豌豆蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化及其乳化性和起泡性研究

戴 媛，冷進松，陸紅佳

（重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院/特色植物研究院，重慶 402160）

豌豆（Pisum sativumLinn），別稱有麥豌豆、寒豆、麥豆、雪豆、畢豆、麻累、國豆等。原產(chǎn)于地中海南部及地中海沿岸，是一種營養(yǎng)性食品［1］。豌豆種子富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等［2］，其中蛋白質(zhì)含量達(dá) 20.6%［3］，豌豆蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的理化特性，可廣泛應(yīng)用于食品中，如具有較好的溶解性，可添加于飲料中；具有一定的發(fā)泡性能和泡沫穩(wěn)定性，可部分代替蛋類添加到糕點制品中；具有較好的乳化性和乳化穩(wěn)定性，可用作各類食品的乳化劑［4］。但是，目前對于豌豆蛋白質(zhì)理化特性的研究較少，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用也受到限制。因此，系統(tǒng)地研究豌豆蛋白質(zhì)的理化特性，有助于豌豆蛋白質(zhì)的深加工和綜合利用，也為豌豆蛋白質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外提取豌豆蛋白質(zhì)的方法主要分為物理法（超濾膜法［5］、超聲波提?。?］）、化學(xué)法（鹽析法、沉淀法［7］）和生物學(xué)法（酶水解法［8］）3 種方法。將超聲波提取技術(shù)與酶水解2 種提取方法有機結(jié)合，也就實現(xiàn)了物理法與生物學(xué)法之間的結(jié)合，進而得到一種具有提取率高、提取時間短、工作效率高等優(yōu)點的超聲輔酶法。

本研究采用超聲輔酶法提取豌豆蛋白質(zhì)，設(shè)置合理的工藝條件確定最佳工藝參數(shù)，使豌豆蛋白質(zhì)提取工藝得到優(yōu)化，提高豌豆蛋白質(zhì)提取率，并測定提取產(chǎn)物豌豆蛋白質(zhì)的乳化性和起泡性，為豌豆蛋白質(zhì)的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 豌豆（網(wǎng)絡(luò)購買），產(chǎn)于河南商丘；大豆油，市售（益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司）。

1.1.2 試劑 各種蛋白酶，均購自浙江博南生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），購自合肥巴斯夫生物科技有限公司；牛血清蛋白，購自蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 UV 2600 型紫外可見分光光度計，上海天美科技科學(xué)儀器有限公司；TG16W 高速離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；SB-5200 DTDN 超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RRH-250 型高速多功能粉碎機，上海緣沃工貿(mào)有限公司；KDN-102C 凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；SCIENTZ-150 高壓均質(zhì)機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豌豆蛋白質(zhì)提取的工藝流程 干豌豆→粉碎成粉→加水混勻→加酶→調(diào)節(jié)溶液pH（酶的最適pH）→在超聲波輔助提取下提取一定時間→100 ℃水浴，滅酶10 min→6 000 r/min 離心15 min→去掉上層的脂肪結(jié)塊和下層沉淀→收集中間的清液→分光光度計測吸光度→計算蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 豌豆基礎(chǔ)成分的測定 水分采用常壓干燥法，參照 GB/T5009.3—2016［9］；蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法，參照 GB/T5009.5—2016［10］。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定

1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定其含量，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［11］。

2）蛋白含量測定。取0.3 mL 提取液于試管中，0.15 mol/L 的氯化鈉溶液定容至1.00 mL，加5.0 mL考馬斯亮藍(lán)溶液后搖勻，在595 nm 的波長下測定吸光度。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算蛋白質(zhì)含量［12］。

1.2.4 單因素試驗 采用“1.2.1”的方法提取蛋白質(zhì)，固定提取條件為堿性蛋白酶、提取時間50 min、超聲波功率150 W，考察不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g∶mL，下同）對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響；固定提取條件為堿性蛋白酶、料液比1∶30、超聲波功率150 W，考察不同提取時間（20、30、40、50、60 min）對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響；固定提取條件為料液比1∶30、超聲波功率150 W、提取時間50 min，考察酶的種類（堿性蛋白酶、風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶）對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響；固定提取條件為堿性蛋白酶、料液比1∶30、提取時間50 min，考察超聲波功率（60、90、120、150、180 W）對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 軟件的Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，以豌豆蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值（Y），以料液比（A）、提取時間（B）、酶種類（C）、超聲波功率（D）為自變量，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面分析試驗，以優(yōu)化豌豆蛋白質(zhì)提取工藝。因素與水平設(shè)計見表1。

表1 因素與水平設(shè)計

1.2.6 乳化性和起泡性測定 取最佳工藝條件下制得的蛋白質(zhì)提取液，測定其乳化性和起泡性。

1）乳狀液的準(zhǔn)備。用 0.2 mol/L，pH 為 7.0 的磷酸鹽溶液配制1%（m/V，下同）豌豆蛋白質(zhì)溶液，取30 mL 蛋白質(zhì)溶液于100 mL 燒杯中，加入大豆油10 mL，用均質(zhì)機將混合溶液以5 000 r/min 的速度均質(zhì)2 min，制得乳狀液待用［13］。

2）乳化性測定。分別在0、10 min 時用微量移液器吸取底部乳狀液50 μL，加入25 mL 的0.1%（m/V）SDS 溶液混合均勻（稀釋500 倍）。以相同的SDS 溶液作空白對照，立即測定其在500 nm 處的吸光度［14］。乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）的計算公式如下：

式中，A0為均質(zhì)后迅速被稀釋的乳化液的吸光度；C為乳狀液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)濃度（g/mL）；Φ為乳狀液中油的體積分?jǐn)?shù)（1/4）。

式中，A0為均質(zhì)后迅速被稀釋的乳化液的吸光度；A10為乳狀液在靜置10 min 后的吸光度；t為時間（10 min）。

3）起泡性測定。用 0.2 mol/L、pH 為 7.0 的磷酸鹽溶液配制1%豌豆蛋白質(zhì)溶液，用移液管取40 mL于100 mL 小燒杯中，用均質(zhì)機以5 000 r/min 的速度均質(zhì)2 min，立即轉(zhuǎn)入量筒中，分別記錄均質(zhì)停止和30 min 之后的泡沫體積V1、V2［15］。起泡能力（FAI）和泡沫穩(wěn)定性（FSI）的計算公式如下：

式中，V1為均質(zhì)停止時的泡沫體積。

式中，V1為均質(zhì)停止時的泡沫體積；V2為均質(zhì)停止30 min 后的泡沫體積。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 Microsoft Excel 2007、Design Expert 8.0.6 軟件進行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆基礎(chǔ)成分的測定結(jié)果

豌豆中水分和蛋白質(zhì)的含量分別為9.12%、20.60%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖1所示，隨著料液比的不斷減小，豌豆蛋白質(zhì)提取率不斷增大，當(dāng)料液比在1∶30 時，提取率達(dá)到最大，主要是由于溶劑與樣品接觸面濃度差變大，引起滲透壓增大，更有利于溶質(zhì)的滲出，最終得到蛋白質(zhì)提取率不斷升高［16］；隨后料液比減小，提取率下降，主要是由于隨著料液比的不斷減小，提取液中蛋白質(zhì)濃度降低，增加了蛋白質(zhì)的提取難度。因此，選擇料液比1∶25、1∶30、1∶35 進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖1 料液比對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.2 提取時間對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖2 所示，隨著提取時間的增加，豌豆蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的變化趨勢，在提取時間為50 min 時，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大。主要由于提取時間增加，溶質(zhì)的溶解度逐漸增大，酶與蛋白質(zhì)充分反應(yīng)，當(dāng)達(dá)到一定時間后，溶質(zhì)的溶解度達(dá)到最大，且酶活性降低，進而蛋白質(zhì)的提取達(dá)到最大限度，不再溶出蛋白質(zhì)［17］。因此，選擇提取時間 40、50、60 min 進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖2 提取時間對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.3 酶種類對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖3所示，不同種類的酶對蛋白質(zhì)提取率的影響不同，其影響程度為堿性蛋白酶＞風(fēng)味酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶。其中，利用風(fēng)味酶和堿性蛋白酶提取樣品得到的蛋白質(zhì)提取率較高，并且兩者的提取效果差別較小，酸性蛋白酶提取樣品中的蛋白質(zhì)提取率最低，這是因為風(fēng)味酶和堿性蛋白酶在提取時的最適pH 偏堿性，蛋白質(zhì)在堿性溶液中溶解度大，得到較好的提取效果［18］，而酸性蛋白酶的最適pH 偏酸性，在4.5 左右，此pH 在蛋白質(zhì)的等電點附近，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不容易析出，得到的蛋白質(zhì)提取率偏低［19］。因此，選擇堿性蛋白酶、風(fēng)味酶和木瓜蛋白酶進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 酶種類對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2.4 超聲波功率對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖4 所示，隨著超聲波功率的增大，豌豆蛋白質(zhì)提取率先增加后下降，在超聲波功率為150 W 時，提取率達(dá)到最大。這是因為超聲波的功率增加，其空化效應(yīng)和機械效應(yīng)就愈加明顯，作用更加強烈［20］，將植物細(xì)胞壁進一步破碎，增大蛋白質(zhì)溶出速率，進而使蛋白質(zhì)更易溶出。但超聲波功率大于150 W 后，超聲波作用則會引起蛋白質(zhì)的變性，最終會影響蛋白質(zhì)的提取率［21］。因此，選擇超聲波功率 120、150、180 W 進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖4 超聲波功率對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以豌豆蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值（Y），以料液比（A）、提取時間（B）、酶種類（C）、超聲波功率（D）為自變量，應(yīng)用Design Expert 8.0.6 統(tǒng)計分析軟件設(shè)計試驗方案及結(jié)果，如表2 所示。

2.3.2 回歸模型擬合及方差分析 利用統(tǒng)計軟件對表3 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到提取率（Y）與自變量之間的回歸方程，即：Y=94.84+4.05A+1.52B+0.97C-0.34D-0.023AB-0.012AC-3.17AD-0.017BC+0.050BD+0.35CD-15.25A2-9.84B2-6.81C2-3.35D2。

由表3 可知，回歸模型P＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.962 5，表明模型的擬合值與實際結(jié)果的相關(guān)性較高；失擬項不顯著（P＞0.05），說明回歸方程擬合較好，模型穩(wěn)定；變異系數(shù)值CV=4.69%＜10.00%，進一步說明模型擬合較好，可用來進行分析和預(yù)測。

由F可知，4 個因素對響應(yīng)值影響的大小順序為A＞B＞C＞D，其中，一次項A和交互項AB，以及二次項A2、B2、C2、D2對響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），一次項B和交互項AC、AD對響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05）。

2.3.3 響應(yīng)面分析 兩因素之間的交互作用對應(yīng)值的影響可以通過響應(yīng)面圖反映出來，響應(yīng)曲面坡度越陡峭，說明因素的改變對于響應(yīng)值的影響越大，而曲面坡度越平滑，說明因素的改變對響應(yīng)值的影響也就越?。?2］。圖5 為料液比與提取時間、料液比與酶種類、料液比與超聲波功率、提取時間與酶種類、提取時間與超聲波功率、酶種類與超聲波功率之間的交互作用對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響。從圖5 中可以看出，圖5a 曲面坡度最陡峭、圖5b 和圖5c 曲面坡度較陡峭，而圖5d、圖5e 和圖5f曲面坡度較平滑，說明料液比與提取時間的交互作用對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響最明顯，其次是料液比與酶種類的交互作用、料液比與超聲波功率的交互作用的影響，而提取時間與酶種類、提取時間與超聲波功率、酶種類與超聲波功率的交互作用對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響不明顯，此結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.3.4 驗證試驗 對回歸方程進行分析求解，得到豌豆蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值時的提取條件為料液比1.00∶30.51，添加堿性蛋白酶，提取時間50.22 min，超聲波功率150.98 W，此條件下的提取率預(yù)測值為95.04%。為方便試驗操作，將提取條件定為料液比1∶30，添加堿性蛋白酶，提取時間50 min，超聲波功率150 W，在此條件下進行驗證試驗，得到豌豆蛋白質(zhì)提取率為95.64%，預(yù)測誤差為0.63%，與預(yù)測值接近。說明此模型可以用于豌豆蛋白質(zhì)提取條件的分析預(yù)測，響應(yīng)面法也可以有效地優(yōu)化豌豆蛋白質(zhì)的提取工藝條件。

2.4 乳化性和起泡性試驗

2.4.1 乳化性測定結(jié)果 豌豆蛋白質(zhì)提取物的乳化活性隨濃度變化趨勢如圖6 所示。由圖6 可以看出，EAI呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1%～3%時，隨著濃度的升高，EAI上升；當(dāng)濃度達(dá)到3%時，EAI達(dá)到最大值11.27 mL/g，之后隨著濃度的增大，EAI也下降。說明豌豆蛋白質(zhì)具有較好的乳化活性，且發(fā)揮最佳乳化活性濃度為3%。

圖5 兩因素交互作用對豌豆蛋白質(zhì)提取率的影響

圖6 豌豆蛋白質(zhì)濃度對EAI的影響

豌豆蛋白質(zhì)提取物的乳化穩(wěn)定性隨濃度變化趨勢如圖7 所示。由圖7 可以看出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1%～3%時，ESI呈上升趨勢，且在濃度為3%時達(dá)到最大值36.96 min；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度超過3%時，ESI下降，這是因為在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，高濃度有利于油相的分布，同時也增加了其黏度［23］，所以乳化活性及乳化穩(wěn)定性均理想，但達(dá)到一定平衡后繼續(xù)增加黏度卻破壞了體系的平衡，以致乳化性降低。因此，蛋白質(zhì)濃度3%為最佳條件，對ESI的效果最好。

圖7 豌豆蛋白質(zhì)濃度對ESI的影響

2.4.2 起泡性測定結(jié)果 豌豆蛋白質(zhì)提取物的起泡能力隨濃度變化趨勢如圖8 所示。由圖8 可以看出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1%～3%時，F(xiàn)AI呈上升趨勢，且在濃度為3%時達(dá)到最大值86.25%；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在3%～5%時，F(xiàn)AI呈下降趨勢，這是因為在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度增大，溶液黏度也增大，有利于泡沫的形成，但當(dāng)濃度過大時溶液黏度也過大，不利于泡沫的形成。因此，蛋白質(zhì)濃度3%為最佳條件，對FAI的效果最好。

圖8 豌豆蛋白質(zhì)濃度對FAI的影響

圖9 為豌豆蛋白質(zhì)提取物的泡沫穩(wěn)定性隨濃度的變化趨勢。由圖9 可以看出，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度在1%～3%時，F(xiàn)SI呈上升趨勢，且在濃度為3%時達(dá)到最大值33.33%；蛋白質(zhì)濃度在3%～5%時，F(xiàn)SI呈下降趨勢。因此，蛋白質(zhì)濃度3%為最佳條件，對FSI的效果最好。

圖9 豌豆蛋白質(zhì)濃度對FSI的影響

3 小結(jié)

本研究采用超聲輔酶法從豌豆中提取蛋白質(zhì)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化豌豆蛋白質(zhì)的提取工藝，并得到豌豆蛋白質(zhì)提取的最佳工藝條件為料液比1∶30，添加堿性蛋白酶，提取時間50 min，超聲波功率150 W，在此條件下得到豌豆蛋白提取率為95.64%，預(yù)測值為95.04%，預(yù)測誤差較小，說明采用響應(yīng)面方法優(yōu)化豌豆蛋白質(zhì)提取工藝可行，此結(jié)果為今后對豌豆蛋白質(zhì)的進一步研究奠定了理論基礎(chǔ)。

乳化性和起泡性試驗結(jié)果表明，豌豆蛋白質(zhì)具有較好的乳化活性和乳化穩(wěn)定性以及較好的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，其中，乳化活性和乳化穩(wěn)定性的最大值分別為11.27 mL/g、36.96 min；起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的最大值分別為86.25%、33.33%，此結(jié)果可為豌豆蛋白質(zhì)在食品及醫(yī)藥保健品等領(lǐng)域的開發(fā)利用提供一定的借鑒。