朱姝蕊，冀瑞卿，李 玉**

（1.麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130000）

菌根是生物界中最廣泛及最重要的一類共生體，其中外生菌根在森林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[1]，其能擴(kuò)大樹木根系的吸收面積和吸收范圍，增強(qiáng)共生樹木對營養(yǎng)元素的吸收和利用[2]，提高共生植物的抗逆性和抗病性[3]，增強(qiáng)樹木生長能力和提高造林的成活率，改良土壤和提高土壤生產(chǎn)力，促進(jìn)真菌與植物間的物質(zhì)交換，能量流動和信息傳遞等[4]。外生菌根資源豐富，1982年Miller統(tǒng)計出世界上己知有34個科、90個屬、約5 000種真菌形成外生菌根[5]，隨著分子生物學(xué)在菌根領(lǐng)域的應(yīng)用，2005年Taylor and Alexander重新預(yù)估了外生菌根真菌的種類數(shù)量，其數(shù)量可能為 7 000～10 000種[6]。真菌能與山毛櫸科植物中的板栗形外生菌根早已得到證實，并已有諸多研究[7-8]。

板栗（Castanea mollissima） 又名栗、中國板栗，屬雙子葉植物綱（Magnoliopsida） 山毛櫸目（Fagales） 山毛櫸科（Fagaceae） 栗屬（Castanea），廣泛分布于中國、越南、歐美等地區(qū)，現(xiàn)已可人工栽培。1995年秦嶺等[8]對燕山山脈板栗林下菌根資源研究顯示，與板栗共生的外生菌根真菌約有13屬、29種，由此可見板栗的菌根資源十分豐富。除野外資源調(diào)查外，對板栗外生菌根在室內(nèi)合成的研究也有少量報道，2009年耿立英[9]利用印度塊菌（Tuber indicum）合成板栗菌根，并對形態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)描述；2012年池彥濤[10]以美味牛肝菌（Boletus edulis） 和褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus）為菌劑，測定接種處理后的板栗幼苗生理指標(biāo)，結(jié)果顯示在缺鐵脅迫環(huán)境下，外生菌根的合成能夠促進(jìn)板栗苗株高和地徑的增長，有效地促進(jìn)葉綠素的積累，但對菌根合成方法和菌根形態(tài)的描述未有詳細(xì)闡述。

點柄黏蓋牛肝菌 [Suillus granulatus(L.:Fr.)O.Kuntce]，屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌亞門（Agaricomycotina） 傘菌綱 （Agricomycetes） 傘菌亞綱（Agaricomycetidae） 牛肝菌目（Boletales） 牛肝菌科（Suillaceae） 乳牛肝菌屬（Suillus），是一種名貴的可食用外生菌根真菌，具有菌肉肥厚、味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富等特點，受到人們的青睞，是我國東北地區(qū)野生食用菌進(jìn)出口貿(mào)易的重要品種，但目前無法人工栽培。

菌根是形成外生菌根菌真菌子實體的前提，要研究點柄黏蓋牛肝菌的人工栽培技術(shù)，需從人工合成外生菌根入手，但至今尚未有對此菌與板栗合成外生菌根的報道。因此，選擇點柄黏蓋牛肝菌與板栗為研究對象，對其人工合成外生菌根進(jìn)行初步的研究與探討，為點柄黏蓋牛肝菌人工栽培技術(shù)提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 板栗種子處理

板栗種子，購自吉林省長春市種子資源市場；用清水清理洗滌，去除雜質(zhì)。用1%的高錳酸鉀表面消毒，浸泡4 h～5 h；后用無菌水洗滌至水無色，盛放在鋪滿脫脂棉的培養(yǎng)盤中，放置于25℃培養(yǎng)箱2 d，間隔12 h澆無菌水，直至種子萌發(fā)裂口。

1.1.2 真菌培養(yǎng)與菌劑制備

點柄黏蓋牛肝菌菌種，來源于吉林省蛟河國家級重點公益林區(qū)野外分離。選用PDA固體培養(yǎng)基[11]，溫度28℃，濕度70%～75%，避光培養(yǎng)30 d～35 d。將長滿平板中的菌絲與培養(yǎng)基分離，用無菌水洗滌3次。1 L無菌水中加入菌絲40 g，用攪拌機(jī)攪碎30 s制成菌劑，待用[12]。

1.1.3 培養(yǎng)基質(zhì)配比與處理

培養(yǎng)基質(zhì)由珍珠巖、蛭石、草炭土3種材料混合，體積比為1∶4∶5[4]，混合均勻后，121℃高溫滅菌2 h，達(dá)到相對無菌狀態(tài)。培養(yǎng)選用聚乙烯培養(yǎng)盆和培養(yǎng)缽，體積分別為60 cm×40 cm×60 cm和30 cm×20 cm，使用前用75%乙醇浸泡消毒。

1.2 試驗方法

1.2.1 板栗接種菌劑

板栗種子根據(jù)1.1.1的方法處理完，至種子口開裂后，播種于裝滿無菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，置于培養(yǎng)室內(nèi)，濕度60%～75%，溫度20℃～25℃，間隔7 d澆水1次，根據(jù)時節(jié)，調(diào)整供水量，保證苗木正常生長即可，栽培1年。滿1年后，將苗木移栽，移栽過程中，將板栗根系外圍側(cè)根簡略處理，沾菌劑，在新培養(yǎng)缽中填滿2/3培養(yǎng)基質(zhì)，后將處理好的苗木放置其中，再倒入100 mL菌絲懸液，覆土填滿培養(yǎng)缽。培養(yǎng)初期，保持培養(yǎng)室與土壤的微干旱環(huán)境，約7 d后，補接菌劑，用菌劑澆灌苗木。后以10 d為一個周期，以水澆灌苗木，栽培3月后，觀察板栗根系情況。

1.2.2 觀察菌根形態(tài)

取菌劑培養(yǎng)3月后的板栗新鮮菌根根尖20個，固定于FAA酒精醋酸福爾馬林混合固定液中，制成菌根石蠟切片，用番紅和固綠2種染料復(fù)染。用MOTIC SMZ-140解剖鏡和顯微鏡，觀察點柄黏蓋牛肝菌與板栗形成菌根的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并測量拍照。

1.2.3 驗證菌根來源

為證實所觀察菌根是否由點柄黏蓋牛肝菌與板栗所形成，提取菌根共生體的DNA，采用分子手段驗證試驗結(jié)果。

1） DNA提取

采用CTAB法，提取總DNA。選取約100 mg新鮮菌根，用75%的乙醇浸泡消毒3 min，后用1%的升汞浸泡60 s。用無菌濾紙吸干，置于干冷研缽中，加入液氮和石英砂，快速研磨，至粉末狀，加入65℃預(yù)熱好的4×CTAB 700 μL，充分混勻，在65℃水浴鍋中培養(yǎng)30 min～60 min，間隔15 min搖晃1次；再加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比為24∶1），充分混勻后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。如上清液較渾濁，再次加入氯仿-異戊醇洗滌，至上清液清澈。加入等體積的異丙醇，室溫沉淀10 min，最大速度離心10 min，倒上清，用70%乙醇洗滌 3 次，37℃烘箱烘干 5 min，后加入 40 μL～60 μL TE緩沖溶液，可即溶。-20℃中保存，待用。

2） PCR擴(kuò)增與檢測

PCR 擴(kuò)增采用 25 μL 體系，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，ddH2O 17 μL，DNA 模板 1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在 eppendorf PCR儀中進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)程序熱循環(huán)參數(shù)為94℃變性 85 s。1～13循環(huán) 95℃變性 35 s，55℃退火55 s，72℃延伸 45 s；14～26 循環(huán) 95℃變性 35 s，55℃退火 55 s，72℃延伸 120 s；27～35循環(huán) 95℃變性35 s，55℃退火55 s，72℃延伸180 s；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10 min，一共進(jìn)行35個循環(huán)。PCR所 用 引物 為 ITS1-F（5’-CTTGGTCATTTTAGAGAAGGTAA-3’）、ITS4-B （5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’），所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[13]，后移送上海生工生物有限公司進(jìn)行序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根形態(tài)特征

菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)特征見圖1。

圖1 菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)Fag.1 The morphological structure of Castanea mollissima ectomycorrhiza

由圖1所示，板栗根系接種點柄黏蓋牛肝菌菌劑3個月后形成菌根，通過顯微鏡對形成菌根進(jìn)行宏觀形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，新鮮菌根頂部與基部顏色較深，呈暗黃褐色，其余部分顏色大多呈淡黃色。菌根形態(tài)呈棒狀、羽狀和珊瑚狀，具0～1級次生分枝，主要為單軸、二叉分支。菌根頂端多膨大粗壯，基部無明顯變大現(xiàn)象，末級分枝頂端頓圓，整體有彎曲狀、棍棒狀，圓柱狀等多種形態(tài)。菌根最長可達(dá)18.5 μm，直徑19.23 μm；菌根表面不光滑，外延菌絲明顯且豐富，纖細(xì)直線形，呈絨毛狀，亮白色，菌套明顯，細(xì)胞略透明；未見菌索與菌核。菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)測量結(jié)果見表1，其菌根橫切面見圖2。

表1 板栗-點柄黏蓋牛肝菌菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)測量值Tab.1 Characteristics of ectomycorrhiza of Suillus granulatus and Castanea mollissima

圖2 板栗菌根橫切面Fig.2 Horizontal section of Castanea mollissima ectomycorrhiza

如圖2所示，菌根橫切面根部細(xì)胞外圍有致密的菌絲層包被，菌套層較厚，排列緊密，菌套橫截面厚0.45 μm～1.00 μm，并向內(nèi)在細(xì)胞間隙中延伸，明顯形成哈蒂氏網(wǎng)。

2.2 分子驗證結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。圖3中M為中科瑞泰生物有限公司提供的D2000 DNA Ladder已知核酸標(biāo)記物，1為板栗葉片樣本，2為點柄黏蓋牛肝菌菌絲體，3為板栗菌根共生體。

由圖3可知，2和3的DNA片段大小為750 bp～1 000 bp，且此產(chǎn)物經(jīng)測序后，與NCBI序列號為HQ 439177.1的點柄乳牛肝菌（S.granulatus） 的相似比為99%。由此得出，該板栗菌根確實是由點柄黏蓋牛肝菌與板栗共生形成。

圖3 PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Intensities of the amplified DNA in the ITS region from Castanea mollissima ectomycorrhiza

3 討論

對于人工合成點柄黏蓋牛肝菌菌根的研究較少，2005年Kataoka等[14]研究了地中海白松與點柄黏蓋牛肝菌菌根的合成，但選用了熒光假單胞桿菌輔助。關(guān)于合成板栗菌根的研究，國內(nèi)外以塊菌屬（Tuber）居多，尚未有關(guān)于點柄黏蓋牛肝菌的報道。在人工合成菌根結(jié)果中，點柄黏蓋牛肝菌與印度塊菌相比，菌根纖弱，顏色深暗，尤其是有許多羽狀及珊瑚狀分枝，未見塔狀分枝。產(chǎn)生此差異的原因可能與接菌劑類型相關(guān)，塊菌屬、牛肝菌屬與闊葉樹木形成的菌根形態(tài)有所差異。本次試驗對人工合成板栗與點柄黏蓋牛肝菌外生菌根形態(tài)做了初步的描述與鑒定，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)；接種菌劑的計量、形態(tài)、合成培養(yǎng)時間等還待進(jìn)一步研究與探討。