dǎo)致本試驗(yàn)中脂肪效率差異顯著的主要原因。

血清中Glu含量可作為魚(yú)類(lèi)應(yīng)激反應(yīng)的指示指標(biāo)，而血清中TP含量也可一定程度上反映魚(yú)類(lèi)非特異性免疫能力。本試驗(yàn)中，各組血清Glu、TP含量無(wú)顯著性差異，這與Glencross等[33]對(duì)尖吻鱸上的研究結(jié)果一致。表明植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆血清中Glu及TP的代謝未產(chǎn)生負(fù)面影響。

肝臟AST和ALT是反映肝臟健康狀態(tài)的重要指示酶，當(dāng)肝臟受到外界毒素脅迫或代謝出現(xiàn)紊亂致使肝功能受損時(shí)，肝臟細(xì)胞被破壞，肝臟中轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液[34]。本試驗(yàn)中各組血清AST水平無(wú)顯著性差異，但魚(yú)油組、芥花油組及豆油組ALT水平則顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組。Li等[35]利用大豆?jié)饪s蛋白替代星斑川鰈Platichthysstellatus飼料中的魚(yú)粉，隨著替代水平的升高，血清中AST及ALT水平升高。棉籽粕在低水平替代魚(yú)粉(最高替代水平為7%)的情況下，不會(huì)提高武昌魚(yú)Megalobramaamblycephala血清中兩種轉(zhuǎn)氨酶的水平[36]，對(duì)肝臟損傷較小，但高水平(最高替代水平為60%)替代下，則會(huì)顯著提高烏蘇里鲇Pseudobagrusussuriensis血清中轉(zhuǎn)氨酶水平，對(duì)肝臟造成損傷[37]。而Song等[38]利用大豆水解蛋白替代星斑川鰈飼料中魚(yú)粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，即便替代100%的魚(yú)粉，其血清中兩種轉(zhuǎn)氨酶的水平與對(duì)照組也無(wú)顯著差異。Dossou等[1]用發(fā)酵菜籽粕替代真鯛日糧中的魚(yú)粉時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在所有替代水平下，血清中兩種轉(zhuǎn)氨酶水平與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。綜上，利用植物蛋白替代魚(yú)粉可能會(huì)導(dǎo)致血清中AST及ALT水平升高，并造成肝臟損傷，而植物原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子是導(dǎo)致肝臟損傷的主要原因[39]，同時(shí)，植物原料替代魚(yú)粉時(shí)不同替代水平或飼喂不同養(yǎng)殖對(duì)象，對(duì)肝臟的影響是不同的。經(jīng)發(fā)酵或者水解后的蛋白源，抗?fàn)I養(yǎng)因子被有效降低或剔除，其對(duì)肝臟損傷程度明顯降低或無(wú)損傷。另外，有研究表明，植物油替代魚(yú)油同樣會(huì)對(duì)肝臟造成損傷，Wang等[3]用亞麻籽油替代大菱鲆日糧中魚(yú)油的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著替代水平升高，血清中ALT水平也顯著升高，這可能是由于植物油缺乏高不飽和脂肪酸所導(dǎo)致的。本試驗(yàn)中同時(shí)替代魚(yú)粉及魚(yú)油，與魚(yú)粉魚(yú)油組相比，其余3組在血清ALT水平均有所升高，且芥花油組水平最高。綜合考慮，這是由抗?fàn)I養(yǎng)因子及高不飽和脂肪酸的缺乏共同導(dǎo)致的。

3.4 植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆幼魚(yú)抗氧化及非特異性免疫能力的影響

AKP及ACP被認(rèn)為是機(jī)體免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，且其本身也是非特異性免疫的重要水解酶，不僅可以水解入侵的病原體，而且可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬及降解作用[40]。本試驗(yàn)中，各組血清中ACP活性無(wú)顯著性差異，芥花油組及豆油組AKP活性顯著提高。這與Li等[35]和Ray等[41]的報(bào)道一致，但Wang等[42]利用棉籽粕替代凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei飼料中魚(yú)粉的結(jié)果顯示，當(dāng)替代水平低于50%時(shí)，AKP及ACP活性與對(duì)照組并無(wú)顯著性差異，但當(dāng)替代水平進(jìn)一步提高，這兩種酶活性顯著下降，由此推測(cè)，當(dāng)替代水平較低時(shí)，養(yǎng)殖魚(yú)能夠應(yīng)對(duì)飼料所引起的內(nèi)環(huán)境變化，而當(dāng)替代水平進(jìn)一步提高，突破魚(yú)機(jī)體自我調(diào)控能力時(shí)，表現(xiàn)出酶活性的降低。因此，試驗(yàn)對(duì)象應(yīng)對(duì)植物原料所引起的內(nèi)環(huán)境變化的自我調(diào)控能力是有限的，這一能力因魚(yú)種、替代水平及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量而異。本試驗(yàn)中使用多種植物蛋白源，盡可能避免使用單一原料而導(dǎo)致抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過(guò)高，從存活率來(lái)看，試驗(yàn)對(duì)象對(duì)原料所引起的內(nèi)環(huán)境的變化在其可自我調(diào)控范圍內(nèi)。

SOD、CAT和GSH-Px是生物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，可以有效清除活性氧自由基以保護(hù)機(jī)體組織免受損傷。LZM是魚(yú)體非特異性免疫系統(tǒng)中重要的酶，能保護(hù)機(jī)體免受外源微生物的入侵。MDA是脂肪氧化的終產(chǎn)物之一，在體內(nèi)蓄積會(huì)使得機(jī)體被活性氧族損傷。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組在血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量上無(wú)顯著性差異，肝臟中SOD活性也無(wú)顯著性差異，芥花油組肝臟MDA含量顯著高于魚(yú)粉魚(yú)油組，而豆油組則在肝臟GSH-Px活性及MDA含量上與魚(yú)粉魚(yú)油組無(wú)顯著性差異。各處理組肝臟中CAT活性顯著低于魚(yú)粉魚(yú)油組，且無(wú)論血清或者肝臟中LZM水平在各處理組中均低于魚(yú)粉魚(yú)油組。以上結(jié)果與對(duì)真鯛[1]和星斑川鰈[38]飼料中魚(yú)粉替代的研究結(jié)果類(lèi)似。Wang等[3]在利用亞麻籽油替代大菱鲆日糧中魚(yú)油的研究中也發(fā)現(xiàn)，植物油替代魚(yú)油會(huì)對(duì)魚(yú)體免疫能力造成負(fù)面影響，而Li等[32]對(duì)金鯧的研究表明，n-3HUFA有助于提高魚(yú)體抗氧化能力。本試驗(yàn)中，在魚(yú)粉及魚(yú)油均被替代的情況下，芥花油組n-3PUFA的缺乏是導(dǎo)致該組抗氧化能力下降的主要原因，而豆油組添加裂壺藻及擬微綠球藻有效提高了該組n-3PUFA的含量，該組抗氧化能力優(yōu)于芥花油組。此外，本研究結(jié)果也表明，植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油會(huì)對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)的非特異免疫能力造成負(fù)面影響，這可能也與某些氨基酸缺乏相關(guān)。飼料中適宜水平的精氨酸有利于提高養(yǎng)殖魚(yú)的抗氧化和非特異免疫能力，Zhang等[43]對(duì)大菱鲆的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸對(duì)試驗(yàn)魚(yú)生長(zhǎng)并無(wú)促進(jìn)作用，但可提高其非特異免疫及抗病能力。本試驗(yàn)處理組雖補(bǔ)充了晶體精氨酸，但由于飼料制作過(guò)程中的損失，以及晶體氨基酸和結(jié)合態(tài)氨基酸消化吸收不同步，造成了精氨酸在體內(nèi)代謝過(guò)程中處于相對(duì)缺乏的狀態(tài)，從而對(duì)處理組非特異性免疫能力造成了負(fù)面影響。

4 結(jié)論

1)不同植物性原料替代魚(yú)粉魚(yú)油對(duì)大菱鲆生長(zhǎng)性能影響程度不一。豆油組生長(zhǎng)性能與魚(yú)粉魚(yú)油組接近，優(yōu)于芥花油組及魚(yú)油組，混合植物蛋白配合豆油及藻粉有望成為替代魚(yú)粉魚(yú)油的理想飼料。

2)植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油會(huì)影響大菱鲆全魚(yú)及肝臟氨基酸和脂肪酸組成。氨基酸方面，主要是某些必需氨基酸含量的降低；脂肪酸組成直接反映出飼料脂肪酸的特點(diǎn)，替代組大菱鲆全魚(yú)及肝臟中DHA、EPA含量明顯下降。

3)植物原料替代魚(yú)粉魚(yú)油會(huì)對(duì)大菱鲆的抗逆能力帶來(lái)一定影響。以植物蛋白源搭配豆油及混合藻粉的豆油組在生長(zhǎng)性能及抗逆能力方面優(yōu)于芥花油組及魚(yú)油組。同時(shí)替代魚(yú)粉魚(yú)油，必需氨基酸如蛋氨酸、賴(lài)氨酸，某些脂肪酸的缺乏，以及抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，是影響大菱鲆抗逆能力的主要因素。

4)通過(guò)調(diào)節(jié)全植物蛋白飼料中脂肪酸的組成及飼料質(zhì)地，可有效提高大菱鲆對(duì)飼料的利用效率。