劉曼玉，趙萬里，劉吉華

(中國藥科大學 江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室，江蘇 南京 211198)

河谷地不容(StephaniaintermediaLo)為防己科千金藤屬植物，含有多種類型的芐基異喹啉類生物堿(Benzylisoquinoline alkaloids，BIAs)，如具有鎮(zhèn)痛作用的四氫巴馬汀及紫堇達明、抗菌藥效的小檗堿及抗腫瘤作用的金黃紫堇堿等[1-5]。目前BIAs主要從藥用植物中提取獲得，多為微量成分，自然資源有限，如紫堇達明在河谷地不容中的含量僅為0.038～3.42mg/g[6]。此外，BIAs具有稠環(huán)結構且多數化合物具有手性中心，該類化合物化學合成路線復雜、手性拆分困難且對環(huán)境不友好。因此BIAs的來源嚴重制約其進一步的開發(fā)和臨床應用。

合成生物學的迅速發(fā)展為天然藥效物質的生物技術制備提供了新的策略，解析高活性天然成分的生物合成途徑及其關鍵酶是實現異源生物合成的基礎。課題組前期對河谷地不容中BIAs生物合成途徑下游的部分甲基轉移酶進行了鑒定和功能驗證[7]，但是河谷地不容中BIAs生物合成途徑上游的關鍵酶還有待闡明。甲基轉移酶可將供體S-腺苷L-蛋氨酸的甲基轉移至受體上，從而形成S-腺苷-L-同型半胱氨酸和甲基化分子[8-9]。甲基化在植物次生代謝中起著中心作用，它能引導中間體進入特定的生物合成途徑[10-11]。O-甲基轉移酶參與生物堿生物合成后的甲基化修飾過程，極大豐富了生物堿的種類。

多數BIAs共用一個上游合成途徑，如嗎啡、小檗堿、血根堿[12]。這幾種生物堿共同的生源合成途徑以酪氨酸為前體物質，經過多步酶催化反應生成這些化合物的一個共同中間體牛心果堿。去甲烏藥堿6-O-甲基轉移酶(norcoclaurine 6-O-methyltransferase，6OMT)是BIAs生物合成中催化發(fā)生甲基化的第一個酶，催化去甲烏藥堿的C-6位羥基的甲基化[12]；3′羥基-N-甲基烏藥堿4′-O-甲基轉移酶(3′-hydroxy-N-methylcoclaurine-4′-O-methyltransferase，4′OMT)催化3′羥基-N-甲基烏藥堿產生牛心果堿。前期研究發(fā)現S.intermedia含有豐富而重要的生物堿，因此研究其生物合成途徑及其調控具有重要意義。以S.intermedia為材料，克隆獲得3個O-甲基轉移酶基因Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2(Si表示基因來源于S.intermedia)，對3個O-甲基轉移酶基因進行生物信息學相關分析，并分別構建至表達載體pGEX-6P-1中表達蛋白，為BIAs合成途徑解析及異源合成積累一定的科學數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

河谷地不容材料來自江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室。

1.1.2 質粒和菌株

試驗中主要質粒和菌株如表1所示。

表1 試驗所用質粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this experiment

1.1.3 試劑

氨芐青霉素購自大連美侖生物技術有限公司；考馬斯亮藍快速染液購自上海碧云天生物技術有限公司；ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)試劑盒、HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR mix (2 × Easy Taq mix)購自北京全式金生物技術有限公司；Gflex DNA polymerase購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)為BioSHARP公司產品；植物RNA試劑盒、質粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒為Omega Bio-tek公司產品；LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基為Mdbio Inc公司產品。

1.1.4 試驗儀器

PCR儀(Bio-Rad T100 Thermal Cycler，美國)、電泳系統(Bio-Rad 1645050，美國)、凝膠成像儀(Bio-Rad Universal Hood Ⅱ，美國)；微量分光光度計(Nanodrop100，博克科技有限公司)；超聲波細胞粉碎儀(JY92-ⅡDN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；恒溫搖床(HYL-C，太倉市強樂實驗設備廠)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

課題組前期對河谷地不容的塊根和葉組織部位進行轉錄組從頭測序，通過生物信息學分析，挖掘出參與BIAs合成的基因序列Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2。采用植物RNA試劑盒提取樣品總RNA，并對提取的RNA進行逆轉錄成cDNA，根據cDNA序列設計引物，如表2。采用PCR對cDNA和載體質粒進行擴增(反向擴增的質粒)PCR反應程序：預變性94℃，1 min；變性98℃，10 s；退火57℃，15 s；延伸68℃，1 min；30循環(huán)；后延伸68℃，10 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行檢測，切膠回收DNA片段。利用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(C115)試劑盒進行同源重組構建質粒，并利用熱擊法將重組液轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，經菌落PCR鑒定后挑選陽性單克隆進行測序, PCR反應條件：94℃預變性，5 min；94℃變性，30 s；55℃退火，30 s；72℃延伸，1 min；30個循環(huán)次數；72℃后延伸，10 min。

表2 河谷地不容O-甲基轉移酶基因擴增所用引物Table 2 Primers for amplification of O-methyltransferasegenes in S. intermedia

1.2.2 生物信息學分析

使用NCBI數據庫中的ORF Finder查找該基因的開放閱讀框；用Blast程序將3個甲基轉移酶基因編碼的氨基酸序列在GenBank中進行同源性搜索；用Conserved domain finder程序分析3個基因保守結構域；利用DNAMAN軟件對不同來源的O-甲基轉移酶氨基酸序列進行多重比對[13-14]；利用EXPASY在線工具預測蛋白的理化性質。利用MEGA.5軟件，以鄰接算法，每個分支的自舉頻率基于1 000次迭代構建系統發(fā)育樹[15-16]。用于構建系統發(fā)育樹的酶的信息見表3。表格中縮寫如下：金黃紫堇堿9-O-甲基轉移酶(scoulerine 9-O-methyltransferase，SOMT)、非洲防己堿-O-甲基轉移酶(columbamineO-methyltransferase，CoOMT)、牛心果堿-7-O-甲基轉移酶(reticuline 7-O-methyltransferase，7OMT)、兒茶酚-O-甲基轉移酶(catecholO-methyltransferase，CaOMT)、O-甲基轉移酶(O-methyltransferase，OMT)、去甲牛心果堿-7-O-甲基轉移酶(norreticuline-7-O-methyltransferase，N7OMT)。

表3 構建系統發(fā)育樹所用氨基酸序列信息Table 3 Amino acid sequence information usedto construct phylogenetic tree

1.2.3 蛋白的原核表達

從E.coliDH5α菌株中抽提質粒，并分別轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于抗性平板上，過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，接入5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)過夜得種子液。將種子液按1%接種量接種至50 mL含有1‰氨芐青霉素抗性的TB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)3.5 h(OD600=0.6～0.8)，加入終濃度為0.1 mM IPTG誘導表達，16℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.2.4 表達蛋白的可溶性檢測

取100 mL誘導完畢的菌液分次加入50 mL離心管中，6000 ×g,離心3 min棄上清，沉淀用10 mL pH=7.4 buffer重懸，超聲破碎。取100 μL破碎液，12 000 ×g離心5 min，吸取80 μL。沉淀加入1 mL ddH2O重懸離心棄上清，再以80 μL ddH2O重懸。上清和沉淀分別加入20 μL 5×loading buffer，100℃煮沸5 min。制備好的蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后進行凝膠成像。

2 結果與分析

2.1 目的片段的擴增

采用PCR從河谷地不容cDNA中擴增出3個O-甲基轉移酶基因，Si4′OMT基因全長948 bp，其中開放閱讀框為933 bp，編碼311個氨基酸；Si6OMT1基因全長1032 bp，其中開放閱讀框為1029 bp，編碼343個氨基酸；Si6OMT2基因全長1080 bp，其中開放閱讀框為1062 bp，編碼354個氨基酸。圖1結果顯示PCR克隆得到的條帶大小與目的基因序列大小一致，條帶經切膠回收，用于后續(xù)克隆。

2.2 重組質粒的構建

采用同源重組克隆技術將目的基因與載體連接，重組液通過感受態(tài)細胞轉化，再經過氨芐青霉素抗性平板篩選，獲得陽性單菌落。以pGEX5′/pGEX3′引物對挑取的單菌落進行菌落PCR鑒定，電泳圖如圖2。從菌落PCR結果可以判斷目的片段已成功插入至表達載體的克隆位點上，陽性菌落接入LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，取陽性菌液送公司測序，經比對序列正確。

圖1 PCR擴增三個甲基轉移酶基因Fig. 1 PCR amplification of three methyltransferase genes注：M為2K Marker；1-1和1-2為Si4′OMT；2-1和2-2為Si6OMT1；3-1和3-2為Si6OMT2

圖2 陽性單克隆的菌落PCR鑒定Fig. 2 PCR identification of positive monoclonal colonies注：M為2K Marker；1-1至1-5為Si4′OMT；2-1至2-5為Si6OMT1；3-1至3-5為Si6OMT2

2.3 生物信息學分析

2.3.1 氨基酸序列的比對

Si4′OMT基因編碼的氨基酸序列與其他植物來源的氨基酸序列的同源性達到60%～70%；Si6OMT1基因編碼的氨基酸序列與蓮花(Nelumbonucifera)的氨基酸序列相似性最高，可達到72.97%；Si6OMT2基因編碼的氨基酸序列與其他植物來源的氨基酸序列的同源性較低，僅達到50%～60%，結果見表4、表5和表6。經蛋白保守域分析可知，3個O-甲基轉移酶都含有二聚化結構域，屬于S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉移酶超家族(S-adenosylmethionine(AdoMet or SAM)-dependent methyltransferase superfamily, AdoMet_MTases superfamily)。

表4 Si4′OMT與不同植物4'OMT氨基酸的同源性比對Table 4 Homology comparison of amino acids betweenSi4′OMT and 4'OMT in different plants

表5 Si6OMT1與不同植物6OMT氨基酸的同源性比對Table 5 Homology comparison of amino acids betweenSi6OMT1 and 6OMT in different plants

表6 Si6OMT2與不同植物6OMT氨基酸的同源性比對Table 6 Homology comparison of amino acids betweenSi6OMT2 and 6OMT in different plants

2.3.2 蛋白理化性質的分析

為進一步研究3個O-甲基轉移酶基因的功能提供理論依據，采用EXPASY在線工具對Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2的基本性質進行分析(表7)。Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2中只有Si6OMT1穩(wěn)定；經過親水性分析，Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2的GRAVY值均為負值，即3個蛋白均為親水性蛋白；通過跨膜分析可知，Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2都沒有跨膜區(qū)。

表7 三個甲基轉移酶蛋白質序列的基本特性Table 7 The basic properties of the proteinsequence of three methyltransferases

2.3.3 系統進化樹的分析

通過構建系統進化樹可以發(fā)現，Si4′OMT形成獨立的進化分支，Si6OMT1與來自于S.tetrandra的St6OMT2聚類成同一個進化支。Si6OMT2與來源于S.tetrandra的St6OMT4聚類成同一個進化支，結果如圖3。

圖3 甲基轉移酶系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of methyltransferases注：黑色圓圈標記為克隆的3個O-甲基轉移酶，每個進化枝的自舉頻率基于1 000次迭代。

2.4 工程菌株的誘導與表達

將重組質粒導入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中進行蛋白表達，由于重組蛋白融合了GST標簽，重組后實際蛋白大小應加上GST標簽的分子量(約26 KDa)。通過計算，Si4′OMT、Si6OMT1、Si6OMT2的蛋白分子量分別約為61.0 KDa、63.9 KDa、65.7 KDa。與空載體蛋白對照相比，3個蛋白的上清部分有明顯的條帶(如箭頭所指)，說明3個蛋白形成可溶性表達(圖4)。

3 討論與結論

前期研究發(fā)現6OMT催化的反應是生物堿合成過程中的關鍵限速步驟之一[17-18]，將源于日本黃連的6OMT基因導入加州罌粟培養(yǎng)細胞中，過表達6OMT的培養(yǎng)細胞產生的生物堿平均含量是野生型細胞的7.5倍[17]。4′OMT也是BIAs生物合成的關鍵酶，過表達日本黃連中4′OMT基因，使小檗堿的產量增加1.5倍[19]。最近的研究顯示，可從黃連(Coptischinensis)[20]、粉防己(Stephaniatetrandra)[18]等植物中克隆獲得6OMT基因，從蓮花(Nelumbonucifera)[21]中克隆獲得4′OMT基因，為研究BIAs合成途徑及異源合成提供材料。

圖4 重組蛋白SDS-PAGE檢測結果Fig. 4 Results of recombinant protein in SDS-PAGE注：M為marker；泳道1為pGEX-6P-1(載體對照)沉淀；泳道2為pGEX-6P-1(載體對照)上清；泳道3為Si4′OMT沉淀；泳道4為Si4′OMT上清；泳道5為Si6OMT1沉淀；泳道6為Si6OMT1上清；泳道7為Si6OMT2沉淀；泳道8為Si6OMT2上清

O-甲基轉移酶參與BIAs類生物堿生物合成的后修飾，生物堿結構上加甲基會對其化學性質產生重要影響，從而改變其生物活性。河谷地不容中含豐富的BIAs類活性成分，塊根和葉中基本涵蓋四氫原小檗堿類生物堿生物合成的主要中間體，且四氫巴馬汀和紫堇達明的含量相比于同科屬其他藥用植物高[6]，推測河谷地不容中可能存在高活性的O-甲基轉移酶，因此對其合成通路中的酶進行解析有重要意義。

以河谷地不容為材料，克隆獲得3個O-甲基轉移酶基因Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2，分別編碼311、343、354個氨基酸，生物信息學分析發(fā)現，3個基因都含有二聚化結構域，屬于AdoMet_MTases超家族，且Si6OMT1蛋白相對于Si4′OMT和Si6OMT2更穩(wěn)定。Si6OMT1與來源于S.tetrandra的St6OMT2聚類成同一個分支，推測Si6OMT1可能與已報道的St6OMT2有類似的催化特性[18]。

將河谷地不容的3個O-甲基轉移酶基因構建至表達載體pGEX-6P-1，采用原核表達體系E.coliBL21(DE3)為宿主進行表達可快速獲得目的蛋白，且操作簡單、外源基因表達產物的水平較高。表達載體選擇N端含有GST標簽的質粒pGEX-6P-1，該質粒轉錄后mRNA中5′端編碼GST標簽的序列被首先翻譯，有效地避免了mRNA無法被核糖體識別和核糖體延伸阻礙的問題，有助于目的蛋白的表達。經SDS-PAGE電泳分離，與空載體對照相比，蛋白上清液在目的片段大小處有條帶，說明3個蛋白在大腸桿菌系統中實現了可溶性表達，這將為進一步分析河谷地不容Si4′OMT、Si6OMT1和Si6OMT2轉錄因子的下游調控基因打下了基礎，為解析河谷地不容中BIAs合成途徑解析及異源合成積累科學數據。