不同培養(yǎng)和貯藏條件對‘鳳丹白’牡丹花粉萌發(fā)的影響

張 慶，陳一凡，趙鵬飛，宋子怡，張鈺鈺，張 芹

(河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，河北 保定，071000)

‘鳳丹白’是楊山牡丹(Paeoniaostii)較為常見的栽培品種，它主要的觀賞價值在于花色純白、花頭直立，然而由于其花色較單調(diào)較少在園林觀賞中應用，而多注重其藥用價值[1]?！P丹白’是目前油用牡丹的主要品種，其結籽量大、出油率高、生長勢強[2]，具有很好的適應性[3]，其籽油中含豐富的不飽和脂肪酸等，具有較高的營養(yǎng)價值[4]。花粉早期采集、貯藏、生活力的測定是進行人工輔助授粉或雜交授粉的基礎[5]。本試驗采用離體萌發(fā)測定法，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)‘鳳丹白’花粉，而后在光學顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)狀況[6]。根據(jù)蔡祖國等[7]的方法，進行適當調(diào)整后，再根據(jù)秦瑤等[1]的研究結果，將花粉離體培養(yǎng)8 h，對比不同質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸組合溶液與花粉萌發(fā)的關系，進一步篩選得到最佳培養(yǎng)基后，進行相關的花粉萌發(fā)試驗，探究最佳的貯藏條件，進一步了解‘鳳丹白’牡丹花粉的生活力，為‘鳳丹白’牡丹的育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年4月中下旬進行，材料采自河北農(nóng)業(yè)大學試驗苗圃內(nèi)‘鳳丹白’牡丹。開花期早 8:00～9:00采集花粉，在無風天氣下，用鑷子輕采花藥，放在制版轉印紙紙袋中帶回實驗室。將采集下來的花藥放在硫酸紙上，室溫下自然陰干24 h，待花藥開裂、花粉自然散出后去除雜質(zhì)收集，將收集好的花粉放在5 mL離心管中密封，4 ℃條件下貯藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1不同質(zhì)量濃度蔗糖下花粉萌發(fā)情況將花粉用不同質(zhì)量濃度的蔗糖(30，50，80，100，150 g·L-1)溶液培養(yǎng)8 h，觀察萌發(fā)情況，每個處理3次重復，每個重復隨機取3個視野進行觀察，每個視野統(tǒng)計花粉100粒以上，記錄數(shù)據(jù)，以清水為空白對照，統(tǒng)計萌發(fā)率，萌發(fā)標準為花粉管的長度≥花粉粒直徑的2倍，下同。

萌發(fā)率=(萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉總數(shù))×100%

1.2.2不同質(zhì)量濃度硼酸下花粉萌發(fā)情況將花粉用不同質(zhì)量濃度的硼酸(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1)溶液培養(yǎng)8 h，觀察萌發(fā)情況。

1.2.3不同質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸組合溶液對花粉萌發(fā)的影響根據(jù)律春艷等[8]和蔡祖國等[7]研究所選的培養(yǎng)基質(zhì)量濃度作為參考，進行適當調(diào)整。采用液體培養(yǎng)法，用添加不同質(zhì)量濃度的硼酸(0.04，0.06，0.08 g·L-1)和蔗糖(60，80，100，120 g·L-1)的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，觀察花粉萌發(fā)情況。

1.2.4不同培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)的影響篩選出最佳培養(yǎng)基后，在(25±1)℃恒溫箱中培養(yǎng)花粉，每隔1 h觀察1次萌發(fā)情況，連續(xù)觀察12 h，以確定花粉離體培養(yǎng)的最佳時間。

1.2.5不同溫度貯藏條件下干花粉萌發(fā)率的變化趨勢將收集備用的‘鳳丹白’花粉分別在30，25，4，-18，-80 ℃條件下貯藏0，1，3，5，7，9，12 d后，取出，用最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h后，觀察花粉萌發(fā)情況。

1.2.6濕花粉在25，30 ℃條件下萌發(fā)率的變化趨勢 將剛采下的新鮮狀態(tài)下的‘鳳丹白’花朵直接帶回實驗室，用鑷子摘下花藥，分別在25，30 ℃條件下貯藏0，1，2，3，5，7 h，觀察花粉活力變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010和SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及做圖。

2 結果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度蔗糖下花粉萌發(fā)情況

隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(圖1)，在清水對照中花粉萌發(fā)率僅為6.04%，當蔗糖質(zhì)量濃度在0～100 g·L-1時，花粉萌發(fā)率隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷提高，在蔗糖質(zhì)量濃度為100 g·L-1時萌發(fā)率達到最大值(51.69%)，比對照提高了45.65個百分點，極顯著高于對照及其他處理。

2.2 不同質(zhì)量濃度硼酸下花粉萌發(fā)情況

隨著硼酸質(zhì)量濃度的提高，花粉萌發(fā)率先升后降(圖2)。當硼酸質(zhì)量濃度在0～0.06 g·L-1時，花粉萌發(fā)率隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷提高，當硼酸質(zhì)量濃度為0.06 g·L-1時萌發(fā)率達到峰值(36.71%)，比對照提高了30.99個百分點，極顯著高于對照及其他處理。質(zhì)量濃度為0.04，0.08 g·L-1的處理之間差異不顯著。當硼酸質(zhì)量濃度在0.06～0.10 g·L-1時，花粉萌發(fā)率隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷下降，在質(zhì)量濃度為0.10 g·L-1時花粉萌發(fā)率僅有13.67%。

圖1 不同蔗糖質(zhì)量濃度下花粉萌發(fā)情況 圖2 不同硼酸質(zhì)量濃度下花粉萌發(fā)情況

2.3 不同質(zhì)量濃度的硼酸和蔗糖組合溶液對花粉萌發(fā)的影響

將花粉置于不同質(zhì)量濃度組合的液體培養(yǎng)基進行離體萌發(fā)培養(yǎng)，不同質(zhì)量濃度的硼酸和蔗糖對花粉萌發(fā)率有顯著影響(表1)。用0.04 g·L-1硼酸+60 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，萌發(fā)率只有40.42%。在硼酸質(zhì)量濃度為0.06 g·L-1及蔗糖質(zhì)量濃度為100 g·L-1時，花粉萌發(fā)率達到最高值，為63.22%，是最適的花粉離體培養(yǎng)質(zhì)量濃度。而繼續(xù)加大硼酸和蔗糖的質(zhì)量濃度，促進作用減弱，花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)下降趨勢，當硼酸質(zhì)量濃度為0.08 g·L-1及蔗糖質(zhì)量濃度為120 g·L-1時，花粉萌發(fā)率降低到40.40%。當硼酸質(zhì)量濃度固定不變時，加入蔗糖，花粉萌發(fā)率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢；當蔗糖質(zhì)量濃度固定不變時，加入硼酸，花粉萌發(fā)率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。本試驗結果表明：0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖是花粉離體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，對花粉萌發(fā)有著明顯的促進作用，花粉萌發(fā)率為63.22%。

表1 不同濃度的硼酸和蔗糖組合溶液對花粉萌發(fā)的影響

圖3 不同培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)的影響

2.4 不同培養(yǎng)時間對花粉萌發(fā)的影響

在0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖，溫度為(25±1)℃條件下，離體培養(yǎng)1 h萌發(fā)率較低，在花粉培養(yǎng) 1 h后花粉管長度達到標準，萌發(fā)率有所增加，約在2 h左右花粉萌發(fā)達到第1個小高峰，萌發(fā)率由0增長到12.57%；在2～4 h萌發(fā)率基本保持不變，大約在15.88%；在4～6 h花粉萌發(fā)進入第1個快速增長階段，在6 h的時候花粉萌發(fā)率由15.88%增長到41.94%，在6～8 h花粉進入第2個快速萌發(fā)階段，并在8 h時達到第2個高峰，此時花粉萌發(fā)率高達62.86%；在8～12 h時萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，基本保持在63%，觀察到花粉已基本完全萌發(fā)，所以花粉離體培養(yǎng)最適的鏡檢和統(tǒng)計時間為8 h(圖3)。

2.5 不同貯藏條件下干花粉萌發(fā)率的變化趨勢

在30，25，4，-18 ℃貯藏條件下，隨著貯藏時間的不斷延長，花粉內(nèi)有機物質(zhì)的不斷消耗，花粉的萌發(fā)率呈現(xiàn)下降的趨勢，但各貯藏條件下花粉萌發(fā)率的下降速度不一樣，在30 ℃貯藏條件下下降最快，花粉萌發(fā)率在前3 d下降的最快，由62.59%下降至28.66%，在第12 d時已經(jīng)下降為0；25 ℃條件下次之，花粉萌發(fā)率在前3 d保持在50%以上，7 d時為40.82%，此時花粉仍具有較高的活力，在第12 d時為29.87%，與新鮮狀態(tài)下的花粉萌發(fā)率相比下降了32.72個百分點；4 ℃條件下下降速度減緩，花粉萌發(fā)率在第12 d時為59.70%，與新鮮狀態(tài)下的花粉萌發(fā)率相比下降了2.89個百分點；-18 ℃條件下花粉萌發(fā)率的變化不太明顯，第12 d的萌發(fā)率與新鮮狀態(tài)下的花粉萌發(fā)率相比僅下降了1.70個百分點。而在-80 ℃條件下花粉萌發(fā)率保持穩(wěn)定不變，第12 d與第1 d花粉的萌發(fā)率無顯著差異(表2)。

表2 不同貯藏條件下的花粉萌發(fā)率 %

圖4 濕花粉在25，30 ℃條件下的萌發(fā)率

2.6 濕花粉在25，30 ℃條件下萌發(fā)率變化的趨勢

濕花粉在25，30 ℃條件下會隨著時間的推移花粉萌發(fā)率不斷下降，在30 ℃條件下7 h內(nèi)由60.45%下降到50.58%，下降了9.87個百分點，在25 ℃條件下7 h內(nèi)由60.45%下降到54.95%，下降了5.5個百分點(圖4)。

3 結論與討論

本次研究試驗了不同培養(yǎng)和貯藏條件對‘鳳丹白’牡丹花粉萌發(fā)的影響，用離體萌發(fā)的方式檢驗花粉活力。結果表明：(1)‘鳳丹白’牡丹花粉的萌發(fā)率，隨著培養(yǎng)液中蔗糖和硼酸質(zhì)量濃度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖為最佳的培養(yǎng)基，離體培養(yǎng)8 h，花粉萌發(fā)率為63.22%。(2)‘鳳丹白’牡丹花粉生活力在低溫和超低溫條件下能夠長時間的保持，因此，低溫條件可作為長期保存花粉的手段。(3)濕花粉含水量高，在高溫條件下較干花粉更易失活，因此在保存花粉時，最好對花粉進行干燥處理，緩慢去除水分，如置于室內(nèi)自然陰干或利用干燥劑去除花粉內(nèi)多余的水分，并在低溫條件下貯藏，以保持較高的花粉生活力?；ǚ勖劝l(fā)率會因環(huán)境條件的改變而發(fā)生變化，在液體培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的蔗糖和硼酸可以提高花粉萌發(fā)率。蔗糖一方面為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面能夠平衡花粉與培養(yǎng)液之間的滲透勢。適宜的蔗糖質(zhì)量濃度對花粉萌發(fā)生長和花粉管伸長起著促進作用，質(zhì)量濃度過低，花粉壁會破裂，內(nèi)容物散出；質(zhì)量濃度過高，則會造成花粉質(zhì)壁分離，抑制花粉萌發(fā)生長[9]。適宜的硼酸質(zhì)量濃度對花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長有一定的促進作用[10]。崔曉龍等[11]認為，硼與糖結合后能極大地提高花粉萌發(fā)率。楊曉冬等[12]認為，硼離子能夠促進糖在植物組織中的運輸和代謝，而且硼離子對促進花粉管壁的形成也有一定的作用。董兆磊等[13]認為，在牡丹花粉萌發(fā)過程中硼酸起著顯著的促進作用，但當蔗糖質(zhì)量濃度過低不能滿足花粉萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)需求時，硼酸對促進牡丹花粉萌發(fā)作用不顯著，在蔗糖質(zhì)量濃度偏高的情況下，加入硼酸會在一定程度上抑制花粉的萌發(fā)，硼酸質(zhì)量濃度過高或不加硼酸會導致花粉萌發(fā)率低，萌發(fā)速度慢，花粉管長度短以及花粉管形狀不規(guī)則等一系列非正常狀態(tài)。當離體培養(yǎng)時間較短時，花粉未完全萌發(fā)，此時的萌發(fā)率與真實萌發(fā)率相比較低。當離體培養(yǎng)時間較長時，花粉雖已完全萌發(fā)，花粉萌發(fā)率接近真實萌發(fā)率，但此時由于花粉管長度過長影響了觀察效果，反而會增加統(tǒng)計難度，同樣不適合作為最佳觀察時間。因此，離體培養(yǎng)8 h就可以鏡檢觀察花粉萌發(fā)情況，這與秦瑤等[1]的研究結果一致。此時的花粉生活力接近自然條件下的生活力，能夠為雜交育種提供理論依據(jù)。在-80 ℃貯藏條件下，花粉萌發(fā)率在12 d中基本保持不變，主要是因為花粉在超低溫貯藏條件下，花粉呼吸減弱，消耗的營養(yǎng)物質(zhì)較少，能夠保持較高的生活力[14]，李澤迪[15]的研究結果表明：超低溫保存技術是花粉進行長期保存的有效方式?；ǚ凵盍ο陆底羁焓窃?0 ℃條件下，施江等[16]認為，溫度過高會導致花粉脫水死亡，同時高溫度增強了花粉內(nèi)部呼吸強度，從而消耗過多的營養(yǎng)物質(zhì)，最終導致花粉生活力快速下降，不適合貯藏。比較這5種貯藏條件可以看出：花粉生活力都呈下降趨勢，原因可能是花粉在貯藏的過程中，隨著時間的延長花粉細胞內(nèi)物質(zhì)消耗過多，酶活性下降，水分嚴重缺乏。同時，花粉含水量的高低也會直接影響到花粉的活力，含水量高的花粉呼吸作用旺盛，細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)會被很快消耗，花粉生活力快速下降，而含水量適宜的花粉代謝緩慢，減少了營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，并能在這種條件下長期保持生活力。在花粉貯藏過程中溫度和濕度是影響花粉生活力的2個重要的環(huán)境因素，想要使花粉長期保持生活力需對花粉進行低溫和干燥處理?；ǚ墼诘蜏鼗蛘叱蜏貤l件下貯藏時，低溫條件會影響花粉內(nèi)部的呼吸作用和代謝過程從而導致花粉內(nèi)酶的活性隨著貯藏時間的推移而發(fā)生相應的生理生化反應[17，18]，各種代謝過程減慢，從而延長了花粉的貯藏壽命。當溫度過高或過低時，對花粉生活力都會產(chǎn)生不利的影響[17]。