張立田 徐淑媛 李藝 王雪松 董李學(xué) 李愛軍 王磊

摘要：[目的]利用高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-QTOF/MS）技術(shù)，建立飼料中35種有機(jī)磷類藥物的快速篩查方法。[方法]飼料樣品經(jīng)乙腈-0.2%甲酸溶液提取，QuEChERS方法凈化，建立了35種分析物的數(shù)據(jù)庫。目標(biāo)藥物經(jīng)WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm）分離，在正離子模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，可在7min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對35種殺蟲劑藥物的良好分離。[結(jié)果]在10、50、100μg/kg添加濃度下的回收率為80.87%～114.21%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.69%～11.65%（n=6），方法定量限（LOQ，S/N=10）為0.2～0.5μg/kg，在5～100μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性（R2≥0.9984）。結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)、保留時間和同位素峰形匹配度對目標(biāo)化合物進(jìn)行快速篩查與確證。[結(jié)論]該方法快速簡便、準(zhǔn)確、靈敏度較高，適用于飼料中有機(jī)磷類藥物殘留的高通量篩查與定性鑒定。

關(guān)鍵詞：QuEChERS;飼料;有機(jī)磷類藥物;高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜

中圖分類號S816.17文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2021）08-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.052

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

ScreeningandDeterminationof35OrganophosphorusDrugsinFeedbyQuEChERSMethodCombinedwithPerformanceLiquidChromatography-Time-of-FlightMassSpectrometry

ZHANGLi-tian1，2，3，XUShu-yuan1，2，3，LIYi1，2，3etal

（1.TangshanFoodandDrugComprehensiveTestingCenter，Tangshan，Hebei063000;2.HebeiAgriculturalProductsQualityandSafetyTestingInnovationCenter，Tangshan，Hebei063000;3.TangshanInstituteofIndustrialTechnologyforFunctionalAgriculturalProducts，Tangshan，Hebei063000）

Abstract[Objective]Acomprehensiveanalyticalmethodwasestablishedforthesimultaneousdeterminationof32organophosphatesinfeedbyperformanceliquidchromatography-quadrupoletime-of-flightmassspectrometry（HPLC-QTOF/MS）.[Method]Theanalytesinfeedsampleswereextractedwithacetonitrilecontaining0.2%formicacid.TheextractswerecleanedupthroughQuEChERSmethodandadatabasefor35targetanatyteswasestablished.ThetargetcompoundswereseparatedonanWatersACQUITYUPLCHSST3columnanddetectedbyMSinDualAJSESI+mode.The35pesticidescouldbeseparatedin7min.[Result]Therecoveriesof35pesticideswere85.98%-114.21%andRSDwas0.58%-11.65%attheconcentrationsof10，50and100μg/kg.Thequantitativelimitoftheexperimentalmethodwas0.2-0.5μg/kgandallthepesticidestobetestedwereinthecalibrationcurvesrangeof5-100μg/Lwithshowedagoodlinearity（R2≥0.9984）.Theprecisionmass，retentiontimeandisotopicmatched-degreewereemployedforthescreeningandconfirmation.[Conclusion]Themethodisfast，simple，accurate，andhighlysensitive，andissuitableforhigh-throughputscreeningandqualitativeidentificationoforganophosphorusdrugresiduesinfeed.

KeywordsQuEChERS;Feed;Organophosphatesdrugs;Performanceliquidchromatography-time-flight-massspectrometry（HPLC-QTOF/MS）

有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效、低毒和生物降解快的特點(diǎn)，因而被廣泛用于糧食、棉花、蔬菜、果樹等作物的害蟲防治。但是殺蟲劑藥物在動物產(chǎn)品中的殘留不僅危害到消費(fèi)者的身體健康，對人體產(chǎn)生諸如具有致突變性和潛在的致癌性等毒副作用，引起細(xì)菌耐藥性的增加，而且同時影響我國畜禽產(chǎn)品的出口貿(mào)易[1-4]。為了保護(hù)人民的身體健康，從源頭進(jìn)行控制的有效手段，因此研究飼料中有機(jī)磷藥物的檢測方法具有重要的意義。

針對飼料中有機(jī)磷類藥物的檢測手段比較單一，測定飼料中有機(jī)磷藥物殘留的HPLC法、GC-MS法、SDME-GC-MS法、LC-MS法、HPLC-MS/MS等分析方法已經(jīng)不適用實(shí)際樣

品快速篩查的需要。高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-QTOF/MS）法具有更強(qiáng)的分離能力、樣品通量和靈敏度，可以提供母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，準(zhǔn)確推算可能的分子式，從而進(jìn)一步對化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證[5-11]。該試驗利用HPLC-QTOF/MS技術(shù)，建立了35種有機(jī)磷類藥物的飼料樣品前處理方法和質(zhì)譜特征數(shù)據(jù)庫，采用FullScan/MSE模式進(jìn)行掃描測定，不僅提高了有機(jī)磷類藥物殘留的快速篩查的可靠性，同時可以獲得較高靈敏度的定量結(jié)果，從而為飼料樣品的快速高通量篩查提供準(zhǔn)確、可靠的方法。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

TripleTOF5600MS儀（配有電噴霧離子源），美國ABSCIEX公司;SiO-6512全自動前處理設(shè)備，本立科技公司;SZ13022-NY0.2μm有機(jī)濾膜，天津市領(lǐng)航實(shí)驗設(shè)備股份有限公司;T-200電子天平，常熟雙杰儀器制造廠;FY-DCY96S氮?dú)鉂饪s儀，上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司;Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.2材料與試劑

青貯玉米。甲酸（UV-HPLC級）、乙腈（UV-HPLC級）、甲酸銨，純度>99.0%，Dikma公司;無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸氫二鈉、檸檬酸鈉、N-丙基乙二胺（PSA）、氧化鋯珠（R104）和雙層提取凈化管（V50），均購于本立科技公司;去離子水（自制）;敵敵畏、樂果、氧樂果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、除線磷、辛硫磷、三唑磷、二嗪磷、地蟲硫磷、殺螟松、丙溴磷、乙硫磷、蠅毒磷、甲胺磷、治螟磷、久效磷、對硫磷、殺撲磷、地胺磷、伏殺硫磷、磷銨、馬拉硫磷、水胺硫磷、喹硫磷、硫環(huán)磷、敵百蟲、甲基異柳磷、稻豐散、亞胺硫磷、滅線磷、甲基對硫磷、特丁硫磷，100μg/mL，純度995%，天津阿爾塔科技有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1樣品前處理。

準(zhǔn)確稱取2.0g飼料樣品于離心管外管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置30min，加入10mL乙腈和10mL水，加入萃取鹽包（內(nèi)含5.5g無水硫酸鎂、1.5g氯化鈉、0.5g檸檬酸氫二鈉、1.0g檸檬酸鈉）及10顆鋯珠，擰緊內(nèi)管（內(nèi)含4mm氧化鋯珠5粒、100mgPSA、600mg無水硫酸鎂、100mgC18）后放入自動QuEChERS前處理儀器中開始處理，經(jīng)25min交替振蕩離心后，從內(nèi)管中取凈化液過0.22μm的有機(jī)微孔濾膜，濾液供HPLC-QTOF/MS測定。

1.3.2色譜-質(zhì)譜分析條件。

1.3.2.1

色譜條件。流動相A為0.1%（V/V）甲酸+2mmol/L甲酸銨的水溶液，B為0.1%甲酸+2mmol/L甲酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫：0～0.5min，5%B;0.5～1.0min，30%B;1.0～10.0min，95%B;10.0～13.0min，5%B。進(jìn)樣量5μL;流速0.3mL/min;柱溫40℃;樣品溫度10℃;WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm）。

1.3.2.2

質(zhì)譜條件。正離子采集模式;離子源溫度500℃;電噴霧電壓5.5kV;氣簾氣壓力241.32kPa;掃描模式FullScan/MSE，采集范圍m/z80～1000，采集時間0.75s，采集間隔時間10s。

1.4篩查數(shù)據(jù)庫的建立

取合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至1μg/mL，在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件下，先進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)化合物的保留時間、質(zhì)子化的分子質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量誤差等信息。在不同的碰撞電壓下再進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)化合物的二級全掃描圖及質(zhì)譜碎片信息，以此建立35種殺蟲劑類藥物的篩查譜庫。篩查譜庫中還包含藥物的英文名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式、理論分子量、保留時間以及同位素峰型匹配度等信息。根據(jù)譜庫信息可對樣品中目標(biāo)化合物進(jìn)行篩查確證。

2結(jié)果與分析

2.1色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1色譜條件。

試驗選用WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱分析，考察了0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、2mmol/L甲酸銨-乙腈、2mmol/L甲酸銨-甲醇和0.1%甲酸+2mmol/L甲酸銨-甲醇5種流動相對殺蟲劑類的分離、離子化效應(yīng)和峰形的影響。甲酸銨體系可以獲得較低的背景值，但殺蟲劑類藥物響應(yīng)較低，影響檢測靈敏度。采用甲酸體系時，背景值有所升高，但35種目標(biāo)藥物的響應(yīng)有所增強(qiáng)。與乙腈相比，甲醇作為流動相可以獲得更好的分離度。綜合分析，試驗采用0.1%甲酸+2mmol/L甲酸銨-甲醇作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，7min內(nèi)實(shí)現(xiàn)35種目標(biāo)分析物的基線分離。目標(biāo)分析物在溶劑中的總離子流色譜圖如圖1所示。

2.1.2質(zhì)譜條件。

有機(jī)磷類藥物均含有易于和H+結(jié)合的帶有孤對電子的O原子，適合在ESI源的正離子模式下離子化，其準(zhǔn)分子離子為[M+H]+?？疾炝穗妵婌F電壓、氣簾氣壓力、碰撞能和離子源溫度等因素的影響。離子源溫度500℃、電噴霧電壓5.5kV和氣簾氣壓力241.32kPa時，目標(biāo)化合物的響應(yīng)較強(qiáng)。高分辨Q-TOF質(zhì)譜在FullScan/MSE模式下能同時完成在低能通道以母離子為定量離子，又能實(shí)現(xiàn)在高能通道全范圍二級質(zhì)譜的掃描，有助于樣品的快速篩查和定量分析。

2.2線性關(guān)系、精密度和回收率

以空白飼料樣品制備濃度為5、10、20、40、80、100μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以各組分的峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程、線性范圍和決定系數(shù)（R2），以10倍信噪比（S/N=10）估算定量限（LOQ），具體結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，35種有機(jī)磷類藥物的LOQ為0.2～0.5μg/kg，在5～100μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.9984）。

利用空白飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，分別對低（10μg/kg）、中（50μg/kg）、高（100μg/kg）3個添加水平按照“1.3.1”方法處理，每個濃度水平做6份平行樣品，結(jié)果見表2。由表2可知，低加標(biāo)水平下，殺蟲劑類藥物的平均回收率>80%，RSD<12%;中、高加標(biāo)水平下，有機(jī)磷類藥物的平均回收率>86%，RSD<9%。表明有機(jī)磷類藥物在低濃度水平受基質(zhì)干擾較大;在中、高濃度水平重現(xiàn)性較好，方法準(zhǔn)確可靠。

2.3數(shù)據(jù)庫的建立與篩查

在最佳的色譜-質(zhì)譜條件下，對每一種目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行FullScan/MSE掃描，基于HPLC-QTOF/MS的高通量篩查研究，采用MasslynxChromlynx軟件建立了有機(jī)磷類藥物的高通量篩查數(shù)據(jù)庫，其包括目標(biāo)化合物的分子式、精確分子量、保留時間和同位素峰形匹配度等信息（表3），通過比對以上信息，所有35種目標(biāo)化合物的保留時間偏差均<±0.01min，質(zhì)量偏差均<±4mDa，同位素峰形匹配度>90%。

2.4實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用該研究建立的HPLC-QTOF/MS的高通量篩查方法，隨機(jī)抽取20份飼料樣品進(jìn)行檢測，采集一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)、保留時間和二級碎片信息對樣品中35種有機(jī)磷類藥物定性篩查同時定量，均未檢出陽性樣品。

3結(jié)論

該研究建立了HPLC-QTOF/MS測定飼料中35種有機(jī)磷類藥物的檢測方法和目標(biāo)化合物的數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。在10、50、100μg/kg添加濃度下的回收率為8087%～114.21%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.69%～11.65%（n=6），方法定量限（LOQ，S/N=10）為0.2～0.5μg/kg，在5～100μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性（R2≥0.9984）。該方法具有簡便高效快速、選擇性好、靈敏準(zhǔn)確等特點(diǎn)，滿足測定大量飼料樣品中有機(jī)磷類藥物的快速、定量的需求，適用于飼料中有機(jī)磷類藥物的同時定性篩查和定量分析。

參考文獻(xiàn)

[1]韓俊艷，張立竹，紀(jì)明山.植物源殺蟲劑的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（21）：229-233.

[2]林璐璐，鐘永志，張光玲，等.6種藥劑對安徽省草地貪夜蛾的防治效果[J].農(nóng)藥，2020，59（7）：528-531，546.

[3]宋潔蕾，李艷麗，李亞紅，等.不同殺蟲劑對草地貪夜蛾的室內(nèi)毒殺效果及毒力測定[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，50（7）：1489-1495.

[4]邵仁志，劉小安，孫蘭，等.中國植物源農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（8）：1401-1405.

[5]姚鳳花，馮永巍.高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法快速檢測飼料中多種β-受體激動劑[J].糧食與飼料工業(yè)，2013（1）：62-64.

[6]貢松松，顧欣，曹慧，等.超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查生鮮牛乳中的14種磺胺類藥物[J].分析測試學(xué)報，2014，33（12）：1342-1348.

[7]孟哲，石志紅，呂運(yùn)開，等.超高效液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查乳制品中磺胺類與氟喹諾酮類藥物[J].分析化學(xué)，2014，42（10）：1493-1500.

[8]HERNNDEZF，PORTOLST，IBEZM，etal.Useoftime-of-flightmassspectrometryforlargescreeningoforganicpollutantsinsurfacewatersandsoilsfromariceproductionareainColombia[J].Scienceofthetotalenvironment，2012，439：249-259.

[9]孫雷，畢言鋒，張驪，等.飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2009，43（7）：37-40.

[10]吳煒亮，李曉明，朱文亮，等.飛行時間質(zhì)譜技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用[J].食品與機(jī)械，2015，31（3）：236-241.

[11]孫秉康，李曉毓，寧雪雪，等.四極桿-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（9）：76-77.