有機磷農藥樂果對家蠶子代生殖功能的影響*

孫曼萁 魏 欣 石 敏 朱 勇

(1.西南大學蠶桑紡織與生物質科學學院，重慶 400715；2.重慶市萬州第一中學，重慶 萬州 404000)

樂果(Dimethoate)是內吸性有機磷殺蟲、殺螨劑，對害蟲和螨類有強烈的觸殺作用和一定的胃毒作用[1]，其作用機制是抑制昆蟲體內的乙酰膽堿酯酶，阻礙神經傳導而導致死亡[2]。然而樂果的使用也給農業(yè)環(huán)境的有益生物帶來了污染危害[3]，如對土壤動物呼吸強度具有明顯抑制作用[4]。這種污染危害甚至可通過食物鏈傳至整個農業(yè)環(huán)境的生物鏈，因而降低生物的多樣性。已有的研究明確樂果具有潛在的致畸、致突變和致癌作用[5]，其在生物體內經氧化代謝形成的氧化樂果，會毒害生物的神經，抑制免疫系統(tǒng)功能，導致組織細胞和DNA損傷[6]，用樂果處理小鼠的骨骼肌細胞不僅限制了細胞活力且使細胞凋亡率明顯增加[7]。陳建秋等[8]的研究還顯示樂果對輪蟲有一定的生殖干擾作用，會影響個體發(fā)育與性成熟周期和產卵量。

家蠶(BombyxmoriL.)屬于鱗翅目的模式昆蟲，是重要的經濟昆蟲[9-10]，其經過漫長的人工選擇和馴養(yǎng)，對不良環(huán)境因子的抵抗性較弱[11]，生產上常有因為農藥污染桑葉使家蠶急性或慢性中毒而造成嚴重經濟損失的事件發(fā)生[12-13]。關于有機磷農藥對農業(yè)環(huán)境有益昆蟲的生殖毒性備受關注。在本研究中，我們以家蠶作為實驗模型來評估樂果對于昆蟲的生殖毒性，以利于綜合評價蠶區(qū)使用樂果殺蟲對家蠶等農業(yè)環(huán)境有益昆蟲的危害性[14]。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

選用871和872兩個家蠶品種供試，由重慶市蠶業(yè)科學研究院提供。蟻蠶孵化收蟻后，1～4齡幼蟲正常環(huán)境下飼養(yǎng)(25 ℃恒溫，相對濕度75%±5%，人工氣候箱光周期12L±12D)，每天采摘新鮮桑葉喂養(yǎng)3次。

1.2 試蟲處理及取樣

將樂果(DMT，40%乳油，重慶市化工集團，生產批號：PD85121-3)用蒸餾水按照一定比例(

1.3 產卵性能和子代孵化率調查

在雌蛾產卵結束后將蛾圈置于25 ℃光照下催青，12 d后調查產卵數、受精卵數和孵化卵數，計算造卵數、產卵數、受精率和孵化率。每一個處理組調查個體數為6頭，均做5個生物學重復。

1.4 幼蟲生殖腺指數的計算

在子代家蠶發(fā)育至5齡5 d，各濃度藥液處理組中隨機取幼蟲(雌、雄各10頭)于冰浴條件下解剖其生殖腺并稱量。使用以下公式計算精巢和卵巢的臟器系數：生殖腺指數=(器官質量/體質量)×100。

1.5 幼蟲生殖腺的組織形態(tài)學觀察

上述解剖取得的子代家蠶幼蟲生殖腺在4 %多聚甲醛中固定24 h后，經乙醇梯度(50%、70%、80%、85%、90%、95%、無水)脫水，經二甲苯與無水乙醇1∶1混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，石蠟包埋，做連續(xù)切片，厚度5 μm，攤片機上40 ℃烘干。再進行二甲苯脫蠟，HE染色，顯微鏡(Lacia)下觀察拍照。

1.6 幼蟲生殖腺的抗氧化酶活性檢測

根據制造商的說明，使用酶活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司，江蘇蘇州)測定子代家蠶幼蟲生殖腺中的SOD和CAT酶活性。檢測樣本制作參照文獻[15]的方法。

1.7 抗氧化酶及生殖發(fā)育相關基因的實時熒光定量PCR檢測

取子代家蠶5齡5 d幼蟲的生殖腺提取總RNA。提取的各樣品總RNA用核酸分析儀測定其濃度并經1%瓊脂糖電泳檢測其完整性后，于-80 ℃條件下保存。根據各樣品RNA濃度, 反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物用Premier5.0軟件設計引物, 并送于生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。采用TB GreenTM PremixExTaqTMII試劑盒(TakaRa, 中國)熒光定量PCR檢測各樣品中與氧化應激相關的cat和sod基因以及與生殖發(fā)育相關基因(Ovo、Vg、Sxl-S、Achi-L、Aly、Vlg)的mRNA轉錄水平, 以家蠶Actin3作為內參，3個重復。基因的表達水平采用2-ΔΔCt法[16]計算, 并利用統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析。

表1 家蠶抗氧化酶基因和生殖發(fā)育相關基因的引物序列

1.8 數據處理

實驗數據采用EXCEL2010和SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，處理組與對照組之間的差異采用Tukey氏檢驗進行多重比較，以0.05作為顯著性水平。依據3次生物學重復試驗的數據，進行基因mRNA轉錄定量檢測和酶活性測定的數據分析。

2 結果與分析

2.1 樂果脅迫對家蠶產卵性能和子代孵化率的影響

家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后正常上蔟結繭，羽化后進行雜交(871×872)和自交(871×871)的產卵性能如表2和表3所示。與對照組相比，處理組的產卵數、轉色卵數、孵化率、死卵率是隨著添食樂果藥液濃度的增加而減少。在雜交組中，轉色卵數在200 mg/L樂果藥液處理組與對照組存在顯著差異(P<0.05)；蠶卵孵化率100 mg/L樂果藥液處理組與對照組存在顯著差異(P<0.05)，200 mg/L樂果藥液處理組與對照組存在極顯著差異(P<0.01)。在自交組中，100～200 mg/L樂果藥液處理組相比對照組，其產卵數、轉色卵數和孵化率都出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)。因此可以推測，家蠶添食樂果引起的慢性中毒對產卵、受精以及孵化都有一定的影響，且對于自交組的影響更加顯著。

表2 家蠶5齡幼蟲添食樂果后雜交組(871×872)產卵性狀的影響

表3 家蠶5齡幼蟲添食樂果后對自交組(871×871)產卵性狀的影響

2.2 樂果脅迫對子代家蠶幼蟲生殖腺指數的影響

精巢和卵巢是許多生殖毒物的重要靶器官，而性腺指數是脅迫后的毒性測量常用參數之一，可以直觀反映化學物質對靶器官的毒性作用。調查結果表明：家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后，雜交組子代幼蟲雌雄個體的生殖腺指數較對照組都呈現(xiàn)下降趨勢(圖1-A)，并且100 mg/L和200 mg/L處理組的雌性生殖腺指數較對照組均表現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)；自交組子代幼蟲生殖腺指數也呈現(xiàn)下降趨勢(圖1-B)。

比較雜交組和自交組子代的生殖腺指數變化，結果表明非致死劑量的樂果脅迫導致家蠶慢性中毒在自交組引起子代雌性幼蟲和雄性幼蟲生殖腺指數下降的幅度大于雜交組。

2.3 樂果脅迫對家蠶子代幼蟲生殖腺形態(tài)的影響

取家蠶子代5齡5 d雄性幼蟲的精巢進行組織切片，雜交組和自交組子代雄性幼蟲的精巢組織結構觀察如圖2所示：對照組雄性幼蟲的精巢外膜中細胞結構較為完整，精巢內膜向內延伸形成3片隔膜，精巢中的細胞排列整齊，且有精子束出現(xiàn)；各處理組隨著樂果藥液濃度的提高，子代雄性幼蟲的精巢組織的形態(tài)結構發(fā)生改變，睪丸外膜和包圍的結締組織變薄且出現(xiàn)破碎，高濃度處理組子代雄性幼蟲的生精囊可以觀察到明顯破裂，精細胞排列間隙較大，細胞排列散亂，且腔內出現(xiàn)碎片。

A～D依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后雜交組子代5齡雄性幼蟲的精巢切片；E～K依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后自交組子代5齡雄性幼蟲的精巢切片。實線箭頭所示為空泡，虛線箭頭所示為損傷的精母細胞。

子代5齡5 d雌性幼蟲的卵巢組織切片觀察如圖3所示：對照組的卵巢卵細胞排列較為整齊，且均勻分布于卵巢中；處理組與對照組相比，卵細胞分布不均，且隨著樂果脅迫濃度的增大，卵巢中細胞數目也相對減少，細胞間出現(xiàn)空泡。

A～D依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后雜交組子代5齡雌性幼蟲的卵巢切片；E～K依次為0(CK)、50、100和200 mg·L-1樂果藥液處理后自交組子代5齡雌性幼蟲的卵巢切片。實線箭頭所示為空泡。

通過比較雜交組和自交組子代5齡幼蟲生殖腺切片的形態(tài)結構，可見在相同濃度樂果處理下，自交組子代比雜交組子代的生殖腺普遍受損程度更大。這一結果表明，以非致死劑量的樂果脅迫導致的慢性中毒會對家蠶子代的生殖腺產生嚴重影響，且對自交組子代的影響程度更大。

2.4 樂果脅迫對家蠶子代幼蟲生殖腺抗氧化酶活性及基因mRNA轉錄的影響

2.4.1 SOD酶活性及基因mRNA轉錄變化

SOD能清除超氧陰離子自由基(O2-)，對機體的氧化與抗氧化平衡至關重要。家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后，雜交組子代幼蟲生殖腺中的SOD酶活性相較于對照組總體呈現(xiàn)上升趨勢(圖4-A)。其中，處理組子代雌性幼蟲隨添食樂果藥液濃度的上升SOD酸活性較對照顯著升高(P<0.01)，高濃度樂果藥液處理組子代幼蟲的SOD酶活性較對照組有極顯著性差異(P<0.01)，表明此時由樂果脅迫產生的氧化自由基可完全被歧化。實時熒光定量PCR檢測各處理組子代幼蟲生殖腺中sod基因mRNA轉錄水平相對于對照組均呈現(xiàn)出下降的趨勢(圖4-B)。檢測到的酶活性和基因mRNA轉錄的變化不一致，可能是因為SOD酶活性存在不完全依賴基因轉錄的翻譯過程和翻譯后蛋白質水平的調控[17]。

從圖4-C,D顯示的結果還可見：處理組自交子代雌性和雄性幼蟲生殖腺的SOD酶活性隨添食樂果藥液濃度的增加而極顯著降低，并且sod基因mRNA轉錄的趨勢與之具有一致性。

A、B為雜交組，C、D為自交組。

2.4.2 CAT酶活性及基因mRNA轉錄變化

機體內的SOD具有將超氧陰離子自由基轉化為H2O2的功能，而CAT可繼續(xù)分解H2O2，從而降低體內H2O2的濃度，SOD和CAT構成了機體應對外界脅迫的第一道防線[18]。

家蠶5齡幼蟲添食不同濃度樂果藥液后，在雜交組子代幼蟲生殖腺中的CAT酶活性隨著添食樂果濃度的增加而先降低后增加(圖5-A)。由圖5-B可見：處理組雜交組子代雌蠶生殖腺中的cat基因mRNA轉錄水平呈現(xiàn)先上升(50 mg/L樂果藥液處理組)再極顯著下調趨勢，出現(xiàn)了明顯的細胞受害后的基因轉錄水平回落；而處理組雜交組子代雄蠶生殖腺中的cat基因mRNA轉錄水平隨樂果添食濃度提高呈現(xiàn)先上調再下調(P<0.05)，然后極顯著(P<0.01)上升的趨勢。

A、B為雜交組，C、D為自交組。

自交組子代幼蟲生殖腺中的CAT酶活性變化與雜交組相似，并出現(xiàn)了細胞受害后cat基因轉錄水平回落(圖5-C、D)。推測家蠶經非致死劑量樂果脅迫后，子代幼蟲生殖腺中CAT酶活性激活系統(tǒng)受到影響時，能夠動員cat基因的上調表達，以緩解樂果慢性中毒對生殖細胞的危害[19]。

2.5 樂果脅迫對家蠶子代幼蟲生殖發(fā)育相關基因表達的影響

Vg是卵黃蛋白的前體基因，而卵黃蛋白是家蠶胚胎發(fā)育的營養(yǎng)來源，Ovo基因與卵巢的發(fā)育密切相關，Sxl-S也是作為生殖發(fā)育相關基因[20-22]。家蠶5齡幼蟲添食樂果藥液后，雜交組子代雌性幼蟲卵巢生殖發(fā)育相關基因Vg、Sxl-S、Ovo的mRNA轉錄水平在樂果藥液處理下，與對照組相比，在50 mg/L呈現(xiàn)上升趨勢，在100～200 mg/L均呈現(xiàn)及顯著性下降趨勢(圖6-A～C)，且分別下降44.5%、49.9%、29.9%。在不同濃度樂果藥液處理組，自交組子代子雌性幼蟲較雜交組相比均呈現(xiàn)極顯著性下調(圖6-D～F)，即樂果脅迫對自交組子代的生殖發(fā)育影響更大。

A～C為雜交組，D～F為自交組。

Achi-L、Aly、Vlg基因與精巢發(fā)育的能量代謝和配子分化相關[23]。樂果脅迫后，基因Achi-L、Aly、Vlg在精巢中出現(xiàn)下調表達，隨著不同濃度樂果藥液的處理，基因的表達出現(xiàn)不同程度的下降。其中經200 mg/L樂果藥液處理后的雜交組子代檢測到的結果與對照組相比，分別下調表達9.74倍、1.99倍、1.83倍；自交組子代檢測到分別下調表達了14.76倍、4.86倍、1.66倍。結果表明，樂果脅迫對家蠶自交子代的蠶卵影響更大。

A～C為雜交組，D～F為自交組。

3 討 論

有機磷農藥常被用作殺蟲劑，若操作不慎殘留在水果、蔬菜上，就會進入有機體造成傷害[24]，如小鼠[25]、蚯蚓[26]、鯉魚[27]的研究已經證實了樂果毒性的存在。有報道樂果會導致高萼花臂尾輪蟲的種群增長率和凈生殖率顯著下降[28]。對雄性小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入小劑量樂果會對其生殖系統(tǒng)及其胎鼠發(fā)育有一定程度的危害[29]。

抗氧化防御系統(tǒng)是昆蟲抗逆機制的一個重要組成部分。機體為保護細胞免受氧化應激的損傷，通過含有的多種酶類清除活性氧以維持體內氧化還原平衡，其中最重要的酶包括 SOD和CAT等[30]。在本實驗中，家蠶5齡幼蟲添食非致死劑量樂果后，子代幼蟲生殖腺中的sod基因mRNA水平下降到很低的水平，這可能會導致沒有足夠能力清除樂果脅迫產生的超氧陰離子，進而損傷生殖腺組織和細胞，影響子代家蠶的正常生殖生理活動。家蠶5齡幼蟲添食高濃度樂果藥液后，子代幼蟲生殖腺的CAT酶活出現(xiàn)顯著上升，這與Shadegan等[31]研究樂果處理鯉魚后的結論具有一致性。

睪丸是精子生長發(fā)育的主要部位，而精子計數、精子活動能力和形態(tài)是決定生育力的重要因素[32]。通過對子代家蠶5齡5 d幼蟲的精巢組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，樂果會對子代的精子數量和生精囊發(fā)育造成影響，這與Jallouli等[33]研究的樂果對雄性小鼠生殖參數的影響結果一致。卵巢是產生卵子的重要部位，是研究農藥雌性生殖毒性的常用指標之一[34]。在對子代家蠶5齡5 d幼蟲卵巢的組織切片中發(fā)現(xiàn)，隨著樂果處理濃度的增大，卵巢中細胞數目以及卵細胞受到的影響越大，這與Mahadevaswami等[35]研究結果具有一致性。

Vg是卵黃蛋白的前體基因，而卵黃蛋白是卵生動物胚胎發(fā)育時期的主要能源物質[36]。卵子形成過程中卵黃蛋白生成數量對于胚胎發(fā)生和早期幼體維持生命所需營養(yǎng)物質的提供有至關重要的作用[37]。薛高旭等[38]和宋作偉等[39]發(fā)現(xiàn)BmOvo基因可能參與家蠶卵子的形成，BmOvo下調表達會引起雌蛹體質量、繭層量和雌蛾造卵數均出現(xiàn)下降趨勢。Achi-L、Aly、Vlg基因與家蠶精巢發(fā)育的能量代謝和配子分化相關。盛潔等[40]研究發(fā)現(xiàn)，注射了Achi-si RNA-2的蠶蛾正常交配所產卵中的不受精卵率增加。本實驗結果表明，家蠶5齡幼蟲添食非致死劑量樂果后，子代雌蠶生殖腺中的Ovo、Vg和Sxl-S基因的mRNA轉錄水平下降，子代雄蠶生殖腺中的Achi、Aly、Vlg基因mRNA轉錄水平也出現(xiàn)下調表達，此結果提示家蠶因樂果脅迫導致的慢性中毒，可能對家蠶子代的生殖能力有一定影響。

本研究結果表明：家蠶5齡幼蟲添食低濃度樂果藥液導致的慢性中毒，可以使家蠶產下卵的孵化率、受精率等出現(xiàn)明顯下降，并且會影響到子代的生殖發(fā)育，導致子代家蠶生殖腺細胞損傷，且促使子代生殖腺中的過氧化加劇，抗氧化酶活性及其相關基因的mRNA轉錄水平發(fā)生改變，從而引起生殖腺抗氧化系統(tǒng)紊亂，抑制生殖發(fā)育相關基因的轉錄表達。研究結果還表明，家蠶因樂果脅迫慢性中毒對自交組子代生殖發(fā)育的影響更為明顯，故生產上推廣雜交組合也在一定程度上使危害降低。