楊德政 孫光軍 桑維鈞

摘要為獲得能有效抑制煙草赤星病菌的拮抗菌，通過平板對峙法，篩選出一株對煙草赤星病菌有較強(qiáng)抑制作用的生防菌，通過形態(tài)、生理生化特征以及16SrRNA、gyrA序列分析等方法對其進(jìn)行鑒定，并對其生長條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，Y6菌株對煙草赤星病菌有較好的抑制作用，其與貝萊斯芽孢桿菌（BacillusvelezensisLF01）的同源性最高，形態(tài)和生理生化特征與貝萊斯芽孢桿菌基本相符。經(jīng)過測試，Y6菌株的最佳培養(yǎng)條件：溫度30°C、pH6.0、轉(zhuǎn)速180r/min，碳源選擇葡萄糖，氮源選擇酵母膏。該試驗(yàn)結(jié)果可為貝萊斯芽孢桿菌在生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞煙草赤星病;貝萊斯芽孢桿菌;篩選鑒定;生長條件

中圖分類號S435.72文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2021）08-0130-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.034

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening，IdentificationandGrowthConditionOptimizationofanAntagonisticBacteriaStrainY6againstTobaccoBrownSpot

YANGDe-zheng1，SUNGuang-jun2，SANGWei-jun1，3（1.CollegeofTobacco，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025;2.GuizhouBranchofChinaTobaccoCorporation，Guiyang，Guizhou550025;3.GuizhouKeyLaboratoryforTobaccoQualityStudy，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025）

AbstractInordertoobtaintheantagonisticbacteriastrainwhichcouldeffectivelyinhibittobaccobrownspotdisease，thebiocontrolbacteriawerescreenedbygrowthinhibitionmethodonmedium.Isolatedstrainswereidentifiedbymorphological，physiologicalandbiochemicalcharacteristics，aswellas16SrRNAandgyrAsequence.Theirgrowthconditionswereoptimizedafterward.TheresultsshowedthatY6strainhadstronginhibitoryeffectonAlternariatabacionmediumplate，andhadthehighesthomologywithBacillusvelezensisstrainLF01.Itsmorphological，physiologicalandbiochemicalcharacteristicswerebasicallyconsistentwiththatofBacillusvelezensis.TheoptimumcultureconditionsofY6wereasfollows：30°C，pH=6.0，180r/min，carbonsourceglucose，nitrogensoureyeastextract.ThetestresultscanprovidevaluablereferenceforthemassproductionprocessofBacillusvelezensis.

KeywordsTobaccobrownspotdisease;Bacillusvelezensis;Screeningandidentification;Growthcondition

煙草赤星病是由鏈格孢菌屬的幾種真菌（Alternariaspp.）引起的一種病害，主要發(fā)生于煙草生長中后期，是煙草葉片的主要病害之一，具有潛育期短、流行速度快等特點(diǎn)，直接影響煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。赤星病1892年在美國首次被報(bào)道，1916年在我國北京附近發(fā)現(xiàn)后，80年代初我國各大煙區(qū)都出現(xiàn)了此病，給煙草行業(yè)造成了巨大損失[2]。利用生物防治來防治煙草赤星病是一種有效且具有較大發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒?，周棱波等[3]從健康煙葉上分離出了對煙草赤星病病原菌具有較好拮抗作用的短芽孢桿菌B12，其在離體葉片上的防效達(dá)66.7%。馬志遠(yuǎn)等[4]利用平板對峙法從煙草根際土壤和煙草葉圍上篩選出了一株解淀粉芽孢桿菌，其在煙草赤星病菌上抑菌條帶寬度為14.2mm，在用該菌的活性物質(zhì)粗提物與煙草赤星病病原菌孢子液進(jìn)行抑制試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)粗提物對病原菌孢子的萌發(fā)抑制率高達(dá)85.6%。筆者從煙草根際土壤中篩選到了一株對煙草赤星病病原菌有一定拮抗作用的細(xì)菌菌株Y6，通過16SrRNA、gyrA基因序列、形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析，確定其種類，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為評價該菌株是否能成為煙草赤星病生防菌提供參考，同時豐富了防治赤星病的微生物資源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株煙草赤星病病原菌，由貴州大學(xué)煙草學(xué)院桑維鈞教授提供;Y6分離自貴州省遵義市綏陽縣浦場鎮(zhèn)有赤星病嚴(yán)重病害發(fā)生的煙田根際土壤中。

1.2培養(yǎng)基及試劑盒馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），用于赤星病菌的生長培養(yǎng);Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB），用于Y6菌株的分離和培養(yǎng);碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL;氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：優(yōu)化后的碳源5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL。百泰克細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒;PCR引物及反應(yīng)試劑，由生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3拮抗菌的分離將采自上述地點(diǎn)的土樣各取一小部分充分混勻，稱取10g，放入盛有90mL無菌水的250mL三角瓶（有玻璃珠）內(nèi)，放在搖床上充分振蕩（180r/min）靜置后，用移液器吸取1mL土壤懸液加至盛有9mL無菌水的大試管中混勻，即為10-1稀釋液。同樣方法，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6土壤稀釋液。用移液器取200μL的10-4、10-5、10-63個稀釋度的土壤懸液放在LB培養(yǎng)基平板上，用滅過菌的涂布棒涂勻。28℃培養(yǎng)24h，挑出形態(tài)大小不同的單菌落，用平板劃線法純化，移接在新的LB培養(yǎng)基平面上培養(yǎng)及保存。

1.4拮抗菌的篩選拮抗菌的初步篩選利用平板對峙法[5]。在PDA培養(yǎng)基中央接入直徑5mm的煙草赤星病菌菌落，在赤星病菌四周20mm處接待測細(xì)菌，細(xì)菌接種點(diǎn)的位置與赤星病菌相對呈十字形，在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記各菌株編號。28℃培養(yǎng)5d后觀察是否出現(xiàn)抑制效果。復(fù)篩采用上述同樣方法，培養(yǎng)5d后觀察抑菌效果。

1.5拮抗菌的鑒定

1.5.1形態(tài)特征和生理生化特征。用平板劃線法將菌種接種于平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，按常規(guī)方法觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、表面、凹凸度、透明程度和菌落及培養(yǎng)基顏色等），并進(jìn)行革蘭氏染色。

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第9版）[7]對菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括碳源利用、葡萄糖氧化發(fā)酵、硝酸鹽還原、甲基紅、V.P試驗(yàn)、淀粉水解反應(yīng)、明膠液化反應(yīng)測定、H2S的產(chǎn)生等試驗(yàn)。

1.5.216SrDNA序列分析。采用百泰克細(xì)菌基因組DNA提試劑盒提取，使用細(xì)菌16SrDNA通用引物[8]27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各1μL，12.5μL2×PCRMastermix，9.5μLddH2O，1μLDNA模板，共計(jì)25μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃5min，94℃30s，54℃退火30s，72℃90s，35個循環(huán)，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST相似序列檢索比對，將待測拮抗菌確定到屬。

1.5.3gyrA序列分析。采用前一步提取的DNA，使用gyrA引物[8]gyrA-5P（5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′）、gyrA-3P（5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同“1.5.2”。PCR擴(kuò)增程序：94℃5min，94℃30s，53℃退火30s，72℃90s，35個循環(huán)，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后進(jìn)行Sanger測序。從NCBI的GenBank下載芽孢桿菌屬的gyrA序列6條，以鏈球菌（Streptococcus）作為外祖，采用mega7.0軟件進(jìn)行Muscle多序列同源性分析，并通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6種子液的制備將篩選出的拮抗菌接種至LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，30℃、180r/min下培養(yǎng)24h待用。

1.7生長曲線測定將液體種子液按1%的接種量接入裝有100mLLB培養(yǎng)液的三角瓶中，在30℃、180r/min下培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，測定600nm的光密度值（OD600）。

1.8拮抗菌生長條件優(yōu)化

1.8.1不同溫度對拮抗菌生長的影響。將種子液按照1%的接種量接種于100/250mL的LB培養(yǎng)液（pH7.0）中，分別放置于不同溫度（20、25、30、35、40℃）的恒溫培養(yǎng)箱（180r/min）培養(yǎng)，以不加種子液的LB培養(yǎng)液為對照，每個處理重復(fù)3次，24h后測定其在波長600nm下的OD值。

1.8.2不同pH對拮抗菌生長的影響。將滅菌后的LB液按每瓶100mL裝入三角瓶中（250mL），分別將pH調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11。將菌懸液按1%接種量接種于不同pH的培養(yǎng)液中，按上一步試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整恒溫振蕩培養(yǎng)箱溫度，恒溫振蕩培養(yǎng)（180r/min），24h后測定其在波長600nm下的OD值，以不加種子液的LB培養(yǎng)液為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.8.3不同轉(zhuǎn)速對拮抗菌生長的影響。以上述2步的結(jié)果調(diào)整LB培養(yǎng)液的pH及培養(yǎng)箱的溫度，將種子液按照1%的接種量接種于調(diào)制好的pH培養(yǎng)液中，分別放入不同轉(zhuǎn)速150、180、210r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，測定其在波長600nm下的OD值，以不加種子液的LB培養(yǎng)液為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.8.4不同碳源對拮抗菌生長的影響。將不同碳源（麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇）按照10g/mL加入碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按照上述三步的結(jié)果調(diào)整培養(yǎng)液pH與振蕩培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)速，將菌懸液以1%的接種量分別接種于滅好菌的碳源培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，以不加種子液的碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對照，每個處理重復(fù)3次，24h后測定其在波長600nm下的OD值。

1.8.5不同氮源對拮抗菌生長的影響。將不同的碳源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米粉）按照10g/mL加入氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按照上述三步的結(jié)果調(diào)整培養(yǎng)液pH、振蕩培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、碳源，將種子液以1%的接種量分別接種于滅好菌的氮源培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)，以不加種子液的氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對照，每個處理重復(fù)3次，24h后測定其在波長600nm下的OD值。

1.9數(shù)據(jù)處理采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)單因素方差分析法的Duncans新負(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05），利用MicrosoftExcel2010軟件進(jìn)行作圖。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌的篩選通過初篩獲得21株具有拮抗作用的菌株，對這21株菌進(jìn)行復(fù)篩后，有6株菌對煙草鏈格孢有一定的抑制作用。其中Y6對煙草鏈格孢菌的抑制作用明顯，故對Y6進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2拮抗細(xì)菌種類鑒定

菌株Y6在LB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h后，菌落為乳白色，呈圓形，直徑在0.35～0.55cm，表面有褶皺，中間部分凹陷呈火山狀，邊緣為鋸齒狀，不透明（圖1）。生理生化結(jié)果見表1。

以此菌株的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物長度約在1000bp，菌株的16SrDNA、gyrA序列經(jīng)測定，分別為1076和1001bp。

將該16SrDNA序列進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列與芽孢桿菌屬菌株具有較高的相似率，能夠確定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus.sp），但不能根據(jù)BLAST確定到種。

為了確定Y6的種，首先將Y6菌株的gyrA序列于GenBank中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明，該序列與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）具有非常高的相似性。然后利用從GenBank中下載的7條序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果表明Y6菌株與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）的菌株LF01（CP058216）在同一分支上，該分支可信度為90%，與其他幾個種，如16SrDNA的Blast結(jié)果不能區(qū)分的解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）都有一定距離。

2.3菌株Y6生長曲線

Y6菌株的生長曲線見圖3，接入LB培養(yǎng)基10h后該菌株的OD600快速上升，進(jìn)入對數(shù)生長期，18～20h為對數(shù)期末期，OD600達(dá)到最大，20h后菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，OD600基本穩(wěn)定。由此可知，該菌生長速度較快，接種培養(yǎng)18h后達(dá)到最大。

2.4菌株Y6的生長條件優(yōu)化

2.4.1不同溫度對Y6菌株生長的影響。由圖4可知，溫度在20～35℃時，Y6菌株的OD600均能達(dá)到2，說明長勢較好。其中，在溫度30℃時OD600顯著高于其他溫度，說明該溫度最適宜Y6菌株生長。

2.4.2不同pH對Y6菌株生長的影響。由圖5可知，在培養(yǎng)溫度為30℃時，在參加測試的pH范圍內(nèi)，在pH5～8時，Y6菌株可以生長，OD600均能達(dá)到2，pH為3、4、9、10時菌株幾乎不能生長，OD600接近于0，其中，pH6時生長最好，增減pH其OD600顯著降低。

2.4.3不同轉(zhuǎn)速對Y6菌株生長的影響。由圖6可知，在30℃、pH6的條件下，培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為180r/min時OD600顯著高于150和210r/min，因此，180r/min是最適應(yīng)Y6菌株的培養(yǎng)條件。

2.4.4不同碳源對Y6菌株生長的影響。由圖7可知，麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇均能被Y6菌株利用，其中葡萄糖的利用率最高，OD600達(dá)3.04，且顯著高于其他4種，麥芽糖與甘露醇次之，果糖的利用率最低，OD600為1.3，且顯著低于其他。

2.4.5不同氮源對Y6菌株生長的影響。由圖8可知，參與測試的4種氮源，Y6菌株能夠較好地利用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏3種，其中酵母膏的利用率最高，OD600達(dá)3.18，且顯著高于其他，牛肉膏次之，基本不能利用玉米粉生長，OD600接近于0。

3結(jié)論與討論

拮抗細(xì)菌在植物病害的生物防治中起著非常重要的作用。其中芽孢桿菌具有較高的生防潛力，所產(chǎn)生的芽孢有耐熱抗逆的特性，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工和菌種在工業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境中存活，是植物病害生防微生物的重要組成部分[9]。

貝萊斯芽孢桿菌是2005年由Ruiz-Garcia等[10]新命名的芽孢桿菌屬的一個新種。貝萊斯芽孢桿菌能通過產(chǎn)生抗菌蛋白[11]、脂肽類抗生素[12]等物質(zhì)來抑制病菌。研究表明貝萊斯芽孢桿菌對棉花黃萎病菌[11]、白菜黑斑病菌[13]、香蕉枯萎病菌[14]、西瓜枯萎病菌[15]等有拮抗作用。此外，還發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌能促進(jìn)胡椒、馬鈴薯、蘿卜、南瓜、番茄、蘿卜、芝麻等作物的生長[16]。

該研究從煙田土壤分離得到對煙草赤星病有抑菌效果的Y6菌株，根據(jù)形態(tài)和生理生化特征，結(jié)合16SrDNA、gyrA2個位點(diǎn)序列的比對確定為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。經(jīng)過測試，Y6菌株的最佳培養(yǎng)條件為溫度30℃、pH6、轉(zhuǎn)速180r/min，Y6菌株能利用多種碳源和氮源，其中碳源為葡萄糖、氮源為酵母膏時生長最好。碳源利用的結(jié)果與羅楚翔等[17]的研究中碳源蔗糖最優(yōu)，葡萄糖其次的結(jié)果不同，可能是因?yàn)樨惾R斯芽孢桿菌株菌之間的個體差異造成的。在氮源利用的試驗(yàn)中，Y6菌株在玉米粉為氮源的培養(yǎng)液中幾乎不能生長，這可能是因?yàn)榧尤胗衩追酆螅囵B(yǎng)液濃度過高，阻礙了菌株的生長。

該試驗(yàn)結(jié)果為烤煙赤星病的綠色防控提供了新的選擇，相關(guān)培養(yǎng)條件也是普通生產(chǎn)條件下能達(dá)到的，為該菌株的生產(chǎn)工藝提供了參考數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步研究菌株抑制的作用機(jī)制、活性物質(zhì)的提取及實(shí)際防治效果奠定了基礎(chǔ)。

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