龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉預(yù)防糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究

周?chē)?guó)新,江帝欽,張史飛,溫干軍

(東莞市東部中心醫(yī)院，廣東 東莞 523573)

糖皮質(zhì)激素具有抗炎及免疫抑制作用，已廣泛應(yīng)用于臨床各科，但其應(yīng)用帶來(lái)的不良反應(yīng)如胰島素抵抗、高血壓、青光眼和骨質(zhì)疏松癥等仍不可忽視。糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(GIOP)是臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，生理劑量的糖皮質(zhì)激素就可引起骨量丟失，使骨質(zhì)疏松骨折的發(fā)生率大大增加[2]，而長(zhǎng)期超生理劑量糖皮質(zhì)激素的使用，10%的患者診斷為臨床骨折，30%～40%的患者影像學(xué)證據(jù)顯示椎骨骨折，并且髖部及非椎骨骨折的風(fēng)險(xiǎn)也增加(相對(duì)危險(xiǎn)度分別為1.6和1.3)[3-5]。骨質(zhì)疏松骨折的發(fā)生嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，加重家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)，如何有效地預(yù)防GIOP的發(fā)生發(fā)展是目前亟待解決的重要問(wèn)題。口服雙磷酸鹽類(lèi)藥物(阿倫磷酸鈉與利塞膦酸鈉)是目前臨床推薦的治療GIOP的一線藥物，但雙磷酸鹽類(lèi)藥物存在上消化道反應(yīng)、急性期發(fā)熱反應(yīng)、骨骼肌肉疼痛及下頜骨壞死等不良反應(yīng)[6]，嚴(yán)重影響了患者的依從性及臨床療效。中醫(yī)藥可有效改善GIOP患者主要臨床癥狀，提高骨密度，改善骨代謝，為臨床防治GIOP提供了新的思路[7]。中醫(yī)提倡“治未病”的理念，注重未病先防，即在疾病未發(fā)生之前給予干預(yù)以預(yù)防其發(fā)生。基于此，本研究觀察了中藥龜板與阿倫磷酸鈉聯(lián)合應(yīng)用與各自單用對(duì)GIOP的預(yù)防作用，旨在探討中西藥聯(lián)合應(yīng)用的價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1藥物、試劑與儀器 地塞米松磷酸鈉注射液(天津遂成藥業(yè)，規(guī)格：1 mL∶2 mg)；龜板(將100 g龜板飲片置于適量純水中浸泡過(guò)夜，文火煎煮2 h，煎煮成50 mL，生藥濃度為2 g/mL)；阿倫磷酸鈉(默沙東，規(guī)格：70 mg /片，置于研缽內(nèi)研磨后水溶解，現(xiàn)磨現(xiàn)用)。雙能X射線 (DEXA)骨密度儀(美國(guó)GE公司)；Micro-CT 儀(viva CT40，SCANCO Medical AG)；萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(美國(guó)Instron公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠36只，3月齡，體重220～250 g，由中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：44002100011623。分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫控制在23～25 ℃，濕度67%，通風(fēng)良好，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將36只大鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、對(duì)照組、模型組、龜板組、阿倫磷酸鈉組、聯(lián)合組，每組6只?；A(chǔ)組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始稱(chēng)量體重后即處死取材，模型組、龜板組、阿倫磷酸鈉組、聯(lián)合組參考文獻(xiàn)[8]方法建立GIOP模型，即大鼠肌肉注射地塞米松注射液1.0 mg/kg，對(duì)照組給予等體積生理鹽水肌肉注射，均1次/3 d，連續(xù)5周。自造模開(kāi)始，按照人與大鼠體表面積折算法換算給藥量，龜板組同時(shí)給予龜板溶液3.15 g/(kg·d)灌胃；阿倫磷酸鈉組每周第1天給予阿倫磷酸鈉水溶液7.35 mg/kg 灌胃，其余6 d給予等體積生理鹽水灌胃；聯(lián)合組每周第1天給予阿倫磷酸鈉水溶液7.35 mg/kg 灌胃，其余6 d給予龜板溶液3.15 g/(kg·d)灌胃；對(duì)照組與模型組每天給予等體積生理鹽水灌胃。每周于清晨空腹?fàn)顟B(tài)稱(chēng)量及記錄大鼠體重，并根據(jù)體重變化適當(dāng)調(diào)整給藥劑量。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1骨密度檢測(cè) 灌胃結(jié)束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉各組大鼠，由同一操作者運(yùn)用雙能X射線骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)全身骨密度，使用儀器自帶的小動(dòng)物專(zhuān)用分析軟件分析大鼠全身骨礦鹽含量、骨面積、骨密度。

1.4.2腰椎Micro-CT掃描 大鼠處死后分離第4腰椎，并徹底剔除軟組織，檢測(cè)前將第4腰椎放入生理鹽水中浸泡24 h后進(jìn)行 Micro-CT掃描，設(shè)置掃描厚度為15 μm，設(shè)置感興趣區(qū)域?yàn)樽刁w內(nèi)直徑2 mm的圓形范圍區(qū)域，獲取感興趣區(qū)域骨微細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨面積體積比(BS/TV)、相對(duì)骨體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

1.4.3腰椎骨生物力學(xué)檢測(cè) 用磨砂紙將第4腰椎處理為兩端平行、約5 mm高度的中心圓柱體，用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行壓縮試驗(yàn)，壓縮速度設(shè)置為1 mm/min。分析最大載荷、壓縮位移、壓縮剛度及能量吸收值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠全身骨密度比較 模型組大鼠全身骨礦鹽含量、骨面積、骨密度均明顯低于基礎(chǔ)組(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組大鼠全身骨礦鹽含量、骨面積、骨密度均升高，其中阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)；與模型組比較，龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組大鼠全身骨礦鹽含量、骨面積、骨密度及對(duì)照組大鼠全身骨礦鹽含量、骨密度均明顯升高(P均<0.05)；阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組大鼠全身骨礦鹽含量、骨面積、骨密度均明顯高于龜板組(P均<0.05)，聯(lián)合組大鼠全身骨礦鹽含量、骨密度均明顯高于阿倫磷酸鈉組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠全身骨礦鹽含量、骨面積、骨密度比較

2.2各組大鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較 與對(duì)照組比較，龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組大鼠Tb.Th均明顯升高(P均<0.05)，SMI均明顯降低(P均<0.05)；與模型組比較，對(duì)照組、龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組大鼠BS/TV、BV/TV、Tb.N(龜板組除外)、Tb.Th均明顯增高(P均<0.05)，Tb.Sp、Tb.Pf、SMI均明顯降低(P均<0.05)； 聯(lián)合組大鼠SMI明顯低于龜板組及阿倫磷酸鈉組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠腰椎骨微結(jié)構(gòu)三維重建圖像 Micro-CT掃描重建圖像顯示：與對(duì)照組比較，模型組大鼠松質(zhì)骨出現(xiàn)明顯骨量丟失，骨小梁稀疏、細(xì)小，排列不均，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)大片無(wú)骨小梁骨髓區(qū)，出現(xiàn)明顯的骨微結(jié)構(gòu)破壞；各藥物干預(yù)組較模型組骨小梁增粗，結(jié)構(gòu)緊密，排列連續(xù)均勻，骨質(zhì)明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.4各組大鼠腰椎骨生物力學(xué)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠最大載荷、壓縮位移、壓縮剛度均明顯降低(P均<0.05)，2組能量吸收值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組大鼠最大載荷、壓縮位移、壓縮剛度及能量吸收值均明顯增高(P均<0.05)；聯(lián)合組大鼠最大載荷明顯高于龜板組和阿倫磷酸鈉組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠腰椎骨微細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

圖1 各組大鼠腰椎橫截面三維重建圖像

表3 各組大鼠腰椎骨生物力學(xué)參數(shù)比較

3 討 論

根據(jù)GIOP的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸為“骨痿”“骨痹”“腰痛”范疇。糖皮質(zhì)激素作為一種外源性的藥物，對(duì)機(jī)體來(lái)說(shuō)屬于“藥邪”，屬大辛大熱之物[9]，易耗傷腎陰，陰損及陽(yáng)，導(dǎo)致腎中陰陽(yáng)平衡失調(diào)，最終影響骨髓化生，骨骼失去腎精的濡養(yǎng)而發(fā)為骨痿?！端貑?wèn)·痿論》曰：“腎氣熱，腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！薄兜は姆ā分赋觯骸澳I虛受之，腿膝枯細(xì)，骨節(jié)酸疼，精走髓空?！敝赋隽薌IOP的基本病機(jī)為腎虛精虧，骨失所養(yǎng)。因此，GIOP的治療以補(bǔ)腎填精為主。龜板是傳統(tǒng)的名貴中藥，有滋陰補(bǔ)腎、滋陰潛陽(yáng)、補(bǔ)血止血、益腎健骨等功效?！侗静菝审堋分赋鳊敯濉皩?zhuān)補(bǔ)陰衰，善滋腎損”?！侗静菥V目》言龜板“能治療腰膝酸軟”?，F(xiàn)代藥理研究也證實(shí)龜板具有抗骨質(zhì)疏松的作用[10]，但臨床上很少用單味中藥防治GIOP，故本研究將龜板與GIOP的一線用藥阿倫磷酸鈉聯(lián)合應(yīng)用，研究中西藥聯(lián)合對(duì)GIOP的預(yù)防作用。

GIOP作為最常見(jiàn)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥類(lèi)型，骨折是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，骨密度的降低及骨折風(fēng)險(xiǎn)的增加與糖皮質(zhì)激素的使用時(shí)間及劑量相關(guān)，使用時(shí)間越長(zhǎng)，劑量越大，則骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高[11]。以往有研究報(bào)道，龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉對(duì)GIOP大鼠的骨密度及骨代謝有明顯的改善作用，但其主要是研究龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉對(duì)GIOP大鼠的治療作用，是在造模成功的基礎(chǔ)上進(jìn)行的治療性干預(yù)[12]。《素問(wèn)·四氣調(diào)神大論》指出：“不治已病治未病，不治已亂治未亂?！敝嗅t(yī)“治未病”理念包括未病先防和既病防變兩個(gè)方面。未病先防，即在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下根據(jù)病因病機(jī)預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸，進(jìn)行早期干預(yù)，以預(yù)防疾病的發(fā)生發(fā)展。正如《金匱要略》所說(shuō)的“見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”。有研究提倡在開(kāi)始使用糖皮質(zhì)激素的早期即進(jìn)行預(yù)防性治療，以降低骨折的發(fā)生率[2]?；诖?，本研究在GIOP造模的同時(shí)給予了中西藥物預(yù)防性干預(yù)，觀察早期預(yù)防對(duì)GIOP大鼠骨密度、骨微結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)的影響。

骨密度是診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)，可反映骨骼的礦物質(zhì)水平。本研究設(shè)置了基礎(chǔ)組作為基線對(duì)照，經(jīng)過(guò)造模后模型組大鼠全身骨密度顯著低于基礎(chǔ)組，說(shuō)明GIOP大鼠造模成功。不同藥物預(yù)防性干預(yù)后，各組大鼠骨密度均有提高，聯(lián)合組大鼠提高最為明顯，說(shuō)明龜板與阿倫磷酸鈉聯(lián)合用藥的效果優(yōu)于單一藥物干預(yù)。大量研究表明單純骨密度檢測(cè)不能準(zhǔn)確反映器官和組織水平的結(jié)構(gòu)特性信息[13]。Micro-CT技術(shù)是分析骨骼骨礦含量及重塑骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)的敏感且可靠的定量定性分析技術(shù)[14]，李捷等[15]采用該技術(shù)觀察了阿倫磷酸鈉早期干預(yù)對(duì)GIOP大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)阿倫磷酸鈉可有效改善股骨微結(jié)構(gòu)，有對(duì)抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的作用。故本研究采用Micro-CT技術(shù)對(duì)大鼠腰椎骨進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與模型組比較，對(duì)照組、龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組BS/TV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th明顯升高，Tb.Sp、Tb.Pf、SMI明顯降低，聯(lián)合組較龜板組與阿倫磷酸鈉組變化更為明顯，聯(lián)合組骨小梁數(shù)量增多、排列結(jié)構(gòu)整齊，骨質(zhì)改善更為明顯。說(shuō)明龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉不僅可提高GIOP大鼠的骨密度，還可以改善其腰椎骨微細(xì)結(jié)構(gòu)，對(duì)骨量及骨質(zhì)量均有改善作用，可有效預(yù)防GIOP的發(fā)生。

骨量與骨質(zhì)量是影響骨強(qiáng)度的因素，但骨量不等于骨骼的強(qiáng)度,強(qiáng)度需要從整體上評(píng)估力學(xué)性能，骨量、骨質(zhì)量、骨強(qiáng)度三者聯(lián)合使用是評(píng)估骨骼的結(jié)構(gòu)與強(qiáng)度的硬指標(biāo)。本研究采用腰椎壓縮試驗(yàn)對(duì)腰椎的生物力學(xué)性能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與模型組比較，龜板組、阿倫磷酸鈉組及聯(lián)合組最大載荷、壓縮位移、壓縮剛度及能量吸收值均明顯增高，聯(lián)合組大鼠最大載荷明顯高于龜板組和阿倫磷酸鈉組，且壓縮位移、壓縮剛度及能量吸收值較龜板組和阿倫磷酸鈉組有增大趨勢(shì)。說(shuō)明龜板與阿倫磷酸鈉聯(lián)合應(yīng)用可改善GIOP大鼠腰椎的生物力學(xué)性能，可提高骨強(qiáng)度。國(guó)內(nèi)有研究表明，單一使用龜板或阿倫磷酸鈉都可改善GIOP大鼠腰椎的生物力學(xué)性能[16]，與本研究結(jié)果相一致。

總之，龜板聯(lián)合阿倫磷酸鈉可提高GIOP大鼠骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，增加骨強(qiáng)度，對(duì)GIOP有預(yù)防性治療作用，兩種藥物聯(lián)合使用有協(xié)同增效作用。但關(guān)于龜板與阿倫磷酸鈉聯(lián)合用藥預(yù)防GIOP的相關(guān)作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。