謝曉陽，范 毅，王 偉，景炳年，陳譚星，劉雨晴，顏慧萍，曹力凡

（1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心/河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗室，河南 鄭州 450002；2.河南省高新技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司，河南 鄭州 450002）

刺梨（Rosa roxbunghii）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，又稱刺菠蘿，是滋補(bǔ)健身的食藥兩用營養(yǎng)珍果[1]。最早種植于貴鄂山區(qū)，自1993年以來，刺梨被政府列為扶貧項目大力扶持和推廣，中原地區(qū)的河南省開始人工大規(guī)模種植刺梨，是刺梨干果的主產(chǎn)區(qū)。刺梨鮮果中有著豐富的維生素、多糖、有機(jī)酸、酚類、氨基酸和微量元素等營養(yǎng)成分[2-3]，研究表明，刺梨中活性物質(zhì)含量都顯著高于這些常見水果蔬菜，其體外抗氧化能力，是常見水果蔬菜的10～60倍[4]，其中刺梨果多糖是鮮果中主要的一種水溶性成分，由10個以上單糖通過糖苷鍵鏈接的高分子聚合物[5]，目前證實(shí)具有廣泛的生物活性，楊江濤[6]報道了刺梨粗多糖具有提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化的能力，增強(qiáng)動物的非特異性免疫和體液免疫應(yīng)答；崔昊等[7]也研究發(fā)現(xiàn)，刺梨多糖對補(bǔ)體途徑和替代途徑均有著積極的作用。

目前在刺梨發(fā)酵多糖方面的報道不多，并且多數(shù)為自然發(fā)酵[8-10]。而在微生物發(fā)酵刺梨果多糖的相關(guān)報道中，使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為發(fā)酵菌株的居多[11-12]，而本研究在預(yù)選發(fā)酵菌種中又挑選了產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）和扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），前者其蛋白質(zhì)和維生素B的含量都遠(yuǎn)高于普通釀酒酵母[13]，而后者產(chǎn)香產(chǎn)氣豐富主要用在釀酒上[14]。另外由于清除自由基是表征抗氧化能力的一個重要指標(biāo)，而1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基是一種較穩(wěn)定的含氮自由基，可重復(fù)性強(qiáng)，使用范圍廣[15]。為了進(jìn)一步研究開發(fā)刺梨的食藥價值、挖掘和拓展刺梨產(chǎn)品的應(yīng)用，將DPPH自由基清除率作為刺梨果多糖抗氧化活性評價指標(biāo)。

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）則考慮了試驗隨機(jī)誤差，在實(shí)驗條件尋優(yōu)過程中，可以連續(xù)的對試驗的各個水平進(jìn)行分析。同時響應(yīng)面法將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的一次或二次多項式模型來擬合，計算比較簡便，是解決實(shí)際問題的有效手段[16-18]。本研究以河南開封野生刺梨果為原料，采用產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）及釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行發(fā)酵，通過傳統(tǒng)水提法制備刺梨果多糖發(fā)酵液，以生長曲線、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率和鐵離子還原能力分析挑選出發(fā)酵優(yōu)勢菌株。在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken（BB）試驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面試驗法，優(yōu)化微生物發(fā)酵刺梨果多糖工藝條件，為今后刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

野生刺梨：開封市金維康野生植物開發(fā)有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

DPPH清除能力試劑盒、鐵離子還原能力測試試劑盒：上海琮益科技有限公司；總多糖含量測定測試盒：江蘇艾迪生生物科技有限公司；纖維素酶（50 000 U/g）：上海羅恩試劑公司。其他所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母粉麥芽糖（yeast maltose，YM）培養(yǎng)基：酵母粉0.6 g/L，麥芽提取物0.6 g/L，葡萄糖2 g/L，蛋白胨1 g/L，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PICO 21高速離心機(jī)：美國熱電公司；5804R高速冷凍離心機(jī)：德國艾本德（中國）有限公司；MDF-U5411超低溫冰箱：日本三洋公司；BP310S-OCE精密天平：德國塞多利斯（中國）有限公司；PHS-3C精密pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LDZF-75L-II高壓高溫滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HB-031金屬加熱器：上海申能（集團(tuán)）有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱：徐州東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；T10紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AUY 220電子天平：日本島津公司；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；MJ-ZZ12粉碎機(jī)：美的電器集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 刺梨發(fā)酵酵母菌的選擇

3株酵母菌采用YM培養(yǎng)基，按照2%接種量，以培養(yǎng)時間（0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）為橫坐標(biāo)，吸光度值（OD600nm）為縱坐標(biāo)，繪制產(chǎn)朊假絲酵母、扣囊復(fù)膜孢酵母、釀酒酵母的生長曲線，觀察3株菌株的生長狀況。

分別采用產(chǎn)朊假絲酵母、扣囊復(fù)膜孢酵母、釀酒酵母對刺梨汁進(jìn)行發(fā)酵，然后分別按0.5 mg/L的多糖制備樣品進(jìn)行DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力的抗氧化活性測定，以未發(fā)酵樣品為對照，進(jìn)行4次平行重復(fù)試驗。

通過菌株生長狀況及其發(fā)酵液抗氧化活性選擇優(yōu)良菌株進(jìn)行刺梨發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵液制備

以野生刺梨果為原料，通過傳統(tǒng)水提法[19]（料液比1∶20（g∶mL），提取溫度75 ℃，提取時間3 h）提取刺梨多糖。將已制備好的刺梨多糖提取液代替YM培養(yǎng)基中的蒸餾水，用來制備每瓶200 mL刺梨多糖YM培養(yǎng)基，121 ℃滅菌15 min，靜置冷卻后得到刺梨多糖YM培養(yǎng)基。在刺梨多糖YM培養(yǎng)基中按照2%的接種量加入酵母菌，28 ℃靜置培養(yǎng)50 h，得到刺梨多糖發(fā)酵液。

1.3.3 刺梨多糖的制備

取上述刺梨多糖發(fā)酵液稀釋1倍后，通過超聲波清洗器進(jìn)行處理（功率80 W，溫度70 ℃，超聲時間10 min）；加入纖維素酶5 mg/mL，50 ℃水浴加熱70 min；室溫條件下5 000 r/min離心10 min，取上清液，加3倍體積無水乙醇進(jìn)行醇提過夜，5 000 r/min離心15 min后，70 ℃烘干得到刺梨粗多糖。

1.3.4 多糖含量的測定

刺梨粗多糖含量通過基于蒽酮-硫酸顯色法[20]的總多糖含量檢測試劑盒測定。以吸光度值（y）（OD540nm）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度（x）（0、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1 mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.215 3x-0.005 1（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3）計算發(fā)酵液中的多糖含量。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

刺梨果多糖DPPH自由基清除率采用試劑盒測定。從-20 ℃冰箱取出DPPH試劑，37 ℃平衡20 min以上，待試劑溶化后，在試劑瓶中加入100 mL無水乙醇，劇烈振蕩使試劑充分溶解。分別吸取DPPH溶液1 mL，與其等量的無水乙醇、以及不同濃度多糖樣品混合，充分搖勻后，室溫放置避光靜置30 min使之充分反應(yīng)。Ai表示含有樣品和DPPH的溶液的吸光度值，Aj表示含有樣品和無水乙醇的溶液的吸光度值，A0表示含有無水乙醇和DPPH的溶液的吸光度值（空白對照）。清除50%DPPH自由基所需的樣品溶液濃度即半抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）值通過繪制自由基清除率與樣品濃度的關(guān)系來計算。測定波長517 nm處吸光度值，所有的實(shí)驗均進(jìn)行3次重復(fù)。DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.3.6 鐵離子還原能力的測定

鐵離子還原能力測試試劑盒來測定刺梨果多糖的鐵離子還原能力。取不同濃度的多糖樣品，依次加入1 mL的磷酸緩沖液（pH 6.6）和1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液。混合物50 ℃水浴20 min，快速冷卻后再加入1 mL 10%的三氯乙酸，充分混勻后，3 000 r/min離心10 min，取3 mL上清液加入新試管中，取0.6 mL 0.1%三氯化鐵到上清液，充分混勻，室溫靜置10 min，測定波長700 nm處的吸光度值。不加樣品的反應(yīng)液為空白對照。

1.3.7 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

設(shè)定菌種接種量分別為（1%、2%、3%、4%、5%），培養(yǎng)溫度為28 ℃，初始pH值分別為（3、4、5、6、7），發(fā)酵時間分別為（16 h、28 h、40 h、52 h、64 h），取200 mL多糖發(fā)酵液進(jìn)行抗氧化活性試驗，以刺梨果多糖的DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，分別考察接種量、初始pH值及發(fā)酵時間對發(fā)酵刺梨果多糖抗氧化活性影響。

1.3.8 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計

基于BB試驗設(shè)計，優(yōu)化發(fā)酵刺梨果多糖工藝，以發(fā)酵時間（Xi）、接種量（Xii）和初始pH值（Xij）為自變量，DPPH自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨發(fā)酵微生物的選擇

圖1 三種酵母菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of three yeast strains

由圖1可知，三種菌株在36 h時都開始進(jìn)入生長穩(wěn)定期，其中的產(chǎn)朊假絲酵母較之其他兩種菌株生長優(yōu)勢顯著，在12 h就已經(jīng)進(jìn)入到對數(shù)增長后期，并且產(chǎn)朊假絲酵母菌株濃度也顯著高于其他兩種菌株（P＜0.05），說明其生長狀況良好。

圖3 三種酵母菌株鐵離子還原能力的比較Fig.3 Comparison of iron ion reduction ability of three yeast strains

由圖2和圖3可知，三種菌株在對刺梨果多糖發(fā)酵后，與未發(fā)酵的原液相比多糖濃度都有一定的提高，是由于酵母菌在生長中主要以單糖和雙糖等小分子糖為碳源，從而起到純化多糖的作用，且GE Y等[21]報道純化后多糖的抗氧化活性和還原能力均大于粗多糖。另外許多研究表明，多糖的生物活性與其分子質(zhì)量有關(guān)。當(dāng)多糖的分子質(zhì)量不同時，抗氧化能力也不同，而據(jù)LIU W等[22-23]報道，多糖的分子質(zhì)量在通過發(fā)酵后是低于發(fā)酵前的水平。而其中產(chǎn)朊假絲酵母在發(fā)酵刺梨果多糖后，DPPH自由基清除率明顯高于其他菌株（P＜0.05）。可能由于產(chǎn)朊假絲酵母生長速度快，菌株密度大，對小分子糖消耗多，產(chǎn)生胞外多糖量相對大，而本身其產(chǎn)蛋白量高，胞外多糖抗氧化能力可能也優(yōu)于其他菌株。另外不但可以利用單糖、二糖，而且可以利用三糖，所以使得多糖純度提高，據(jù)HUANG Q L等[24-25]報道，產(chǎn)朊假絲酵母產(chǎn)生大量的次生代謝物具有抗氧化能力。因此，選取產(chǎn)朊假絲酵母作為發(fā)酵菌種。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵時間對刺梨果多糖DPPH自由基清除率的影響

設(shè)定接種量為1%，初始pH值為4，不同發(fā)酵時間（16 h、28 h、40 h、52 h、64 h）對發(fā)酵刺梨果多糖的DPPH自由基清除率的影響見圖4。由圖4可知，16～40 h的DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05），這個時間段的菌株處在對數(shù)增長期，對單糖和雙糖等小分子糖利用率不斷提高，使得多糖純度提高，抗氧化活性也明顯上升。發(fā)酵時間的逐漸延長，發(fā)酵液中多糖的DPPH自由基清除率在到達(dá)40 h后逐漸開始平穩(wěn)的趨勢，之后組間多糖的DPPH自由基清除率均差異不顯著（P＜0.05）。說明酵母菌在生長的過程中主要以小分子的單糖和雙糖為優(yōu)勢碳源，在對三糖的利用上，因為酵母菌的種類不同，而存在著一定的差異[21]，本試驗中可能由于刺梨果渣多糖發(fā)酵液中酵母菌在40 h 已趨于穩(wěn)定。因此，發(fā)酵時間40 h為宜。

圖4 發(fā)酵時間對多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides

2.2.2 接種量對刺梨果多糖DPPH自由基清除率的影響

圖5 接種量對多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of inoculum on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides

由圖5可知，隨著酵母菌接種量的增加刺梨果多糖DPPH自由基清除率呈逐漸上升的趨勢。接種量為1%時多糖DPPH自由基清除率低于其他各組；當(dāng)接種量為3%時多糖DPPH自由基清除率最高（P＜0.05）；接種量＞3%時，其含量則呈下降趨勢。這可能是由于酵母菌接種量較低時菌種和原料接觸不充分，而接種量過大則導(dǎo)致在有限的營養(yǎng)物質(zhì)下酵母菌生長受到限制，從而致使后續(xù)進(jìn)行發(fā)酵的動力不足，也可能由于菌種的不斷產(chǎn)生并不斷積累一些抑制產(chǎn)物，從而限制了發(fā)酵過程中菌種的正常生長[11]。因此，接種量3%為宜。

2.2.3 初始pH值對刺梨果多糖DPPH自由基清除率的影響

初始pH值對多糖含量的影響見圖6。由圖6可知，隨著初始pH 值的增加，酵母發(fā)酵制備多糖的DPPH自由基清除率逐漸增加，直到初始pH值＞5時多糖的DPPH自由基清除率開始降低，這可能是因為酵母菌適宜在偏酸性環(huán)境生長的原因，在pH值為中性時的發(fā)酵原液則影響了酵母菌細(xì)胞質(zhì)膜電荷及其穩(wěn)定性，以及菌體的代謝酶活性，從而改變了酵母菌對發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用情況[19]。在初始pH值為5時，酵母菌的生長情況最佳，其多糖DPPH自由基清除率高于其他各組。因此，初始pH值為5為宜。

圖6 初始pH值對多糖DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of initial pH on DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.3.1 BB試驗設(shè)計和結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間（Xi）、接種量（Xii）、初始pH值（Xij）為考察因素，以DPPH自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗優(yōu)化發(fā)酵刺梨果多糖的發(fā)酵工藝，采用多元二次回歸的方程擬合試驗結(jié)果，響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

續(xù)表

采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立二次回歸方程：Y=86.52+6.72Xi+3.23Xii-4.37Xij+0.33XiXii+2.49XiXij-0.06XiiXij-7.56Xi2-7.11Xii2-9.81Xij2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，一次項中發(fā)酵時間（Xi）、接種量（Xii）、初始pH值（Xij）以及平方項中發(fā)酵時間（Xi2）、接種量（Xii2）、初始pH值（Xij2）對響應(yīng)值影響極其顯著（P＜0.01），交互項中發(fā)酵時間與初始pH值（XiXij）對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），其他項不顯著（P＞0.05）。由回歸方差分析顯著性檢驗表明，該實(shí)驗數(shù)據(jù)所得的擬合模型F=63.99，P＞0.000 1，說明模型的回歸極顯著（P＜0.01），并且此模型的決定系數(shù)R2=0.988 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.972 6，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=2.21%，說明該模型的自變量和其響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，與實(shí)際的試驗擬合度高，實(shí)驗誤差小，可以用于微生物發(fā)酵刺梨果多糖提高抗氧化活性的理論預(yù)測。

2.3.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸模型繪制發(fā)酵時間、接種量、初始pH值的交互作用對發(fā)酵刺梨果多糖抗氧化活性影響的響應(yīng)面和等高線見圖7。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對各影響因素所形成的三維空間曲面圖，通過響應(yīng)面圖可形象看出最優(yōu)取值點(diǎn)及各參數(shù)之間的相互作用[26]。如果響應(yīng)面曲線越陡，則表明該因素對DPPH自由基清除率影響越大。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖7可知，Xi（發(fā)酵時間）對DPPH自由基清除率的影響最大，Xij（初始pH值）次之，Xii（接種量）最小，與表3方差分析的結(jié)果一致。根據(jù)試驗分析結(jié)果，各因素對綜合評分的影響交互項強(qiáng)弱順序為：XiXij＞XiXii＞XiiXij。

圖7 各因素交互作用對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on DPPH free radical scavenging rate

2.3.3 驗證試驗

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件預(yù)測的最優(yōu)工藝優(yōu)化結(jié)果為發(fā)酵時間49.9 h，接種量2.37%，初始pH值為3?？紤]到實(shí)施工藝參數(shù)的實(shí)際可操作性，將發(fā)酵刺梨果多糖最佳發(fā)酵工藝調(diào)整為：發(fā)酵時間50 h；接種量2%；初始pH值3。在此條件下平行進(jìn)行3次驗證試驗，測得刺梨果多糖DPPH自由基清除率實(shí)際值為86.56%，與模型預(yù)測值86.57%相比，相對誤差小。因此采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵刺梨果多糖提高抗氧化活性的工藝條件的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，條件穩(wěn)定，同時也說明建立的回歸模型合理。具有一定的實(shí)用價值?？捎糜谝院蟮拇汤姘l(fā)酵提高抗氧化活性的研究中。

3 結(jié)論

本研究主要針對刺梨果多糖的抗氧化活性提高進(jìn)行研究，通過優(yōu)勢菌株的選擇和發(fā)酵工藝改善達(dá)到提高抗氧化活性的目的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)朊假絲酵母作為發(fā)酵菌株，發(fā)酵后的刺梨果多糖抗氧化能力最高，所以作為發(fā)酵菌種，以YM培養(yǎng)基為菌種發(fā)酵底物，通過前期優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對刺梨汁進(jìn)行發(fā)酵后，提取粗多糖進(jìn)行抗氧化分析。

本研究除了通過單因素試驗及Box-Behnken試驗設(shè)計建立數(shù)學(xué)模型，對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過試驗設(shè)計和結(jié)果分析，獲得最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵時間50 h、接種量2%、初始pH值3。在此最佳條件下，刺梨果多糖DPPH自由基清除率達(dá)到86.56%，為以后刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。