食品中諾如病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

廖小艷 陳麗麗 白亞龍

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403；2. 南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)系，湖南 衡陽 421000；3. 上?？屏⑻剞r(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201403)

諾如病毒(Norovirus，NoV)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，基因組長度約為7.4～7.7 kb，為無包膜單股正鏈RNA病毒，能廣泛地感染人、豬、鼠、牛等多種哺乳動物，是主要的食源性致病原，可引起以嘔吐、腹瀉為主的急性胃腸炎[1-3]。NoV包含3個開放閱讀框(Open Reading Frames，ORFs)，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白、衣殼蛋白(Virus particle 1，VP1)、微小結(jié)構(gòu)蛋白。VP1由殼區(qū)(Shell domain，S區(qū))和突出區(qū)(Protruding domain，P區(qū))組成，P區(qū)又包含P1和P2亞區(qū)，P2亞區(qū)含有主要的中和表位，呈高度易變性[4-5]。NoV的基因型和基因組之間存在很大的抗原差異性，根據(jù)衣殼蛋白區(qū)和RNA多聚酶區(qū)核酸序列，可將NoV分為10個基因組(Genogroup，GⅠ～GⅩ)，其中GⅡ型是引起人體急性胃腸炎最主要的基因群，約有85%的NoV感染由GⅡ型導(dǎo)致[6]。NoV在世界范圍內(nèi)均有流行，具有季節(jié)性高發(fā)、全人群普遍易感、高度變異、感染性強(qiáng)等特點(diǎn)。在中國，約有15%腹瀉兒童的血清抗體中檢出了諾如病毒，自2014年以來，諾如病毒造成的公共衛(wèi)生事件顯著增加，極大地加重了疾病負(fù)擔(dān)[7]。

NoV主要經(jīng)糞—口途徑傳播，污染的食品(如貝類等水產(chǎn)品、藍(lán)莓、生菜等果蔬)是常見的傳播媒介。食品中NoV含量低，且基質(zhì)復(fù)雜，富含各種PCR抑制物，導(dǎo)致NoV難以富集檢出。目前，病毒富集純化仍是NoV檢測的關(guān)鍵點(diǎn)及難點(diǎn)，在尚無特效藥物及疫苗的情況下，開發(fā)高效準(zhǔn)確的檢測方法對防止疾病傳播十分必要。文章擬闡述諾如病毒前處理環(huán)節(jié)及檢測的最新研究成果，囊括富集技術(shù)、核酸檢測、免疫學(xué)檢測，以及生物傳感器等。

1 諾如病毒的富集

食品中NoV含量低，且基質(zhì)復(fù)雜，富含各種PCR抑制物，病毒富集純化一直是NoV檢測的瓶頸。有機(jī)絮凝沉淀法、膜過濾法、超濾濃縮等技術(shù)是目前NoV富集的主要方法，但這些富集方法是非特異性的，需要不斷優(yōu)化濃縮條件，且各類分子檢測抑制物會隨NoV的富集而富集[8]。近年來，免疫(抗原—抗體)結(jié)合、病毒—受體結(jié)合、核酸適配體等特異性的NoV富集手段成為研究熱點(diǎn)。

1.1 基于抗原抗體反應(yīng)的富集技術(shù)

免疫磁珠是一種基于抗原抗體反應(yīng)的特異性病毒富集方法，借助磁珠偶聯(lián)的方式，利用針對特征性NoV的單克隆抗體或多克隆抗體來捕獲病毒顆粒，可從復(fù)雜的基質(zhì)中高效分離和濃縮NoV[9]。Park等[10]通過將克隆表達(dá)出的GI-1型和GII-4型NoV的衣殼蛋白對兔進(jìn)行免疫，制備了針對特定基因型NoV衣殼蛋白的多克隆抗體，并將該多克隆抗體與磁珠偶聯(lián)獲得了相應(yīng)的免疫磁珠。利用上述制備的免疫磁珠聯(lián)合RT-PCR法對人工染毒草莓中GI-1型和GII-4型NoV進(jìn)行檢測，其回收率分別為29.50%，14.14%，檢出限低至3～7個RT-PCR單位。Lee等[11]利用免疫磁珠分離(磁珠上偶聯(lián)兔抗人NoV多克隆抗體)和量子點(diǎn)分析技術(shù)建立了一種檢測新鮮生菜中諾如病毒的方法。該試驗(yàn)比較了免疫磁珠分離和聚乙二醇病毒沉淀兩種方法的富集效率，兩種方法均從人工染毒的NoV生菜樣品中產(chǎn)生了可檢測到的擴(kuò)增片段(213 bp)，但免疫磁珠法以10 min的孵育促進(jìn)病毒沉淀，而聚乙二醇沉淀法需要更長的孵育時間(3 h)和額外的高速離心來沉淀病毒。

雖然免疫磁珠法可高效特異性富集NoV，但NoV抗原的高度變異性使其無法富集所有的NoV，往往需要與多種抗體或多價抗體偶聯(lián)以提高免疫磁珠法的適用范圍及性能[12]。

1.2 基于病毒—受體結(jié)合的富集技術(shù)

組織血型抗原(Histo-blood group antigens，HBGA)是一類分布于外周組織，可與人源NoV結(jié)合的受體，主要包括ABO、 Lewis和“分泌型”系統(tǒng)3種[13]。豬胃黏蛋白(Porcine gastric mucin-conjugate，PGM)被證明含多種HBGA(A型、H1型和Lewis抗原)，可與NoV廣譜結(jié)合[14]。Tian等[15]采用PGM偶聯(lián)磁珠以濃縮人工染毒食品樣本(牡蠣、草莓、樹莓和生菜)中NoV，該方法不僅提高了靈敏度，還可有效去除RT-PCR抑制劑。Wang等[16]通過將PGM包被在PCR反應(yīng)容器上以捕獲分離病毒，并評估了熱和氯處理對NoV滅活的影響。此外，Suresh等[17]比較了ISO/TS 15216-1:2017方法與豬胃黏蛋白包被磁珠法(Porcine gastric mucin coated magnetic beads，PGM-MB)的病毒提取效率，并結(jié)合熱變性提取RNA，用于檢測人工染毒的新鮮海藻、羅勒、薄荷和菠菜中的人源NoV。數(shù)據(jù)表明，與ISO/TS 15216-1:2017相比，PGM-MB不僅能顯著縮短檢測時間，回收率也明顯升高，PGM-MB法從1∶10稀釋倍數(shù)的海藻中提取RNA的回收率高達(dá)(52.3±12.9)%。

HBGA可與絕大部分的人源諾如病毒結(jié)合，并且可以去除非致病性病毒顆粒的干擾，在NoV前處理中具有廣泛的應(yīng)用前景，但HBGA特異性較低，與其他病毒(如輪狀病毒)之間也存在結(jié)合[18-19]。

1.3 基于適配體的富集技術(shù)

核酸適配體是一段可特異性識別并捕獲目標(biāo)分子的核酸片段，為NoV富集提供了很好的思路[12]。與抗體相比，適配體具有成本較低、易于化學(xué)合成和修飾、不引起免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。此外，通過核酸適配體對NoV顆粒進(jìn)行特異性捕獲，可采用簡單的洗滌去除分子檢測抑制物及樣品基質(zhì)，提高檢測的靈敏度，避免假陽性、假陰性結(jié)果的產(chǎn)生[20]。Escudero-Abarca等[21]利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出4種能與GⅡ 2型人源諾如病毒廣泛反應(yīng)的ssDNA核酸適配體，分別命名為適配體19、21、25和26，其中適配體25與病毒樣顆粒的結(jié)合親和力在1～5 mg/mL范圍內(nèi)與市售抗體相當(dāng)。當(dāng)使用適配體25標(biāo)記的磁珠結(jié)合RT-qPCR對人工污染的生菜中的NoV進(jìn)行回收和檢測時，結(jié)果顯示，該方法檢測下限為10個RNA拷貝數(shù)/3 g生菜，捕獲率為2.5%～36.0%。

雖然適配體能特異性捕獲NoV顆粒，但目前缺乏能夠與所有NoV基因型廣泛結(jié)合的適配體，開發(fā)能與更多NoV基因型結(jié)合的適配體是解決問題的關(guān)鍵[12]。且與抗體、HBGA受體等相比，利用適配體對NoV進(jìn)行特異性捕獲的研究也要少得多，研究者可進(jìn)行相關(guān)研究，拓展這方面的應(yīng)用。

2 核酸檢測

目前NoV檢測方法主要有電鏡法、免疫學(xué)檢測和核酸分子檢測技術(shù)等。常規(guī)電鏡觀察法具有靈敏度較低、對操作人員技術(shù)要求高、檢測費(fèi)用高等缺點(diǎn)，極大地限制了其應(yīng)用，現(xiàn)已逐漸淘汰，不再作為主流的檢測手段。NoV是生命物質(zhì)，隨著分子生物學(xué)的長足發(fā)展，基于核酸的檢測得到了廣泛的研究與應(yīng)用。基于核酸分子的NoV檢測方法主要有常規(guī)RT-PCR、巢式PCR、多重PCR、RT-qPCR，以及新興的數(shù)字PCR和二代測序技術(shù)。由于常規(guī)RT-PCR、巢式PCR、多重PCR等存在一些缺陷，逐漸被其他的方法所替代，在此主要對NoV檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”RT-qPCR及新興的PCR技術(shù)展開綜述。

2.1 RT-qPCR

RT-qPCR允許在單一反應(yīng)中進(jìn)行信號放大和擴(kuò)增確認(rèn)，通過實(shí)時監(jiān)測熒光信號的增強(qiáng)達(dá)到定量的目的，具有靈敏度較高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前NoV檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[22]。Rupprom等[23]對基于TaqMan探針，用于定量檢測GI和GII型NoV的RT-qPCR檢測法進(jìn)行了評估。該方法對GII DNA標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度達(dá)103DNA拷貝數(shù)/mL，且未與其他常見腸道病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有良好的分析靈敏度。此外，Brassard等[24]采用RT-qPCR對田間灌溉草莓進(jìn)行了NoV檢測，并評估其污染來源。該研究采用超濾濃縮的前處理方法，結(jié)果顯示GI型NoV 檢測范圍為3.0×103～5.0×101particles/g，這與其他新鮮產(chǎn)品(葉綠色和漿果)的研究一致。莫雪梅等[25]根據(jù)GII型NoV保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了一種基于SYBR Green I染料的RT-qPCR方法，并用于貝類中NoV檢測。該方法檢測范圍為102～106拷貝，對甲肝病毒、輪狀病毒、星狀病毒等無交叉反應(yīng)，靈敏度、特異性較好。

RT-qPCR是目前NoV檢測的常規(guī)方法，靈敏度較高、特異性強(qiáng)，但RT-qPCR無法區(qū)分致病性和非致病性諾如病毒顆粒，且食品樣品基質(zhì)中存在的一些分子檢測抑制劑也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。所以，有一些研究會通過與其他技術(shù)結(jié)合消除此類問題，比如先用PGM對有活性的病毒粒子進(jìn)行分離，然后進(jìn)行RT-qPCR[15]。

2.2 數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)對樣品進(jìn)行微滴化處理，含有待測靶核酸分子的微滴產(chǎn)生熒光信號，判讀為1，否則為0，根據(jù)陽性微滴的比例及泊松分布原理實(shí)現(xiàn)目標(biāo)待測物的檢測。ddPCR克服了實(shí)時PCR需要依賴外部標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值的局限性，逐漸成為一種替代的RT-qPCR的分析方法。作為一種第三代PCR技術(shù)，ddPCR具有靈敏度更高、不受基質(zhì)抑制的優(yōu)勢，是精準(zhǔn)檢測含有大量PCR抑制劑的食品和環(huán)境樣品中低水平NoV的理想方法[26-27]。陳嘉茵等[28]利用RT-ddPCR技術(shù)對不同濃度人工染毒生菜樣品中的GII型NoV進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，RT-ddPCR檢測范圍為2.12～8.47×104拷貝/μL，其擴(kuò)增效率為95.44%。在回收率檢測試驗(yàn)中，抑制劑對結(jié)果無顯著性差異。該方法可避免抑制劑造成的“假陰性”結(jié)果，對低濃度受污染樣品進(jìn)行有效檢測。王雪晴等[29]也采用RT-ddPCR建立了一種檢測冷凍草莓中GⅠ型、GII型NoV方法。該方法在10-6稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品中，實(shí)測拷貝數(shù)濃度低至1.8拷貝/μL，其靈敏度比RT-qPCR法高一個數(shù)量級。但當(dāng)樣品濃度不在檢測限范圍內(nèi)時，會因閾值線的設(shè)置的差別產(chǎn)生結(jié)果偏差[30]。此外，Tan等[31]采用一步法RT-ddPCR，以公開的引物和探針組JJV1F/JJV1R/JJV1P、JJV2F/COG2R/RING2分別用于檢測牡蠣中GⅠ 型、GII型NoV，并與RT-qPCR進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，RT-qPCR檢測NoV的靈敏度為1.88×102拷貝/μL，而RT-ddPCR定量檢測NoV的靈敏度為1.88×101拷貝/μL，是RT-qPCR的10倍。

越來越多的研究開始將數(shù)字PCR用于食源性致病微生物的檢測，并且顯示出一定的優(yōu)勢，但目前儀器價格昂貴制約著該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用，相信隨著科技的發(fā)展，儀器成本的下降，將會得到普及。

2.3 二代測序技術(shù)

二代測序(Next-generation sequencing，NGS)是基于PCR和基因芯片發(fā)展起來的一種DNA測序技術(shù)，該方法通過捕捉DNA復(fù)制過程中新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)測序，具有高通量、超高速、低成本的特點(diǎn)[32]。常見的技術(shù)平臺包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。常規(guī)的RT-PCR之后NGS只能簡單地檢測NoV RNA的存在，無法區(qū)分感染性和非感染性病毒顆粒。為避免非感染性病毒顆粒造成的假陽性，可對樣品進(jìn)行RNase預(yù)處理。Imamura等[33-34]結(jié)合RNase酶解預(yù)處理和NGS技術(shù)對牡蠣樣品中基因型進(jìn)行鑒定，證明了牡蠣中傳染性NoV的多樣性。牡蠣中含有幾種NoV基因型(GII.3、GII.4、GII.13、GII.16和GII.17)，不同基因型的檢出率和比例不同。Bartsch等[35]為了提供用于漿果中病毒檢測和鑒定的新方法，對曾造成大規(guī)模NoV腸胃炎暴發(fā)的草莓進(jìn)行了NGS測試。研究證明，使用NGS技術(shù)可以鑒定自然污染的冷凍漿果中的人類致病性病毒，此次試驗(yàn)產(chǎn)生了約2 900萬個序列，僅兩個序列顯示出與人源NoV同源。

二代測序技術(shù)可對諸多常見及罕見的NoV變異序列進(jìn)行類別鑒定與分析，對于分型溯源具有不可比擬的優(yōu)勢。然而，該方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化以減少干擾序列，使得能夠在高度豐富的核酸的背景下方便且可再現(xiàn)地檢測出少量的人類致病性病毒序列，如通過對樣品進(jìn)行DNases處理。

3 免疫學(xué)檢驗(yàn)

免疫學(xué)檢驗(yàn)主要基于抗原抗體反應(yīng)，即用特異性的抗體來檢測樣本中的NoV。根據(jù)用于檢測或量化分析物的標(biāo)記方法，可以將免疫學(xué)檢驗(yàn)分為不同的類型，目前用于NoV檢測的免疫學(xué)方法主要有ELISA和免疫層析技術(shù)。

3.1 ELISA

ELISA是一種常見的免疫學(xué)檢測技術(shù)，它通過將抗原或抗體結(jié)合在固相載體表面，再加入酶標(biāo)抗體或抗原，當(dāng)抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合時，酶催化底物顯色以達(dá)到檢測的目的，ELISA具有檢測時間短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。已有許多商業(yè)ELISA試劑盒用于臨床樣本中NoV的檢測，如英國DakoCytomation公司開發(fā)的IDEIATM諾如病毒試劑盒、德國R-biopham公司開發(fā)的Ridascreen?諾如病毒試劑盒，但這些試劑盒的靈敏度和特異性范圍差異很大，且可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，制約了其發(fā)展應(yīng)用。食品中NoV含量低，而ELISA的最低檢測濃度為104～106病毒顆粒/g，因此目前ELISA尚不能滿足食品樣本對NoV檢測的靈敏度要求[36]。

3.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)以固定有檢測線(包被抗體)和質(zhì)控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，是一種在免疫滲濾基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型免疫學(xué)檢測方法。當(dāng)樣品中存在相應(yīng)的抗原時，抗原會與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，在檢測線出現(xiàn)可見的條帶而達(dá)到檢測目的。免疫層析具有檢測時間短、保質(zhì)期長、成本相對較低等優(yōu)點(diǎn)，一些商業(yè)免疫層析試劑盒也用于NoV檢測。Kumthip等[37]評估了最新版的RIDA?QUICK諾如病毒免疫層析試劑盒對臨床樣本中NoV檢測的敏感性和特異性，并與RT-PCR進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，該試劑盒具有較高的靈敏度和特異性，且與其他胃腸炎病毒無交叉反應(yīng)。由于免疫層析技術(shù)具有檢測靈敏度和特異性較低的缺點(diǎn)，且對NoV的分型能力有限，因而主要用于臨床樣本中NoV的檢測。但可將其與其他技術(shù)聯(lián)合以提高檢測的靈敏度，從而滿足食品中NoV的檢測要求。

ELISA和其他免疫學(xué)檢測方法一樣具有檢測靈敏度和特異性較低的缺點(diǎn)，其檢測下限為104～106個病毒顆粒/g，不利于食品基質(zhì)中NoV檢測。隨著新方法的出現(xiàn)以及與其他技術(shù)聯(lián)用，使得食品中NoV的檢測成為可能。如張捷等[38]通過將免疫層析法與近紅外熒光結(jié)合，制備了一種用于檢測貝類中NoV的便攜式試紙條；Alharami等[39]開發(fā)了一種基于納米材料的免疫分析方法，可實(shí)現(xiàn)對雞肉、黃瓜、生菜中NoV的檢測。免疫學(xué)技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用不僅提高了檢測的靈敏度，滿足了食品中NoV的檢測要求，還使檢測設(shè)備更加便捷。核酸檢測、免疫學(xué)檢測用于諾如病毒檢測的評價匯總見表1。

4 生物傳感器

生物傳感器是一種可將生物響應(yīng)轉(zhuǎn)換成可測量的光、電或物理信號的分析裝置，由生物刺激性材料識別元件和理化轉(zhuǎn)換系統(tǒng)組成。根據(jù)所使用的信號轉(zhuǎn)換器，生物傳感器可分為電化學(xué)、光學(xué)、壓電晶體和半導(dǎo)體生物傳感器等[40]。生物傳感器具有靈敏度高、成本低、分析速度快、高度自動化、集成化等特點(diǎn)，越來越成為研究的重點(diǎn)。

4.1 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是一種將生物識別轉(zhuǎn)換為電流、電位、阻抗等電信號的傳感平臺，具有低成本、高靈敏度的特點(diǎn)。Baek等[41]以NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽為特異性生物分子結(jié)合劑，研制了一種用于高選擇性、高靈敏度檢測牡蠣樣品中NoV的電化學(xué)生物傳感器。NoroBP多肽通過噬菌體表面展示技術(shù)從隨機(jī)肽庫中篩選而出，能與NoV特異性結(jié)合。NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽是以NoroBP為骨架，將兩個(GGGGS)連接子和一個(EKEKEKE)連接子插入到NoroBP中而成。此外，該多肽含有巰基，可在Au表面形成Au—S共價鍵，利用該特點(diǎn)可將多肽包被在電極上，電流信號隨NoV量的增加而遞減。該傳感器能對牡蠣中NoV進(jìn)行高靈敏度、高選擇性檢測，檢測下限低至1.7拷貝數(shù)/mL。此外，Baek等[42]還開發(fā)了一種NoV特異性捕獲多肽功能化金納米修飾的二硫化鎢納米花電化學(xué)傳感平臺。當(dāng)病毒與金納米顆粒修飾的二硫化鎢納米花結(jié)合時，通過阻止工作電極與氧化還原物之間的電荷轉(zhuǎn)移而提高了阻抗，阻抗值會隨著NoV量的增加而增加。利用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)對傳感器檢測性能進(jìn)行評估，該傳感器具有良好的選擇性和靈敏度，在牡蠣樣品中檢測限為6.21拷貝數(shù)/mL。

表1 諾如病毒檢測方法(核酸檢測、免疫學(xué)檢測)及評價?

除了利用多肽直接對NoV進(jìn)行檢測外，也可利用NoV衣殼蛋白和諾如病毒樣顆粒進(jìn)行間接檢測。如，Guo等[43]通過將制備的針對NoV衣殼蛋白的單克隆抗體偶聯(lián)在ITO/CdS電極表面，開發(fā)了一種光電化學(xué)生物傳感器，用于特異性和靈敏檢測NoV。該傳感器電極的光電流隨著NoV衣殼蛋白濃度的變化而變化，可在30 min 內(nèi)以濃度依賴的方式檢測到低至2×10-10g/mL的NoV衣殼蛋白。此外，Lee等[44]利用外加磁力將金/磁性納米顆粒修飾的石墨烯沉積在叉指式鉑電極上作為電傳感通道，再與GII型NoV抗體偶聯(lián)，形成諾如病毒樣顆粒傳感平臺。該傳感平臺可通過測量電阻的變化來監(jiān)測諾如病毒樣顆粒濃度的變化，在0.01 pg/mL～1.00 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍具有較高的靈敏度和特異性，檢測限為1.16 pg/mL。電化學(xué)生物傳感器作為一種高靈敏檢測病原體和污染物的新型工具，具有快速、現(xiàn)場診斷的NoV的潛力，可有效提高檢測的靈敏度，但其在實(shí)際中的應(yīng)用尚未普及[45]。

4.2 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器可分為基于熒光、吸收、反射、表面等離子體共振等，這些傳感器通常具有無標(biāo)記、所需樣品量少、高靈敏度或特異性、可近乎實(shí)時地進(jìn)行檢測的優(yōu)點(diǎn)，在食品中諾如病毒檢測方面具有巨大應(yīng)用潛力[46]。局域表面等離子體共振(Localized surface plasmon resonance，LSPR)是一種應(yīng)用廣泛的傳感方法，具有響應(yīng)速度快、衰變長度短的特點(diǎn)，可高靈敏度地檢測其表面的各種分析物[47]。Heo等[48-49]利用該技術(shù)開發(fā)了一種由親和肽引導(dǎo)的可檢測NoV衣殼蛋白和人源NoV的傳感器。親和肽通過從多價M13隨機(jī)肽庫中經(jīng)生物篩選而來，可與NoV特異性結(jié)合，經(jīng)ELISA鑒定，其與NoV的結(jié)合親和力為納摩爾級別。NoV衣殼蛋白含量與LSPR信號的吸光度呈正比，該傳感器的最低檢測限為0.1 ng/mL。但值得注意的是，利用LSPR進(jìn)行傳感時需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件以減少非特異性結(jié)合，而當(dāng)配體固定在傳感器表面后其天然構(gòu)型可能會改變，這將影響與分析物的結(jié)合[50]。除表面等離子體共振型光學(xué)傳感器外，基于熒光的光學(xué)傳感器也被應(yīng)用于食品中NoV檢測。Zhao等[51]從嗜熱菌中提取載色體，構(gòu)建了一種以“ε-亞單位抗體—鏈霉素—生物素—探針”檢測系統(tǒng)的F0F1-ATPase生物傳感器，并成功用于食品中NoV檢測。該研究利用鏈霉素—生物素系統(tǒng)將設(shè)計(jì)的探針連接至傳感器，根據(jù)探針與NoV RNA的特異性結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對NoV的檢測。與對照相比，該傳感器對NoV的熒光強(qiáng)度有顯著性差異，表明NoV被成功捕獲并連接到探針。所構(gòu)建的生物傳感器可在1 h內(nèi)完成NoV RNA檢測，靈敏度達(dá)0.005 ng/mL。此外，Adegoke等[52]開發(fā)了一種SiO2包覆合金化CdZnSeS量子點(diǎn)—分子信標(biāo)納米傳感器，用于檢測GII型NoV。該研究利用核酸雜交原理，通過分子信標(biāo)探針對NoV RNA進(jìn)行特異性捕獲。該量子點(diǎn)分子信標(biāo)探針可實(shí)現(xiàn)對低濃度NoV RNA的超靈敏檢測，最低檢出限為8.2拷貝數(shù)/mL。與傳統(tǒng)的分子檢測探針相比，該檢測系統(tǒng)具有快速、高特異、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

除了電化學(xué)和光學(xué)生物傳感器之外，還有一些其他的生物傳感器也被用于NoV的檢測，如基于質(zhì)量的生物傳感器(石英晶體微天平和微懸臂梁)、比色型生物傳感器、免疫傳感器等。與其他方法相比，生物傳感器具有靈敏度高、成本低、分析速度快、所需樣品量少等特點(diǎn)，在食品中諾如病毒檢測方面具有巨大應(yīng)用潛力。雖然生物傳感器的開發(fā)極大地提高了檢測的靈敏度，但其在實(shí)際中的應(yīng)用尚未普及，且當(dāng)其利用配體捕獲NoV時，可能會改變配體的天然構(gòu)象，從而影響與分析物的結(jié)合，因此仍需進(jìn)一步改進(jìn)。生物傳感器用于諾如病毒及其代替物檢測評價匯總見表2。

5 展望

在半個世紀(jì)的過程中，食品中NoV檢測和分析技術(shù)取得了極大的進(jìn)展，人們對NoV的流行病學(xué)特征、基因分型、檢測和診斷有了更深入的認(rèn)識。但目前NoV的檢測仍存在諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步的研究。首先，將含量極低的NoV從大樣本的復(fù)雜食品基質(zhì)中提取富集一直都是NoV檢測的瓶頸環(huán)節(jié)，雖然已有一些基于靶向結(jié)合的特異性富集方法，但仍缺少能與不同基因型NoV進(jìn)行廣譜結(jié)合的配體，因此開發(fā)具有廣譜配位性的配體對NoV的檢測極為重要[12]；其次感染性和非感染性病毒顆粒的區(qū)分對食品中NoV的檢測也十分關(guān)鍵。受損的衣殼蛋白雖然使NoV失去感染性，但其RNA依然存在，導(dǎo)致了核酸檢測假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。目前，可以通過在PCR擴(kuò)增之前加入核酸嵌入劑(如單疊氮乙錠和單疊氮丙啶)來達(dá)到區(qū)分感染性和非感染性病毒顆粒的目的[53]。核酸嵌入劑能夠穿透受損的衣殼蛋白，并與RNA共價結(jié)合，使得非感染性病毒不能進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增從而區(qū)分；最后仍需進(jìn)一步提升NoV檢測的靈敏度，實(shí)現(xiàn)快速、高通量檢測。核酸檢測耗時長，不利于實(shí)時檢測、免疫學(xué)檢驗(yàn)的靈敏度和特異性通常較低，且對NoV的分型能力有限，而目前正在開發(fā)的可快速檢測的生物傳感器還沒有在實(shí)際應(yīng)用中得以普及。雖然食品中NoV檢測研究已取得重大進(jìn)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)，需要繼續(xù)深入研究。

表2 諾如病毒及其代替物檢測方法(生物傳感器)和評價