劉牧秋，余嘉慧，高安然，陳光星

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，廣東 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以全身關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、僵硬為主要臨床表現(xiàn)的慢性自身免疫疾病，往往可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)損傷、畸形甚至殘疾。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療RA的常見(jiàn)藥物包括非甾體抗炎藥、抗風(fēng)濕藥物(DMARDS)和糖皮質(zhì)激素,然而這些藥物伴隨諸多不良反應(yīng)，包括感染、惡心、嘔吐、消化道刺激反應(yīng)、口腔炎癥、皮疹、脫發(fā)、骨髓抑制和肝臟毒性[1-2]。事實(shí)上，RA的中西醫(yī)結(jié)合治療具有更客觀的優(yōu)勢(shì)，有更穩(wěn)定、更顯著的療效，并有效降低了不良反應(yīng)的概率[3-4]。全國(guó)名老中醫(yī)專家、廣東省中醫(yī)風(fēng)濕疾病重點(diǎn)?？茖２W(xué)術(shù)帶頭人、廣州中醫(yī)藥大學(xué)首席教授陳紀(jì)藩教授認(rèn)為，RA病因病機(jī)為肝腎、氣血虧虛為本，風(fēng)寒濕侵襲為標(biāo)，扶正祛邪是治療RA的基本原則。加味通痹湯(昆明山海棠、枸杞子、丹參、杜仲、女貞子、墨旱蓮)為陳紀(jì)藩教授的經(jīng)驗(yàn)方，治療上重視益腎養(yǎng)陰，兼顧祛風(fēng)勝濕，化瘀涼血，在臨床應(yīng)用上已取得了可觀的療效，研究證實(shí)可顯著緩解活動(dòng)期RA患者疼痛、腫脹癥狀，改善C反應(yīng)蛋白、血沉等炎癥指標(biāo)[5]。二至丸(女貞子、墨旱蓮)具有益腎養(yǎng)陰的名方，主治腰膝疼痛、骨蒸潮熱、月經(jīng)量多等。二至丸為加味通痹湯的重要組方，寓有通過(guò)滋補(bǔ)腎陰、固本扶正而祛邪外出之意。臨床案例證實(shí)，單用女貞子一味中藥可明顯減輕RA患者關(guān)節(jié)腫痛，降低類風(fēng)濕因子水平[6]；藥理研究表明而二至丸具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等功效[7]，但尚無(wú)研究闡明二至丸對(duì)防治RA的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)，闡釋中草藥“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系的研究方法[8]，取代了藥物作用單一靶點(diǎn)的傳統(tǒng)研究思路。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，深入挖掘二至丸抗RA的作用靶點(diǎn)及通路，并探討中醫(yī)證型腎陰虛與RA現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)制的潛在內(nèi)涵，為后續(xù)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1二至丸活性成分 本研究將關(guān)鍵詞“女貞子”“墨旱蓮”分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)，http:// tcmspw.com/tcmsp. php)，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,挖掘二至丸的活性成分。

1.2二至丸作用靶點(diǎn) STITCH(http://stitch.embl.de)是檢索化合物與蛋白靶點(diǎn)(包括驗(yàn)證靶點(diǎn)及預(yù)測(cè)靶點(diǎn))相互作用關(guān)系平臺(tái)。本研究通過(guò)STITCH及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模塊，輸入二至丸活性成分，得到相應(yīng)靶點(diǎn)。登錄Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// www.uniprot.org)，限定物種為“Homo sapiens”，校正靶點(diǎn)信息，并將靶點(diǎn)進(jìn)行基因名與蛋白名的轉(zhuǎn)換。

1.3二至丸抗RA靶點(diǎn) TTD(https://db. idrblab. org /ttd)是提供藥物、靶點(diǎn)、靶向疾病及對(duì)應(yīng)通路關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)。DisGeNET (https:// www.disgenet.org)是整合疾病與基因關(guān)聯(lián)信息的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)。OMIM (https:// www.omim. org)是在線孟德?tīng)柸祟愡z傳數(shù)據(jù)庫(kù)，提供所有遺傳疾病基因信息。本研究以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，通過(guò)TTD、DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取RA相關(guān)基因。整合二至丸作用靶點(diǎn)及RA相關(guān)基因，取二者交集，得到二至丸治療RA的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 STRING是闡明功能蛋白相互作用關(guān)系平臺(tái)。PPI網(wǎng)絡(luò)(蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，protein-protein interaction network)揭示靶點(diǎn)之間關(guān)系，有助于從分子角度闡明機(jī)體生理病理機(jī)制。在STRING中輸入二至丸抗RA靶點(diǎn),作用閾值設(shè)置為0.900(最高)，結(jié)合Cytoscape 3.2.1構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中“節(jié)點(diǎn)”表示靶點(diǎn)，“邊”表示作用關(guān)系。以網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅亩戎行男?degree centrality,DC)、介數(shù)中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)為參數(shù)衡量網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性和關(guān)鍵程度，通過(guò)Cytoscape的“network analysis”功能，以DC、BC、CC大于中位數(shù)為條件，篩選出hub節(jié)點(diǎn)(為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn))。選取hub節(jié)點(diǎn)再次構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5靶點(diǎn)-成分互作網(wǎng)絡(luò) 從上述1.3數(shù)據(jù)中挖掘關(guān)鍵靶點(diǎn)所關(guān)聯(lián)的成分及其相互作用關(guān)系。用Cytoscape 3.2.1軟件建立關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)聯(lián)成分相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算節(jié)點(diǎn)DC值。節(jié)點(diǎn)DC越大，與其他節(jié)點(diǎn)互作關(guān)系越多。

1.6GO富集分析及KEGG通路富集分析 David 6.8(https://david.ncifcrf. gov/tools. jsp)是為基因或蛋白提供生物功能注釋信息的在線工具。在David 6.8中導(dǎo)入二至丸治療RA靶點(diǎn)，設(shè)置FDR(false discovery rate,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01，進(jìn)行GO(gene oncology,基因本體)富集分析，以闡釋基因的共同生物功能，包括了分子功能、生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組件3個(gè)模塊。同時(shí)利用David 6.8進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù))信號(hào)通路富集分析，設(shè)置FDR<0.05，結(jié)合文獻(xiàn)挖掘篩選與RA相關(guān)的信號(hào)通路，記錄通路所富集的基因及P值(false positive rate,假陽(yáng)性率)，并用R軟件繪制氣泡圖。

1.7分子對(duì)接 采用Autodock 4.0軟件對(duì)二至丸和核心活性成分和抗RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接分析。Autodock是一種分子模擬的自動(dòng)化程序，使分子之間通過(guò)幾何匹配和能量匹配相互識(shí)別，從而預(yù)測(cè)配體和蛋白靶標(biāo)之間相互作用關(guān)系[9]。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org)中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，運(yùn)用pymol軟件對(duì)蛋白進(jìn)行修飾，移除配體、水分子。在ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://zinc.docking.org)下載活性成分2D結(jié)構(gòu)式的mol2文件。運(yùn)用Autodock 4.0軟件將pdb和mol2文件轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件后，進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算結(jié)合能，結(jié)合能越小則配體與受體親和力強(qiáng)，所需能量越少。結(jié)合能小于0說(shuō)明受體和配體之間可自發(fā)結(jié)合。

2 結(jié) 果

2.1二至丸活性成分篩選 我們?cè)赥CMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出女貞子119種成分，墨旱蓮48種成分，基于OB、DL篩選及刪除重復(fù)后有21個(gè)活性成分納入研究，見(jiàn)表1。

2.2二至丸治療RA活性成分靶點(diǎn) 在STITCH、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘二至丸活性成分對(duì)應(yīng)的131個(gè)靶點(diǎn)。在DisGeNET、TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到RA相關(guān)基因1 908個(gè)。取交集后篩選出75個(gè)二至丸治療RA的靶點(diǎn)。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究利用75個(gè)靶點(diǎn)繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1A)，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?個(gè)參數(shù)的中位數(shù)后，設(shè)置DC≥32，BC≥0.005，CC≥0.418，得到25個(gè)Hub節(jié)點(diǎn)，為二至丸治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)，關(guān)鍵靶點(diǎn)信息見(jiàn)表2。利用此25個(gè)hub節(jié)點(diǎn)再次建立PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1B)。其中TP53、MAPK1、JUN、SRC的度中心性值較高(DC≥21)，在介導(dǎo)RA生物過(guò)程中起到重要作用。

表1 二至丸21個(gè)活性成分基本信息

A：75個(gè)二至丸抗RA靶點(diǎn)互作關(guān)系；B:25個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)互作關(guān)系圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 本研究發(fā)現(xiàn)25個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與12個(gè)二至丸活性成分具有相互作用關(guān)系，成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。我們認(rèn)為此12個(gè)成分為二至丸抗RA的核心活性成分，見(jiàn)表3。二至丸中槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等活性成分關(guān)聯(lián)多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)(DC≥6)，在治療RA藥理機(jī)制中起到重要作用。

2.5GO富集分析 本研究對(duì)75個(gè)二至丸治療RA的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，得到46條GO途徑滿足FDR<0.01，絕大多數(shù)屬于生物學(xué)過(guò)程模塊，按照P值從小到大對(duì)GO途徑進(jìn)行排列，篩選出屬于生物學(xué)過(guò)程模塊的前15條GO途徑，包括了 RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、老化、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、血管生成、對(duì)缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞老化、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控(見(jiàn)圖3A)。如圖所示，橫坐標(biāo)表示P值，縱坐標(biāo)表示各項(xiàng)生物學(xué)過(guò)程。綜上，二至丸防治RA的生物過(guò)程主要與增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成相關(guān)。

表2 二至丸抗RA的21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基本信息

圖2 成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中12個(gè)核心活性成分基本信息

2.6KEGG信號(hào)通路富集分析 KEGG富集分析后得到13條與RA相關(guān)的信號(hào)通路，見(jiàn)圖3B及表4。圖中表明，二至丸抗RA作用機(jī)制主要通過(guò)介導(dǎo)TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。

2.7分子對(duì)接結(jié)果 本研究將活性成分槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚與靶點(diǎn)TP53、MAPK1、JUN、SRC進(jìn)行分子對(duì)接，見(jiàn)表5。結(jié)果提示結(jié)合能均小于0，配體槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚與受體TP53、MAPK1、JUN、SRC可自發(fā)結(jié)合并相互作用。

圖3 GO估計(jì)分析柱狀圖及KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖

表4 二至丸治療RA相關(guān)13條信號(hào)通路具體信息

3 討 論

RA是累及全身多關(guān)節(jié)、多臟器的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要與關(guān)節(jié)滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞相關(guān)[10]。其中RA發(fā)病的重要環(huán)節(jié)為滑膜成纖維細(xì)胞(RA-FLS)的異常增殖，產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等，導(dǎo)致局部炎癥，損傷關(guān)節(jié)軟骨[11]。

表5 分子對(duì)接結(jié)果

加味通痹湯是名老中醫(yī)陳紀(jì)藩教授治療RA的驗(yàn)方，而二至丸是其重要組成部分，通過(guò)補(bǔ)腎陰、扶正氣而除風(fēng)濕外邪。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)二至丸抗RA的核心活性成分為槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等，關(guān)鍵靶點(diǎn)為TP53、MAPK1、JUN、SRC等。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與多條通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中TP53(腫瘤抑制基因p53)與RA-FLS凋亡相關(guān)，而RA滑膜組織中TP53基因突變?cè)龆喽δ苋笔В种屏薘A-FLS的正常凋亡[12]。MAPK1組成MAPK通路中的關(guān)鍵分子細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK),調(diào)控有絲分裂及減數(shù)分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。JUN組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，介導(dǎo)RA炎癥因子及MMPs的產(chǎn)生[14]。此外，SRC表達(dá)酪氨酸激酶，與RA炎癥反應(yīng)相關(guān)[15]。

滑膜炎致軟骨損傷是RA發(fā)病的關(guān)鍵。RA-FLS所產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，造成RA軟骨降解[16],同樣RA-FLS具有腫瘤樣般異常增殖和遷移的特性，對(duì)軟骨造成侵蝕[17]。TNF信號(hào)通路是二至丸介導(dǎo)的最重要的信號(hào)通路。腫瘤壞死因子(TNF)為此通路的激活劑，TNF有2個(gè)受體(TNFR1和TNFR2)。TNFR1信號(hào)傳導(dǎo)下游的MAPK通路、NF-κB通路、細(xì)胞凋亡通路，TNFR2信號(hào)傳導(dǎo)下游的JNK通路及Akt依賴的NF-κB通路，達(dá)到多水平的促炎效果[18]。MAPK通路激活同樣促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，也與RA-FLS增殖、侵襲和遷移相關(guān)[19-20]。研究證實(shí)木犀草素、槲皮素、β-谷固醇、山奈酚可通過(guò)介導(dǎo)MAPK通路抑制RA-FLS異常增殖和侵襲，顯著下調(diào)MMPs水平[21-24]。

二至丸介導(dǎo)的HIF-1信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Foxo信號(hào)通路等亦與抗滑膜炎癥、抑制損傷密切相關(guān)。HIF-1信號(hào)通路可通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α，上調(diào)VEGF的表達(dá)，有助于RA滑膜新生血管翳形成[25]，而滑膜血管翳形成是致RA軟骨損傷的重要病理基礎(chǔ)。T細(xì)胞受體信號(hào)通路誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖并分化成效應(yīng)T細(xì)胞，參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[26]。Toll樣受體途徑中Toll樣受體-3(TLR-3)在RA中高表達(dá)，參與了炎性因子如IL-6、IFN-β及MMP3的分泌[27]。在Foxo信號(hào)通路可控制RA-FLS受氧化應(yīng)激的影響，避免RA-FLS異常增殖[28]。處于哺乳期的RA婦女疾病活動(dòng)度風(fēng)險(xiǎn)增加，提示RA催乳素之間的關(guān)聯(lián)。研究表明，催乳素(PRL)可由與RA發(fā)病相關(guān)的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，催乳素受體(PRLR)在滑膜巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)，PLR與PRLR結(jié)合上調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6，IL-12β，TNF的表達(dá)[29]。

RA的骨質(zhì)破壞來(lái)源于破骨細(xì)胞的過(guò)度增殖及分化，打破了骨代謝的平衡。RANKL(TNF超家族一員)與破骨細(xì)胞表面受體RANK結(jié)合激活破骨細(xì)胞分化通路，激活成熟破骨細(xì)胞，加速骨吸收進(jìn)程[30]。而研究表明槲皮素具有抑制RANKL表達(dá)、抗破骨細(xì)胞分化作用[31]。此外對(duì)IL-6的應(yīng)答是造成RANKL的過(guò)表達(dá)的因素，并且促炎因子TNF-α、IL-17、IL-1β刺激IL-6的分泌[30]，因此抗炎為抑制RA骨質(zhì)破壞途徑。RA女性的發(fā)病率是男性的3倍，圍絕經(jīng)期為女性RA發(fā)病的高峰期，表明了雌激素與RA發(fā)病的關(guān)聯(lián)。在雌激素信號(hào)通路中，雌激素可抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌促炎因子IL-1和TNF-α來(lái)控制破骨細(xì)胞分化進(jìn)程，雌激素亦可通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的增殖和成熟，來(lái)抑制破骨細(xì)胞的發(fā)育，雌激素替代療法對(duì)預(yù)防RA婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有積極作用[32]。綜上，二至丸可通過(guò)抗炎，激活雌激素信號(hào)通路，抑制破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路而抗RA骨質(zhì)破壞進(jìn)程。

另一方面，二至丸為滋補(bǔ)腎陰的著名方劑，能有效減輕圍絕經(jīng)期婦女月經(jīng)紊亂、潮熱等癥狀，曾有國(guó)內(nèi)研究報(bào)道腎虛與雌激素減少具有正相關(guān)性[33]。我們認(rèn)為，補(bǔ)腎陰中藥或可通過(guò)雌激素信號(hào)通路，控制圍絕經(jīng)期女性RA進(jìn)展，雌激素信號(hào)通路被抑制可能為腎陰虛介導(dǎo)RA合并骨質(zhì)疏松的重要機(jī)制之一。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，推斷二至丸作為著名的滋腎陰方，主要藥理成分為槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山奈酚等，通過(guò)TP53、MAPK1、JUN、SRC等關(guān)鍵靶點(diǎn)，介導(dǎo)多條通路抑制RA-FLS的增殖和侵蝕軟骨，抑制RA-FLS分泌炎性細(xì)胞因子、MMPs，并且阻斷破骨細(xì)胞的分化途徑來(lái)控制骨質(zhì)破壞進(jìn)程，達(dá)到防治RA的目的。此外本研究亦創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)，雌激素信號(hào)通路被抑制可能為腎陰虛型RA發(fā)病與進(jìn)展的機(jī)制之一。以上結(jié)論有待進(jìn)一步臨床及實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。