桃蛀螟氣味結合蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的基因克隆、原核表達及配體結合特性分析

郭洪剛, 魏春花, 張民照, 覃曉春, 杜艷麗

(北京農(nóng)學院生物與資源環(huán)境學院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室, 北京 102206)

昆蟲氣味結合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)氣味識別過程中的先鋒分子，其能夠特異性地識別和篩選特定化學信號，進而將環(huán)境信號傳至昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)昆蟲做出行為反應(Leal, 2013; 孫小潔等, 2020)。近年來，基于靶標昆蟲的嗅覺通訊行為調(diào)控來實現(xiàn)害蟲治理已成為有害生物綠色防控的熱點，其中，昆蟲氣味結合蛋白是該項防治措施的一類重要靶標(Venthur and Zhou, 2018; 杜迎剛等, 2020; 孫小潔等, 2020)。因此，進一步識別和鑒定靶標昆蟲的氣味結合蛋白，了解其結構特點和配體結合特性，對開發(fā)新的殺蟲劑，開展害蟲生態(tài)防控，實現(xiàn)害蟲綜合治理至關重要。目前，已鑒定出不同昆蟲的氣味結合蛋白，并且發(fā)現(xiàn)昆蟲行使嗅覺功能的大部分OBPs的基因均在觸角中高表達，如嘴壺夜蛾Oraesiaemarginata的OemaPBP1,桃蛀螟Conogethespunctiferalis的CpunOBP1,CpunOBP2和CpunPBP2等,以及玉米象Sitophituszeamais的SzeaOBP35-36等(Fengetal., 2017; Geetal., 2018; Tangetal., 2019)。進一步研究表明，OBPs可以與寄主植物揮發(fā)物結合，影響昆蟲與寄主植物間的信息交流，如：綠盲蝽Apolyguslucorum的AlucOBP22負責特異性識別β-紫羅蘭酮(β-ionone)和β-石竹烯(β-caryophyllene)等萜烯類揮發(fā)物，參與綠盲蝽寄主定位和寄主轉(zhuǎn)換(Liuetal., 2019)；煙粉虱Bemisiatabaci的BtabOBP3在其識別和選擇健康植株而不選擇病毒侵染植株的過程中具有重要作用(Shietal., 2019)。不僅如此，很多昆蟲的OBPs還能識別昆蟲性信息素[如地中海石蠅Ceratitiscapitata的CcapOBP22、蘋果蠹蛾Cydiapomonella的CpomPBP2、大蠟螟Galleriamellonella的GOBP2等]、報警信息素[如豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的ApisOBP3和禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi的RpadOBP3和RpadOBP7]等，從而影響昆蟲間的互作過程(交配、產(chǎn)卵和逃避等行為)(Sunetal., 2011; Fanetal., 2017; Falchettoetal., 2019; Lizanaetal., 2020; Tianetal., 2020)。而且，隨著對OBPs研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)OBPs還具有除嗅覺感知以外的其他生理功能。如AccOBP10基因參與中華蜜蜂Apisceranacerana響應非生物脅迫過程(Guoetal., 2021)；棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的HarmOBP3和HarmOBP6基因參與調(diào)節(jié)昆蟲的飛行能力(Wangetal., 2020)；小菜蛾Plutellaxylostella的PxylOBP13基因與該蟲對菊酯類殺蟲劑的抗性有關(Bautistaetal., 2015)。這些研究表明，OBPs不僅在昆蟲化學通訊過程中(昆蟲與寄主植物、昆蟲與昆蟲)發(fā)揮著重要的嗅覺作用，而且還行使除嗅覺以外的其他生理功能(杜亞麗等, 2020)。

桃蛀螟是一類以幼蟲鉆蛀危害板栗、桃、玉米、向日葵等多種果樹和經(jīng)濟作物的多食性害蟲。近年來，伴隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構的調(diào)整，桃蛀螟為害亦日趨嚴重。如在黃淮海夏玉米和西南山地夏玉米產(chǎn)區(qū)，桃蛀螟在玉米果穗上的種群數(shù)量迅速增加，使其為害程度超過亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis，成為當?shù)叵挠衩姿肫诘闹饕οx(王振營和王曉鳴, 2015)。然而，由于桃蛀螟幼蟲鉆蛀為害的特性，幼蟲期防治困難重重；目前有關成蟲的防治措施也僅限于性誘劑，而性誘劑只對雄蛾有效，如果雄蛾在誘殺前已完成交配，對壓低下一代蟲口基數(shù)起不到任何作用。最近研究人員發(fā)現(xiàn)，通過設計特異性引誘劑或驅(qū)避劑來防治桃蛀螟或通過基因編輯等方式定向調(diào)控桃蛀螟等鉆蛀類害蟲的嗅覺行為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展理念的防治策略(杜艷麗等, 2014; 賈小儉等, 2015; Xiaoetal., 2016; 朱秀云等, 2017; 翟浩等, 2019)。但目前有關桃蛀螟氣味結合蛋白的研究還較少，尚不能滿足實際開發(fā)的巨大需求?；诖耍狙芯扛鶕?jù)前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Jiaetal., 2016)，篩選鑒定兩個桃蛀螟氣味結合蛋白基因(CpunOBP3和CpunOBP4)，采用原核表達及蛋白純化得到CpunOBP3和CpunOBP4重組蛋白，通過熒光競爭結合實驗測定重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與24種配體的結合能力，為探討桃蛀螟感受氣味化合物的分子響應機制提供一定的科學依據(jù)，為開發(fā)基于桃蛀螟氣味結合蛋白的綠色防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

將2009年10月9日在北京農(nóng)學院東大地玉米試驗田采集桃蛀螟老熟幼蟲，于實驗室用新鮮甜玉米長期繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度23±1℃，相對濕度70%±5%，光周期16L∶8D。本實驗所用桃蛀螟成蟲已在室內(nèi)累計飼養(yǎng)80代，默認成蟲羽化72 h后雌雄蛾完成交配。

1.2 觸角總RNA的提取與cDNA第1鏈合成

分別取80對羽化后72 h的桃蛀螟雌、雄蛾觸角置于1.5 mL離心管中，用RNeasy Plus Mini Kit試劑盒提取總RNA，于-80℃保存?zhèn)溆?。?jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測觸角總RNA的完整性、核酸濃度測定儀(K5500)檢測RNA樣品的濃度及OD260/OD280值后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega Co., 美國)合成cDNA第1鏈，在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 目的基因片段擴增

基于前期桃蛀螟觸角轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，根據(jù)桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因開放閱讀框去信號肽序列后的序列，設計特異性擴增引物，依照pET-30a(+)質(zhì)粒圖譜在引物5′端添加內(nèi)切酶酶切位點(表1)。以1.2節(jié)合成的cDNA為模板，分別利用特異性引物(表1)進行PCR擴增，反應體系(50.0 μL): ddH2O 21.3 μL, cDNA 模板1.7 μL, 2×ES Taq MasterMix 25.0 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL。反應條件: 94℃預變性5 min后進入40個循環(huán)(CpunOBP3: 94℃變性40 s, 57℃退火40 s, 72℃延伸10 min;CpunOBP4: 94℃變性40 s, 53℃退火40 s, 72℃延伸10 min)，之后72℃再延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按TIANgel Midi Purification Kit試劑盒步驟純化回收PCR產(chǎn)物。

1.4 生物信息學分析

桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4序列通過DNAMAN 4.0軟件進行分析，并利用在線軟件(http:∥www.Expasy.org/compute_pi/)對CpunOBP3和CpunOBP4蛋白的等電點和分子量等基本物理性狀進行預測；使用IPSORT(http:∥www.ipsort.hgc.jp/)對CpunOBP3和CpunOBP4蛋白的信號肽進行分析；利用MEGA5.0軟件和鄰接法(neighbor-joining, NJ)對序列進行1 000次重復構建，完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.5 原核表達載體的構建

將1.3節(jié)膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞中，涂布在LB平板(含100 μg/mL Amp)上，于37℃培養(yǎng)16 h構建T載體。T載體依次通過菌液PCR、雙酶切和測序鑒定后，將測序結果與已知基因序列相同的菌液在LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)中擴大培養(yǎng)，同時將實驗室保存的pET-30a(+)菌種在LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Kna)中擴大培養(yǎng)，待菌液渾濁后，提取重組質(zhì)粒pMD-19T/OBPs和pET-30a(+)，使用指定的限制性內(nèi)切酶(表1)于37℃進行雙酶切反應，再根據(jù)片段大小回收OBPs目的片段和表達載體，并檢測回收產(chǎn)物的濃度和純度?；厥盏腛BPs目的片段和用同樣內(nèi)切酶切開的質(zhì)粒pET-30a(+)于16℃過夜連接構建表達載體。表達載體先后經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定后，將測序正確的菌液加高溫滅菌的甘油制成菌種保存液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 蛋白的誘導表達與純化

將1.5節(jié)鑒定成功的重組質(zhì)粒pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4活化后，參照賈小儉等(2015)的研究方法進一步誘導表達。取1 mL菌液作為未誘導樣品，加入1 mmol/L的IPTG誘導表達6 h。期間，每隔2 h取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min后除盡上清，加100 μL ddH2O混勻。處理后的菌液，以未誘導菌液為陰性對照，用15% SDS-PAGE電泳檢測不同時間段的誘導表達效果。參照賈小儉等(2015)的研究方法，將誘導好的CpunOBP3和CpunOBP4大腸桿菌菌液進一步純化。由于CpunOBP3和CpunOBP4均為包涵體蛋白，所以利用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行蛋白純化；蛋白純化過程中收集洗脫峰，經(jīng)電泳檢測后在4℃下20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中透析24～48 h，除去鹽離子；隨后采用重組腸激酶(欣百諾生物，上海)對純化好的蛋白于37℃酶切16 h以去除 His-tag，將切除His標簽的重組蛋白利用截留分子量規(guī)格為10 kD的超濾濃縮管將重組蛋白濃縮至1 mg/mL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 競爭性結合實驗

參照賈小儉等(2015)的研究方法，利用多功能酶標儀，通過熒光競爭結合實驗研究重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與2種桃蛀螟性信息素和22種植物揮發(fā)物的結合能力。首先，分別檢測CpunOBP3和CpunOBP4蛋白溶液與熒光探針1-NPN(Sigma Co.，德國)的解離常數(shù)Ki，然后測定蛋白與配體的結合能力，結合能力差異依據(jù)解離常數(shù)Ki值來比較。計算公式為Ki=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)(Banetal., 2003; 宋月芹等, 2014)，其中[1-NPN]為未結合的1-NPN濃度，K1-NPN為CpunOBP3/1-NPN或CpunOBP4/1-NPN蛋白的解離常數(shù)。

2 結果

2.1 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因的序列特征

對CpunOBP3和CpunOBP4基因氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，CpunOBP3(GenBank登錄號: GEDO010000010.1)開放閱讀框長387 bp，編碼128個氨基酸，分子量為14.72 kD，等電點7.52, 不含信號肽；CpunOBP4(GenBank登錄號: GEDO010000011.1)開放閱讀框長438 bp，編碼145個氨基酸，在N端前30個氨基酸組成信號肽，去除信號肽后的序列長度為348 bp，分子量為12.82 kD，等電點6.58(圖1)。另外，CpunOBP3和CpunOBP4均具有6個保守的半胱氨酸殘基，與典型的氣味結合蛋白家族特征X18-Cys1-X30-Cys2-X3-Cys3-X42-Cys4-X8-14-Cys5-X8-Cys6-X24-26(X代表任意氨基酸)一致，說明CpunOBP3與CpunOBP4在結構上屬于OBPs家族。

圖1 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4基因(去除信號肽序列) cDNA全長克隆Fig. 1 Cloning of the full-length cDNA sequences ofCpunOBP3 and CpunOBP4 genes (without signalpeptide sequence) of Conogethes punctiferalisM: DL2000 DNA marker.

2.2 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的序列比對與系統(tǒng)發(fā)育

將桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的氨基酸序列與夜蛾科的棉鈴蟲以及草螟科6種昆蟲的50個氣味結合蛋白通過DNAMAN 7.0進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4氨基酸序列中均有6個保守的半胱氨酸位點。通過對氨基酸的同源性和多態(tài)性進行分析，可以看出CpunOBP3與亞洲玉米螟的OfurOBP8和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的CmedOBP1聚為一支，支持率為100%；CpunOBP4與亞洲玉米螟的OfurOBP16聚為一支，支持率為67%；表明它們之間的親緣關系較近(圖2)。

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的桃蛀螟與其他昆蟲OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復)Fig. 2 Phylogenetic tree of OBPs from Conogethes punctiferalis and other insects by neighbor-joining methodbased on amino acid sequences (1 000 replicates)蛋白來源物種及其GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: 二化螟Chilo suppressalis (CsupGOBP1: ACJ07129.1; CsupOBP: AGM38605.1; CsupGOBP2: ACJ07120.1; CsupOBP5: AGK24581.1; CsupOBP4: AGK24580.1; CsupOBP3: AGK24579.1; CsupOBP2: AGK24578.1; CsupPBP1: ADK66921.1; CsupPBP2: ACJ07123.1; CsupPBP3: ADL09140.1); 桃蛀螟Conogethes punctiferalis (CpunOBP3; CpunOBP4); 棉鈴蟲Helicoverpa armigera (HarmOBP2: AEB54586.1; HarmOBP17: AFI57166.1; HarmGOBP1: AAL09821.1; HarmOBP31: ASA40067.1; HarmGOBP2: CAC08211.1; HarmOBP: AEX07279.1); 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis (CmedGOBP2: AFG72997.1; CmedOBP1: AFG72998.1; CmedGOBP1: AFG72996.1; CmedPBP2: AGI37364.1; CmedPBP1: AFG72999.1; CmedOBP13: ALT31643.1; CmedOBP26: APY22693.1; CmedOBP2: AFG73000.1; CmedGOBP3: AGI37362.1); 臍橙螟Amyelois transitella (AtraPBP1: ACX47890.1; AtraGOBP2: ACX47894.1; AtraGOBP1: ACX47893.1); 歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis (OnubPBP5: ADT78499.1; OnubPBP3: ADT78492.1; OnubPBP2: ADT78496.1; OnubPBP1: ADT78491.1; OnubPBP4: ADT78493.1; OnubGOBP2: BBB15978.1; OnubGOBP1: BBB15959.1); 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis (OfurPBP4: ADT78503.1; OfurPBP5: ADT78504.1; OfurPBP3: ADT78502.1; OfurPBP2: ADT78501.1; OfurPBP1: ADT78500.1; OfurOBP14: BAV56801.1; OfurOBP15: BAV56802.1; OfurOBP16: BAV56803.1; OfurOBP17: BAV56804.1; OfurOBP12: BAV56799.1; OfurOBP11: BAV56798.1; OfurOBP9: BAV56796.1; OfurOBP4: BAV56791.1; OfurOBP5: BAV56792.1; OfurOBP6: BAV56793.1; OfurOBP7: BAV56794.1; OfurOBP8: BAV56795.1; OfurOBP3: BAV56790.1; OfurOBP2: BAV56789.1; OfurOBP1: BAV56788.1); 瓜絹野螟Diaphania indica (DindPBP: BAG71419.1).

2.3 桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4的原核表達與純化

對構建的原核表達載體 pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4進行雙酶切和菌液PCR鑒定，結果顯示酶切產(chǎn)物大小以及PCR產(chǎn)物條帶大小均與預期的CpunOBP3和CpunOBP4目的片段大小相近，說明表達載體構建成功。隨后分別對pET-30a/CpunOBP3和pET-30a/CpunOBP4菌液進行誘導表達，并利用15% SDS-PAGE電泳檢測不同時間段CpunOBP3和CpunOBP4蛋白誘導表達效果，發(fā)現(xiàn)誘導表達所產(chǎn)生的CpunOBP3和CpunOBP4條帶隨誘導時間推移逐漸變寬，在6 h時表達量最多。并且SDS-PAGE電泳顯示CpunOBP3和CpunOBP4重組蛋白主要以包涵體蛋白形式表達。所以經(jīng)過蛋白純化過程中的尿素變性、純化及透析復性后用重組腸激酶去除His-tag標簽，對去除標簽后的目的蛋白再次純化得到目的蛋白。經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測，切除His-tag標簽后的CpunOBP3及CpunOBP4(去除信號肽)目的蛋白條帶分別約為14.72和12.82 kD(圖3)。

圖3 重組表達蛋白CpunOBP3和CpunOBP4的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the recombinant expression proteins CpunOBP3 and CpunOBP4M: 蛋白標準分子量Protein molecular weight marker; A: IPTG誘導不同時間下CpunOBP3表達量CpunOBP3 expression levels at different time after IPTG induction; B: IPTG誘導不同時間下CpunOBP4表達量CpunOBP4 expression levels at different time after IPTG induction; C: 不同分流液中CpunOBP3的表達CpunOBP3 expression in different separating media; D: 不同分流液中CpunOBP4的表達CpunOBP4 expression in different separating media. 0: 未經(jīng)IPTG誘導的pET-30a/CpunOBP3表達產(chǎn)物 Expression product of pET-30a/CpunOBP3 non-induced by IPTG; 1-6: 分別經(jīng)IPTG誘導1, 2, 3, 4, 5和6 h的pET-30a/CpunOBPs表達產(chǎn)物 Expression products of pET-30a/CpunOBPs induced by IPTG for 1, 2, 3, 4, 5, and 6 h, respectively. a: pET-30a/CpunOBP3菌液經(jīng)超聲破碎后的上清Supernatant of bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP3 after sonication; b: 經(jīng)超聲破碎后的pET-30a/CpunOBP3全菌液Total bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP3 after sonication; c: 上柱后的pET-30a/CpunOBP3蛋白流穿液Protein fluid of pET-30a/CpunOBP3 after flowing through the column; d: 純化后的CpunOBP3蛋白 Purified CpunOBP3 protein; e: 重組腸激酶切除His-tag標簽后的CpunOBP3蛋白Purified CpunOBP3 with His-tag removed by recombinant enterokinase; h, i: 經(jīng)超聲破碎后的pET-30a/CpunOBP4菌液沉淀Pellet of bacteria liquid of pET-30a/CpunOBP4 after sonication; j: pET-30a/CpunOBP4上柱后的蛋白流穿液Protein fluid of pET-30a/CpunOBP4 after flowing through the column; k: 純化后的CpunOBP4蛋白 Purified CpunOBP4 protein; l: 重組腸激酶切除His-tag標簽后的CpunOBP4蛋白Purified CpunOBP4 with His-tag removed by recombinant enterokinase. 箭頭指示目的條帶。Arrows indicate the target bands.

2.4 重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與配體的結合特性

根據(jù)Scatchard方程繪制回歸直線，計算得到CpunOBP3和CpunOBP4與1-NPN的解離常數(shù)Ki值分別為1.87 μmo1/L和2.23 μmo1/L(圖4: A, B)。通過熒光競爭結合實驗測定了重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4分別與2種桃蛀螟性信息素以及22種植物揮發(fā)物的結合能力。結果表明，CpunOBP3可以與測定的7種植物揮發(fā)物相結合，但不能與測試的2種桃蛀螟性信息素相結合；其中，與3-蒈烯的結合能力最強，解離常數(shù)Ki值為10.33 μmol/L；與其他6種植物揮發(fā)物的結合能力依次為莰烯(Ki=11.45 μmol/L)、α-水芹烯(Ki=12.65 μmol/L)、2-甲基丁醇(Ki=13.74 μmol/L)、2-甲基丁酸乙酯(Ki=18.21 μmol/L)、反-4-葵烯酸乙酯(Ki=19.84 μmol/L)以及α-法尼烯(Ki=23.34 μmol/L)(圖5: A, B; 表2)。CpunOBP4不僅能與桃蛀螟2種性信息素十六醛(Ki=7.83 μmol/L)和順-10-十六碳烯醛(Ki=14.65 μmol/L)結合，還能與8種植物揮發(fā)物結合，結合能力從大到小依次為丁酸乙酯、2-甲基丁醇、苯乙烯、檜烯、反-4-葵烯酸乙酯、3-蒈烯、γ-松油烯和α-法尼烯，Ki值分別為4.32, 8.65, 12.31, 14.53, 15.75, 16.04, 18.94和19.73 μmol/L(圖5: C, D; 表2)。

圖4 重組蛋白CpunOBP3(A)和CpunOBP4(B)與1-NPN的結合曲線Fig. 4 Binding curves of the recombinant CpunOBP3 (A) and CpunOBP4 (B) with 1-NPN

3 討論

本研究基于桃蛀螟成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序結果，利用PCR技術成功克隆了桃蛀螟兩個氣味結合蛋白基因CpunOBP3和CpunOBP4，并利用熒光競爭結合實驗測定了表達純化的重組蛋白CpunOBP3和CpunOBP4與24種配體(包括2種桃蛀螟性信息素和22種植物揮發(fā)物)的結合特性。結果表明，CpunOBP3和CpunOBP4都具有6個保守的半胱氨酸殘基，是典型的OBPs結構(C1-X25-30-C2-X3-C3-X36-42-C4-X8-14-C5-X8-C6)，符合Xu等(2009)鑒別鱗翅目昆蟲OBPs的經(jīng)典模式。經(jīng)信號肽預測發(fā)現(xiàn)CpunOBP4 N端有信號肽，而CpunOBP3 N端無信號肽，這種N端無信號肽的現(xiàn)象在其他昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)，如小菜蛾的PxylOBP13基因、棉鈴蟲的HarmGOBP1基因以及梨小食心蟲Grapholitamolesta的GmolOBP3基因氨基酸序列的N端均不存在信號肽序列(Zhangetal., 2011; 宋月芹等, 2014; 覃江梅等, 2016)。

氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育關系表明，CpunOBP3和CpunOBP4與亞洲玉米螟的氣味結合蛋白同源性較高，位于同一分支上(圖2)。從分類地位來看，桃蛀螟與亞洲玉米螟均隸屬于草螟科；就危害特性而言，兩者均以幼蟲鉆蛀危害玉米雌穗(Lietal., 2015; Lietal., 2020)。本研究結果從一定程度上暗示兩種昆蟲的氣味結合蛋白在識別寄主植物過程中起著相似的化學感受作用。

為進一步了解這兩個氣味結合蛋白的生理功能，我們測定了其重組蛋白與多種揮發(fā)性氣味物質(zhì)的結合能力，結果發(fā)現(xiàn)桃蛀螟CpunOBP3和CpunOBP4與配體的結合特性存在明顯差異(圖5； 表2)。這種差異首先表現(xiàn)在兩者與不同氣味的選擇性結合上，如：CpunOBP3只能與莰烯等7種植物揮發(fā)物相結合，而CpunOBP4既能與桃蛀螟性信息素(十六醛和順-10-十六碳烯醛)結合，也能與植物揮發(fā)物(檜烯、丁酸乙酯等8種化合物)相結合。結果也說明，普通氣味結合蛋白主要與寄主植物揮發(fā)物結合(Venthur and Zhou, 2018)，但也可以與性信息素結合，如梨小食心蟲等昆蟲的OBPs能顯著結合其性信息素(Chenetal., 2018; Jingetal., 2019)。我們前期研究也表明，CpunOBP3在雌、雄蛾觸角中的表達量差異不大，而CpunOBP4則主要在雄蛾觸角中表達(Jiaetal., 2016)，這也進一步解釋和說明了CpunOBP4可能在桃蛀螟雄蛾尋找配偶的過程中發(fā)揮重要作用。其次，CpunOBP3和CpunOBP4與配體結合特性的差異還表現(xiàn)在兩者對相同氣味物質(zhì)的結合能力有所不同，如：CpunOBP3和CpunOBP4均能與3-蒈烯結合，但解離常數(shù)卻相差很大，分別為10.33 μmol/L與16.04 μmol/L。因此，本研究結果也說明，一種氣味物質(zhì)并不僅僅由一種氣味結合蛋白負責識別，同時一種氣味結合蛋白也不是只負責一種氣味化合物的識別與運輸，這與之前有關小菜蛾和二化螟Chilosuppressalis等昆蟲OBPs與氣味分子結合功能的研究結果(Zhuetal., 2016; Khuhroetal., 2017)一致。這些研究表明，昆蟲不同的OBPs可以協(xié)同互作，通過與寄主植物、昆蟲性信息素等揮發(fā)物特異性識別，來共同調(diào)節(jié)昆蟲取食、寄主選擇以及交配產(chǎn)卵等行為(Britoetal., 2016)。綜上，我們推測CpunOBP3僅在桃蛀螟定位寄主植物的過程中發(fā)揮作用，而CpunOBP4在尋找配偶和定位寄主植物的過程中均發(fā)揮重要作用。本研究的結果為進一步開展以桃蛀螟氣味結合蛋白為靶標的綠色防控措施的靶點選擇提供了科學參考。