基于新型冠狀病毒SARS-CoV-2主蛋白酶結(jié)構(gòu)的小分子抑制劑虛擬篩選

徐浩 薛瑞 李娟 李波 陳舟 樸蓮花 常珊 孔韌

摘? ? 要：通過(guò)使用分子對(duì)接與虛擬篩選技術(shù)，以SARS-CoV-2主蛋白酶（Main Protease，Mpro）為靶點(diǎn)，利用Autodock Vina軟件和Python腳本進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合小分子的對(duì)接評(píng)分與結(jié)合模式分析，篩選出特異性作用于主蛋白酶的小分子抑制劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以SARS-CoV-2主蛋白酶原配體N3為對(duì)照，Reactive blue 2等分子具有更好的對(duì)接打分與合理的結(jié)合模式，或可成為潛在的主蛋白酶小分子抑制劑，可為尋找抗新冠病毒治療藥物提供線索。

關(guān)鍵詞：分子對(duì)接;COVID-19;虛擬篩選;主蛋白酶;小分子抑制劑

中圖分類號(hào)：R914? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-7394（2021）02-0065-07

2019年12月，我國(guó)武漢市出現(xiàn)了一種傳染性極強(qiáng)的疾病[1]，其病原體被發(fā)現(xiàn)是一種新的冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織將這種新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“COVID-19”。由于引發(fā)該肺炎的冠狀病毒與引發(fā)SARS的冠狀病毒具有高度親緣性[2]，因此該病毒被命名為“SARS-CoV-2”。2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization）宣布該事件為國(guó)際公共衛(wèi)生事件，并于3月11日?qǐng)?bào)告該疫情為全球性大流行。這是由冠狀病毒導(dǎo)致的首次全球疫情大流行。截至2020年10月20日，全球累計(jì)確診病例已超4 000萬(wàn)。由于SARS-CoV-2是一種先前未在人類群體中發(fā)現(xiàn)的β屬新型冠狀病毒，因此目前沒(méi)有特效治療藥物[3]。隨著感染人數(shù)的逐漸上升，防控和救治已經(jīng)成為全球性難題。作為一種β冠狀病毒，SARS-CoV-2的遺傳物質(zhì)是單股正鏈RNA，控制冠狀病毒復(fù)制的主蛋白酶Mpro在病毒生命周期中有重要作用，Mpro與小核糖核酸病毒3C蛋白酶具有相似的切割位點(diǎn)特異性，這一酶通常被稱作3CL蛋白酶[4]。Mpro及其同源酶在病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起到重要作用，因而Mpro受到研究者們的關(guān)注[5-7]，該蛋白酶可成為抗新冠病毒藥物的重要靶標(biāo)。

相較2003年的SARS-CoV病毒疫情，COVID-19波及范圍廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，雖然目前疫情已經(jīng)得到了較好的控制，但特異性治療藥物缺乏仍是一大問(wèn)題。因此，尋找新冠病毒主蛋白酶的抑制劑對(duì)于抑制此次疫情具有重要的意義[8-9]。本文運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)Mpro主蛋白酶與小分子的結(jié)合進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬。對(duì)于篩選得到的分子，分析其結(jié)合模式，與晶體結(jié)構(gòu)做對(duì)比，篩選出具有較為合理結(jié)合模式的潛在抑制劑分子，為尋找可能的抗新冠病毒藥物提供線索。

1? ?方法與材料

1.1? 復(fù)原對(duì)接

分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)采用AutoDock Vina[10-11]進(jìn)行，該程序采用了拉馬克遺傳算法，結(jié)合基于網(wǎng)格的能量估計(jì)。為了檢驗(yàn)對(duì)接實(shí)驗(yàn)參數(shù)的可行性，對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了復(fù)原對(duì)接。從RCSB PDB庫(kù)中下載PDBID為6LU7的SAR-CoV-2主蛋白酶與抑制劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率為2.16 ?。將受體蛋白作加氫處理，配體選擇可旋轉(zhuǎn)柔性鍵，使用標(biāo)準(zhǔn)化的流程得到pdbqt文件。以晶體結(jié)構(gòu)中配體的中心位置為對(duì)接實(shí)驗(yàn)中盒子的中心坐標(biāo)（center_x = -10.85，center_y = 2.58，center_z = 68.72），定義盒子大小為30×30×30 ?，使其包圍整個(gè)活性口袋區(qū)域。對(duì)小分子配體進(jìn)行加氫處理，并賦予Gasteiger電荷。設(shè)置Exhaustiveness參數(shù)為12，并定義輸出打分最佳的十個(gè)構(gòu)像。采用PyMOL和LigPlot進(jìn)行結(jié)合模式分析[12-13]。

1.2? 小分子數(shù)據(jù)庫(kù)建立與配體準(zhǔn)備

篩選所需要的配體來(lái)源于LOPAC?1280-藥理學(xué)活性化合物文庫(kù)，合集包括1 280種小分子化合物，其中大部分為已上市的藥物分子。下載所有小分子文件，采用Openbabel[14]生成小分子的三維坐標(biāo)。采用AutoDock添加部分電荷信息轉(zhuǎn)換文件格式，得到pdbqt格式的配體文件（批量處理利用python腳本完成）。

1.3? 虛擬篩選

復(fù)原對(duì)接的結(jié)果顯示原配體成功對(duì)接到靶蛋白的活性中心，表明對(duì)接參數(shù)設(shè)置合理。將靶蛋白與原配體的對(duì)接結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照，用python腳本SailVina調(diào)用Autodock Vina對(duì)小分子化合物庫(kù)進(jìn)行批量處理，通過(guò)AutoDock Vina得到每一個(gè)小分子對(duì)應(yīng)的對(duì)接打分情況。本研究篩選出小分子庫(kù)中打分排名前十位的化合物，并對(duì)它們與受體的相互作用及結(jié)合模式進(jìn)行分析，尋找效果最佳的可能的小分子抑制劑。

2? ? 結(jié)果與討論

2.1? 復(fù)原對(duì)接結(jié)果分析

6LU7結(jié)構(gòu)由SAR-CoV-2 Mpro與對(duì)應(yīng)的N3抑制劑結(jié)合形成，并且表現(xiàn)出配體與活性點(diǎn)位殘基的多個(gè)分子間相互作用。由文獻(xiàn)[15]可知，在6LU7對(duì)應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)中，主蛋白酶由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N3通過(guò)與主蛋白酶底物結(jié)合裂縫中殘基的多種相互作用而穩(wěn)定下來(lái)。其中，Cys145殘基上的S與乙烯基的C發(fā)生邁克爾加成形成共價(jià)鍵，鍵長(zhǎng)1.80 ?，在抑制蛋白活性中起到關(guān)鍵性作用。His163、Gly143、Glu166、Phe140等與N3分子形成多個(gè)氫鍵相互作用。N3分子上的Leu嵌入His41、Met49、Met165、Tyr54形成疏水分子口袋，而Ala則被Met165、Leu167的側(cè)鏈包圍，發(fā)生疏水相互作用。

使用6LU7晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行復(fù)原分子對(duì)接，得到的最佳打分結(jié)果為-8.40 kcal/mol。在PyMOL中觀察復(fù)原對(duì)接的結(jié)合模式，并分別計(jì)算出不同構(gòu)像與原配體間的RMSD[16]。二號(hào)構(gòu)像與原配體最相似，且算得RMSD值為1.99 ?（<2 ?）（見(jiàn)圖1），說(shuō)明復(fù)原對(duì)接效果良好。上述結(jié)果表明，對(duì)接參數(shù)設(shè)置較為合理，復(fù)原對(duì)接獲得成功。

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責(zé)任編輯? ? 王繼國(guó)