假單胞菌代謝產(chǎn)物藤黃綠菌素化學結(jié)構(gòu)、生物合成途徑、調(diào)控機制及應用研究進展

崔 瑩，宋 凱，何亞文

（上海交通大學生命科學技術(shù)學院/微生物代謝國家重點實驗室/教育部代謝與發(fā)育科學國際合作聯(lián)合實驗室，上海200240）

假單胞菌Pseudomonas廣泛分布于土壤、水、動植物體等生物和環(huán)境生態(tài)位，主要包括熒光假單胞菌P. fluorescens、銅綠假單胞菌P. aeruginosa、防御假單胞菌P. protegens、綠針假單胞菌P. chlororaphis、惡臭假單胞菌P. putida、丁香假單胞菌 P. syringae、施氏假單胞菌P. stutzeri和門多薩假單胞菌P. mendocina等[1,2]。按照功能分，假單胞菌又可分為植物促生和生物防治菌、植物病原菌、人類條件致病菌、生物修復菌[3]。許多植物根際促生假單胞菌通過分泌一種或幾種代謝產(chǎn)物來抑制植物根際病原菌的繁殖，達到促進植物生長的效果，這些代謝產(chǎn)物包括2,4-二乙酰藤黃酚(2,4-diacetylphloroglucinol，DAPG)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)、藤黃綠菌素(pyoluteorin，Plt)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin，Prn)和氰化物等[4,5]。

Plt是一種芳香族聚酮類假單胞菌代謝產(chǎn)物，其生物合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡已有多篇文獻報道。本文系統(tǒng)綜述了 Plt的化學結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生菌、合成基因簇、生物合成途徑以及近年來調(diào)控機制方面的研究進展，為進一步推動Plt相關的基礎與應用研究提供參考。

1 Plt的化學結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生菌

Plt最早由Takeda等[6]從銅綠假單胞菌T359和IFO3455產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中分離和鑒定，化學名稱為2,3-二氯-5-（2′,6′-二羥基苯甲?；┻量?，分子式為 C11H7O3NCl2。Plt常溫下為黃色晶體，溶于乙酸乙酯、甲醇、環(huán)季胺等有機溶劑，微溶于水，紫外最高吸收峰在310 nm左右[7]。芳香環(huán)作為吸電子基團對于Plt的抗菌活性是必須的；吡咯基團上的氯被溴或碘取代會顯著降低對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大腸桿菌Escherichia coli的抑菌活性，但被硝基取代可以增加Plt的抑菌活性[8]。目前已報道的Plt產(chǎn)生菌大都從植物根際分離得到，多數(shù)為防御假單胞菌和銅綠假單胞菌，少數(shù)惡臭假單胞菌也產(chǎn)生Plt（表1）。最近，Lacerna等[9]從一株海洋銅綠假單胞菌中分離到了3個新的Plt結(jié)構(gòu)類似物mindapyrroles A-C。

表1 已報道的藤黃綠菌素產(chǎn)生菌株Table 1 Reported pyoluteorin producing strains

2 Plt生物合成途徑

Plt生物合成基因簇包括：Plt合成基因操縱子pltLABCDEFG、Plt轉(zhuǎn)運操縱子pltIJKNOP、調(diào)控基因pltR、pltZ和pltM[28]。Plt由間苯二酚環(huán)和二氯吡咯基團組成，它們分別通過聚酮化合物生物合成途徑(PKS)和非核糖體多肽生物合成途徑(NRPS)合成[29]。脯氨酸是Plt二氯吡咯部分的合成前體，首先通過氨基酸激活酶PltF將脯氨酸激活為L-脯氨酰-AMP，然后將其連接到載體蛋白PltL的磷酸泛酰臂上；再通過FAD依賴脫氫酶PltE識別脯氨酰部分，該酶將脯氨酸氧化為相應的吡咯基[30]。PltA是黃素依賴性鹵化酶，在N末端有保守的FAD依賴性鹵化酶的結(jié)構(gòu)域，C末端則有一個獨特的螺旋區(qū)域與吡咯基-S-PltL底物結(jié)合，在4號位和5號位將吡咯基氯化得到二氯吡咯部分[31,32]；隨后，I-型聚酮合酶PltB和PltC利用丙二酰輔酶A單體使其碳鏈延長；PltG通過硫脂酶活性將延伸完全的聚乙酰底物和PltC的ACP結(jié)合域之間形成的硫酯水解，經(jīng)由脫水反應形成間苯二酚部分，最終產(chǎn)生Plt（圖1）。pltIJKNOP編碼ABC-型轉(zhuǎn)運復合體，負責將Plt轉(zhuǎn)運至胞外[4,30]。

圖1 Plt生物合成基因簇及推測的生物合成途徑模式圖[4,30]Fig. 1 Plt biosynthetic gene cluster and proposed biosynthetic pathway[4,30]

3 Plt生物合成調(diào)控網(wǎng)絡

3.1 PltR和PltZ調(diào)控Plt生物合成

Plt生物合成基因簇包含兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因pltR和pltZ。PltR是LysR家族轉(zhuǎn)錄因子，包含一個N-端螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的DNA結(jié)合基序和一個C-端LysR底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Li等[33]發(fā)現(xiàn)菌株M18中PltR蛋白結(jié)合在pltL啟動子保守的DNA結(jié)合位點（GCCTTTGCG-N4-CGCAAAGGC），激活pltL的表達，敲除pltR后Plt的產(chǎn)量顯著降低。PltZ屬于TetR家族細菌調(diào)控蛋白，Huang等[34]發(fā)現(xiàn)PltZ抑制了pltH的轉(zhuǎn)錄進而負調(diào)控Plt的轉(zhuǎn)運和外排，同時抑制Plt生物合成基因的表達[35]。pltZ基因的突變可引起Plt產(chǎn)量比野生型提高4.4倍。

3.2 間苯三酚類化合物作為信號分子調(diào)控Plt生物合成

在假單胞菌Pf-5中PhlD負責合成間苯三酚（phloroglucinol，PG），敲除phlD基因后，Pf-5不能產(chǎn)生Plt；外源添加低濃度PG能夠誘導phlD突變體產(chǎn)生Plt，外源添加高濃度PG則抑制Plt的產(chǎn)生[36]。Yan等[37]發(fā)現(xiàn)外源添加10 nmol/L PG誘導ΔphlD中pltL的表達，但不能誘導ΔphlDΔphlR中pltL的表達，由此確定PG通過PltR誘導pltL的表達。

pltM編碼一個FADH2依賴的鹵化酶，敲除pltM不能產(chǎn)生Plt；外源添加PG同樣不能誘導ΔphlDΔpltM中pltL的表達，由此推測Pf-5通過將PG轉(zhuǎn)化為另外一種小分子化合物誘導pltL的表達。通過比較野生型與ΔpltM的代謝產(chǎn)物，ΔpltM不能產(chǎn)生PG結(jié)構(gòu)類似的2-氯苯-1,3,5-三醇（PG-Cl）和2,4-二氯苯-1,3,5-三醇（PG-Cl2）；體外酶活試驗證明PltM能夠?qū)G轉(zhuǎn)化為PG-Cl和PG-Cl2；外源添加PG-Cl和PG-Cl2能夠誘導pltL的表達和Plt的產(chǎn)生[37]。Mori等[38]結(jié)合PltM的晶體結(jié)構(gòu)和體外酶活試驗發(fā)現(xiàn)，PltM具有底物多樣性和鹵化多樣性，可以將多種酚類化合物氯化、溴化和碘化?；谏鲜鼋Y(jié)果，Yan等[37]推測假單胞菌Pf-5中PhlD合成的PG經(jīng)由PltM轉(zhuǎn)化成PG-Cl和PG-Cl2，再與PltR結(jié)合誘導pltL的表達和Plt的產(chǎn)生。在假單胞菌PA1201基因組中phlD基因位于pltM的上游，與pltM相鄰。我們未發(fā)表的結(jié)果表明Δ phlD和ΔpltM都不能合成Plt，在野生型菌株培養(yǎng)液中檢測到PG-Cl和PG-Cl2，ΔpltM培養(yǎng)液中則沒有檢測到PG-Cl和 PG-Cl2。

3.3 群體感應機制調(diào)控Plt生物合成

群體感應是細菌利用小分子化合物進行細胞通訊的一種保守機制。目前只有在銅綠假單胞菌中有群體感應調(diào)控Plt生物合成的報道。銅綠假單胞菌中至少存在3種群體感應系統(tǒng)，包括以高絲氨酸內(nèi)酯為信號分子的LasI/R和RhlI/R信號系統(tǒng)以及以喹諾酮為信號分子的PQS信號系統(tǒng)[39]。銅綠假單胞菌M18中LasI和RhlI產(chǎn)生的群體感應信號分子分別與其相應的受體LasR和RhlR結(jié)合，負調(diào)控pltR的轉(zhuǎn)錄水平，抑制Plt的生物合成[40]。PQS信號受體PqsR負調(diào)控Plt生物合成；PQS信號分子對Plt生物合成及基因表達無顯著調(diào)控作用[41]。Huang等[42]在M18中發(fā)現(xiàn)LuxR型群體感應調(diào)節(jié)基因vqsR不影響高絲氨酸內(nèi)酯信號分子合成，但可以正調(diào)控Plt生物合成。

3.4 雙組分系統(tǒng)GacS/GacA正調(diào)控Plt生物合成

GacS/GacA 雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在感應到外界信號時激活3個sRNA（RsmXYZ）的轉(zhuǎn)錄，從而競爭性和阻遏蛋白RsmA、RsmE結(jié)合，釋放靶基因mRNA的核糖體結(jié)合位點[43,44]。Huang等[40]發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌M18中GacA正調(diào)控pltR的翻譯水平，RsmA負調(diào)控pltR的翻譯水平。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)在假單胞菌H78中RsmE直接與pltR和pltAB的mRNA結(jié)合負調(diào)控Plt生物合成；RsmA通過未知機制正調(diào)控pltR和pltLABCDEFG操縱子的轉(zhuǎn)錄。其次，RsmA/RsmE與GacS/GacA-RsmXYZ之間存在一個正反饋調(diào)控機制，對于激活Plt生物合成至關重要（圖2）。關業(yè)俊等[46]發(fā)現(xiàn)在假單胞菌H78中雙突變rsmA/E后，hmgA基因?qū)lt的合成發(fā)揮強烈抑制作用，是潛在的RsmA/E下游調(diào)控基因。

3.5 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控Plt生物合成

Plt的生物合成受到多個全局性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控（圖2）。σ因子RpoS負調(diào)控Plt生物合成，管家σ因子RpoD正調(diào)控Plt生物合成[47,48]。氮代謝相關的σ因子RpoN正調(diào)控Plt的生物合成[49]；在假單胞菌Pf-5中突變rpoB基因能提高Plt的產(chǎn)量[50]；TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子PsrA、小RNA伴侶蛋白Hfq、傳感器組氨酸激酶RetS以及全局性轉(zhuǎn)錄因子Vfr負調(diào)控Plt生物合成[51-53]。Lon蛋白酶與假單胞菌毒力因子產(chǎn)生相關，負調(diào)控Plt生物合成[54]。在磷饑餓條件下，PhoR/B促進磷元素的吸收和利用，正調(diào)控Plt生物合成[55]。細菌在受到壓力脅迫時會產(chǎn)生(p)ppGpp信號分子，敲除(p)ppGpp的合成基因RelA和SpoT顯著降低Plt生物合成[56]。

圖2 Plt生物合成調(diào)控機制模式圖Fig. 2 Proposed regulatory network for Plt biosynthesis

3.6 環(huán)境因素影響Plt的產(chǎn)生

Wu等[57]發(fā)現(xiàn)Plt生物合成基因簇在28 ℃比在37 ℃表達量高。除此之外，培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)成分對Plt的合成至關重要，Duffy等[58]發(fā)現(xiàn)在假單胞菌CHA0中Zn2+、Co2+和甘油促進Plt的合成；葡萄糖抑制Plt的合成；100 mmol/L 磷酸鹽會降低 Plt 產(chǎn)量。次生代謝物質(zhì)如 DAPG、Prn在轉(zhuǎn)錄水平上抑制Plt生物合成[59]，Plt自身作為信號分子在轉(zhuǎn)錄水平上提高Plt生物合成基因簇的表達[60]。Matano等[18]發(fā)現(xiàn)環(huán)境中氯離子促進假單胞菌YGJ3產(chǎn)生Plt。Yuan等[16]發(fā)現(xiàn)用2%乙醇作為唯一碳源顯著提高Plt產(chǎn)量，發(fā)酵體系Plt濃度可達150 mg/L。此外，在以果糖或甘露醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中假單胞菌PA1201的Plt產(chǎn)量顯著提高；葡萄糖和琥珀酸顯著抑制Plt生物合成[13]。

4 高產(chǎn)Plt工程菌株構(gòu)建及其應用潛力研究

2011年許煜泉等[61]將M18中pqsR基因敲除后得到基因工程菌株，Plt產(chǎn)量約為150 mg/L，比野生型發(fā)酵效價提高了3～4倍。Yan等[62]將pltR中23種稀有密碼子用同義的優(yōu)選密碼子取代，所得的突變體產(chǎn)生的Plt產(chǎn)量比野生型Pf-5高15倍。Shi等[63]將假單胞菌H78中負調(diào)控Plt的rsmE、lon、pltZ基因以及在pltR轉(zhuǎn)錄起始位點后12～42個堿基敲除，并且過表達Plt轉(zhuǎn)運系統(tǒng)操縱子pltIJKNOP后，Plt產(chǎn)量提高14.3倍，達到214 mg/L。

Plt對馬鈴薯晚疫病、黃瓜霜霉病、水稻胡麻斑病、柑桔潰瘍病有防治效果，能抑制終極腐霉等植物病原菌[10,14]。Hu等[12]發(fā)現(xiàn)Plt對終極腐霉引起的棉花和甜菜立枯病具有很強的防治效果。最近的研究表明Plt可能是人類三陰性乳腺癌藥物發(fā)現(xiàn)的潛在先導化合物[64]。

Zhang等[65]發(fā)現(xiàn)可見光輻射對Plt穩(wěn)定性沒有明顯影響，紫外線輻射大大縮短Plt半衰期至3～4 d，在黑暗中Plt半衰期為25 d。Plt在純水溶液中和室溫下相對穩(wěn)定，半衰期超過20 d，酸性或堿性溶液會加劇其降解。董卉等[66]建立了Plt土壤殘留檢測方法，發(fā)現(xiàn)Plt在地表土壤和根際土壤中的半衰期分別為42.26和32.84 h，表明Plt具有很好的生物安全性和環(huán)境兼容性，但也是Plt無法在土壤中維持長期有效生物防治效果的原因。Chen等[67]利用負載二氧化硅藥物的納米材料制備了生物農(nóng)藥Plt的緩釋配方, 納米結(jié)構(gòu)的二氧化硅與Plt分子狀態(tài)的結(jié)合對于大田應用具有很好的效果，克服了Plt在使用過程中生防功能迅速喪失的難題。

5 結(jié)論與展望

Plt作為一種重要的假單胞菌代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)、生物合成機制和調(diào)控網(wǎng)絡基本明確，在植物病害生物防治中的作用也得到廣泛認可，但Plt相關的基礎與應用研究需要在如下幾方面進一步探究：（1）生物合成機理還需要進一步完善，大部分合成酶的生化功能還有待驗證。（2）合成調(diào)控機制，尤其是PG-Cl2與PltR的結(jié)合如何激活pltL的表達，尚需進一步深入研究。是否還有更多的調(diào)控因子參與Plt基因簇的表達調(diào)控？（3）Plt的產(chǎn)量偏低，目前的“高產(chǎn)”工程菌株Plt發(fā)酵效價無法滿足產(chǎn)業(yè)化要求，導致生產(chǎn)成本高，影響其推廣應用。（4）Plt在土壤環(huán)境中穩(wěn)定性不夠好。可以通過合成生物學手段，引入修飾基因修飾Plt，合成更穩(wěn)定和更高效的新產(chǎn)物。（5）Plt抑制植物病原菌生長的作用機理和作用靶標有待進一步研究。