隋國燕，李世宏，秦 哲，陳長青，崔小七，周 衡，張財?shù)潱煨聵s，李劍勇*，唐 峰*

(1.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧錦州，121001；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050；3.鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司，河南鄭州 730050；4.甘肅荷斯坦奶牛繁育示范中心，甘肅蘭州 730050)

奶牛乳房炎(bovine mastitis，BM)是由化學、物理因素等刺激或多種病原微生物侵入乳房組織所引起的炎癥反應(yīng)，是世界奶牛養(yǎng)殖中的常見疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，該病普遍存在于世界各地，在美國、挪威、芬蘭和瑞典因BM引起的奶牛淘汰率為26.5%、19.0%、35.0%和22.0%。我國奶牛乳房炎的發(fā)病率高于世界平均水平，因此病導致的淘汰率約為35%[2]。乳房炎可導致乳汁產(chǎn)生物理、化學和微生物學變化及乳腺組織的病變，并影響奶牛繁殖力、產(chǎn)奶量和乳制品品質(zhì)，不僅增加獸醫(yī)治療和管理費用，而且威脅人類的健康[3]。奶牛乳房炎的臨床癥狀可分為臨床型和隱性型，據(jù)統(tǒng)計，臨床型乳房炎(Clinical mastitis，CM)占總發(fā)病率的21%～30%。CM臨床癥狀明顯，可出現(xiàn)乳區(qū)化膿、壞疽、萎縮等癥狀，也可導致永久性失去泌乳能力，其淘汰奶牛占總淘汰率相對較高[4-5]。細菌性乳房炎是BM最常見的病因，主要病原菌為葡萄球菌和鏈球菌，其次是大腸桿菌和酵母樣菌等?？股啬壳叭允侵委熂毦匀榉垦椎氖走x方案。在多種劑型中抗生素乳房注入劑是最快捷和最有效的劑型[6]。阿莫西林具有廣譜、殺菌作用強的特點，但在某些地區(qū)存在一定的耐藥率[7]。臨床上解決耐藥性的問題可采用聯(lián)合用藥的方式，復方阿莫西林是將阿莫西林、舒巴坦鈉及潑尼松龍聯(lián)合制備，其能夠有效提高藥物的抗菌活性，拓寬抗菌譜，增強敏感度，能夠有效抑制引起B(yǎng)M的常見病原菌，并且具有消炎作用，從而緩解乳腺組織紅腫、脹痛等臨床癥狀，對治療BM效果良好。為滿足奶牛養(yǎng)殖業(yè)對復方阿莫西林的市場需求，本研究對鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)的復方阿莫西林乳房注入劑進行臨床療效評價，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 70頭泌乳期患有CM的荷斯坦奶牛選自甘肅某兩個奶牛場。所有試驗?zāi)膛６荚跇藴驶Ｅ锔綦x飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

入選標準：①患病乳區(qū)出現(xiàn)紅腫、熱感、疼痛等癥狀，且無其他疾病的泌乳期奶牛；或乳汁中出現(xiàn)膠凍狀凝塊、絮狀物以及顏色發(fā)生改變等癥狀。②當前泌乳期沒有臨床乳房炎(單個乳區(qū))治療史。③只有單個乳區(qū)發(fā)生臨床型乳房炎。

排除標準：①具有異常乳區(qū)/乳房構(gòu)造的奶牛(如缺少乳區(qū)、不產(chǎn)奶乳區(qū)、乳頭受損及下垂的乳房)。②桀驁不馴，試驗難以駕馭的奶牛。③奶牛發(fā)生影響試驗結(jié)果的全身或并發(fā)疾病的臨床癥狀。④納入前28 d內(nèi)用過抗生素(全身或乳房內(nèi))治療的試驗?zāi)膛！＂菁{入前3 d內(nèi)用過非甾體抗炎藥(NSAIDs)。⑥兩個或兩個以上乳區(qū)發(fā)生臨床型乳房炎的試驗?zāi)膛！?/p>

剔除標準：①發(fā)生伴發(fā)疾病的奶牛，如全身性疾病或其它需要抗生素或/和抗炎藥物治療的病癥。②不允許偏離研究結(jié)果的配合治療(抗生素或非甾體抗炎藥)。③其他嚴重偏離試驗方案者。

1.1.2 試驗用藥品 試驗用藥：復方阿莫西林乳房注入劑(批號為20190702)，由鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)，規(guī)格為3 g；阿莫西林三水物 0.2 g(以阿莫西林計)+舒巴坦鈉 0.05 g(以舒巴坦計)+潑尼松龍 0.01 g。對照用藥：復方阿莫西林乳房注入劑(批號為1808005)，由齊魯動物保健品有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為12 g；阿莫西林三水物 0.8 g(以阿莫西林計)+舒巴坦鈉 0.2 g(以舒巴坦計)+潑尼松龍0.04 g。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 鮮血瓊脂平板、TSB培養(yǎng)基，廣州迪景微生物科技有限公司；細菌16S rDNA PCR擴增試劑盒，北京天根生化科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；通用細菌采樣管，友康恒業(yè)生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 體細胞分析儀,Fossomatic Minor；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；恒溫搖床，上海一恒科技有限公司；Sorvall Legend XT/XF 低溫高速離心機，美國賽默飛世爾科技公司；SimpliAmp PCR儀，美國ABI公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組及給藥 將70頭奶牛隨機分為試驗組(36頭)和對照組(34頭)。每個感染乳區(qū)注入3 g復方阿莫西林乳房注入劑，每12 h注射1次，連續(xù)給藥3 d。

1.2.2 奶樣采集 用溫水洗滌乳房后，用750 mL/L酒精擦洗進行消毒，采樣前棄掉前段奶樣。分別在用藥前、停藥后7 d(±1 d)和停藥后14 d(±2 d)無菌采集單個患病乳區(qū)的奶樣。每個患病乳區(qū)分別采集兩份奶樣至10 mL和20 mL無菌采樣管中，標記后放入4 ℃采樣箱中保存，當日進行細菌學檢測和乳汁體細胞計數(shù)(somatic cell counts，SCC)測定。

1.2.3 細菌的分離培養(yǎng)與鑒定 將采集的奶樣充分搖勻，吸取100 μL涂布于血平板，同時吸取50 μL至TSB液體培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)，分別置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱和搖床中，培養(yǎng)18 h～48 h。將血平板中單菌落進行純化培養(yǎng)，對未生長菌落者，取奶樣于TSB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，再用血平板劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后仍未長菌的，即可認為無細菌生長。

（2）加快客運碼頭建設(shè)，建成與杭州市國家級旅游城市地位相協(xié)調(diào)的特色客運碼頭。推動實施運河水陸交通、富陽鹿山、桐廬灘頭、建德姚塢和城東等五個水上集散中心的建設(shè)，以及桐廬旅游碼頭及?？奎c，建德風月軒、梅城七廊廟、乾潭、黃饒、嶺后，淳安界首、石林、東北湖區(qū)旅游碼頭，臨安青山湖、柳溪江等旅游客運碼頭的建設(shè)。

取純化后的菌液，進行革蘭氏染色，然后鏡檢。并提取菌液基因組DNA，采用PCR技術(shù)擴增16SrDNA，將測序結(jié)果在NCBI中進行同源比對，鑒定細菌種類。

1.2.4 體細胞計數(shù) 將奶樣進行SCC。比較用藥前、停藥后7 d±1 d和14 d±2 d的變化。

1.2.5 療效評價 在用藥前、停藥后7 d±1 d和14 d±2 d分別觀察患牛乳房外觀和乳汁性狀的變化。并統(tǒng)計治愈率、有效率及總有效率。判斷標準如下：

治愈：若患病乳區(qū)紅、腫、熱、疼痛等臨床癥狀完全消失，乳汁顏色以及性狀均恢復正常，在治療前檢出的病原微生物在治療后未檢出，SCC在75×104個/mL以下則可判定為對該病原微生物引起的乳房炎治愈。

有效：患病乳區(qū)臨床癥狀減輕或消退，病原微生物在治療后仍被檢出，SCC明顯下降判為對該病原微生物引起的乳房炎有效。

無效：若患病乳區(qū)臨床癥狀未得到改善甚至病情加重，在治療后病原微生物仍被檢出或乳汁中SCC下降不顯著，視為無效。計算公式如下：

治愈率=治愈數(shù)/總數(shù)×100%

有效率=有效數(shù)/總數(shù)×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析 使用Microsoft Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理，使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行T檢驗與卡方(χ2)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物治療前后乳汁中的病原菌檢測結(jié)果

細菌學檢測結(jié)果如表1和表2所示，用藥前采集的70份奶樣中有58份奶樣檢出細菌，細菌總檢出率為82.86%，試驗組和對照組細菌檢出率分別為86.11%(31/36)和79.41%(27/34)。該牛場分離的病原菌主要為鏈球菌(40.63%)、葡萄球菌(31.25%)、大腸埃希氏菌(26.15%)、巨型球菌(1.56%)。停藥后14 d，試驗組和對照組對病原菌的總清除率分別為94.12%和93.55%。試驗組對無乳鏈球菌、巴黎鏈球菌、乳房鏈球菌、馬胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和巨型球菌的清除率均為100%，大腸埃希氏菌為88.89%，豬葡萄球菌為50%。對照組對無乳鏈球菌、巴黎鏈球菌、乳房鏈球菌、豬葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌的清除率均為(100%)，大腸埃希氏菌為87.5%，馬胃葡萄球菌為75%。

表1 用藥前后牛奶樣品中細菌的變化

2.2 藥物治療前后SCC檢測結(jié)果

用藥前試驗組和對照組的SCC均遠高于75×104個/mL，停藥后7 d、14 d后兩組所采集的奶樣中SCC明顯下降(表3)，說明兩組均能達到治愈標準。

表3 各試驗組用藥前后乳汁體細胞數(shù)

2.3 臨床治療效果

由表4可見，停藥后14d，試驗組治愈率和總有效率分別為58.3%(21/36)、88.9%(32/36)；對照組分別為61.8%(21/34)、85.3%(29/34)；與對照組相比，試驗組的治愈率無顯著性差異(P>0.05)，試驗組的總有效率同樣無顯著性差異(P>0.05)。

表4 試驗藥物與對照藥物治療CM臨床效果統(tǒng)計

3 討論

BM是危害奶牛健康的重要疾病之一，由于引起B(yǎng)M的致病因素多且病原菌種類復雜，導致其難以得到根治[8]。BM的發(fā)生常與病原微生物感染、環(huán)境因素及飼養(yǎng)管理不當?shù)绕渌蛩赜嘘P(guān)[9-10]。使用抗生素進行治療可以有效控制BM的發(fā)生。阿莫西林是臨床上治療BM的常用藥物之一，但由于長期使用或使用不當出現(xiàn)一定的耐藥性[7]。因此，將阿莫西林、舒巴坦鈉及潑尼松龍聯(lián)合制備為復方阿莫西林乳房注入劑。

本試驗研究了復方阿莫西林乳房注入劑對CM的治療效果。臨床上通常以奶牛的精神狀態(tài)、食欲、產(chǎn)奶量及乳房和乳汁肉眼可見的臨床指標作為BM的療效評判標準。但僅通過肉眼觀察臨床癥狀消失即評判為臨床治愈，假陰性率過高，部分泌乳期奶牛會復發(fā)BM，這與乳汁中細菌沒有完全清除有一定關(guān)系[11]。停藥后14 d，試驗用藥和對照用藥對病原菌的總清除率為94.12%和93.55%。說明兩種藥物對引起該牛場BM的主要病原菌(大腸埃希氏菌、葡萄球菌和鏈球菌)具有較好的清除作用。此外，研究表明乳汁SCC與BM的發(fā)生呈正相關(guān)，SCC也是評價奶牛乳房感染程度的重要指標之一。SCC結(jié)果顯示，兩組在用藥前后均顯著下降，且兩組間無顯著性差異，說明兩種試驗用藥均能夠改善由乳房炎引起的乳汁SCC升高。臨床結(jié)果顯示，試驗組和對照組的臨床治愈率分別為58.3%和61.8%，總有效率分別為88.9%和85.3%。說明了試驗用藥和對照用藥兩組臨床療效相當。

葡萄球菌與大腸埃希氏菌是導致食源性中毒病和引起B(yǎng)M的主要病原菌，而且乳汁中的營養(yǎng)成分與pH值適宜多種細菌的生長[12]。β內(nèi)酰胺類抗生素的錯誤使用導致了臨床耐藥菌分離率的增加[7]。配方中舒巴坦是一種β內(nèi)酰胺酶抑制劑，可有效抑制多種產(chǎn)A類β內(nèi)酰胺酶的細菌，增強阿莫西林對耐藥菌的抗菌效果[13]，達到更好的臨床治效果。

復方中添加抗炎藥潑尼松龍配伍阿莫西林使用來提高治療效果。在乳房炎的炎癥期間，主要由乳腺上皮細胞組成的血-乳屏障失去完整性，血液與乳汁之間的梯度無法維持?？寡姿幍氖褂秒m然無法阻止血-乳屏障被破壞，但有研究證明抗炎藥的使用可以幫助重建屏障的完整性，促進乳房炎癥的恢復。同時，研究發(fā)現(xiàn)抗炎藥物的使用可以有效地減少與疾病和疼痛相關(guān)的行為，并顯著改善牛的福利[14]。在另一項乳房炎的自然感染研究中，同樣證實了抗菌藥與抗炎藥的配伍使用可以通過減輕與乳房炎乳腺炎引起的疼痛和不適，促進輕度或中度乳房炎的恢復[15]。

復方阿莫西林乳房注入劑可以通過舒巴坦鈉增強阿莫西林對臨床菌株的抑制作用和潑尼松龍減輕乳房炎癥反應(yīng)和相關(guān)疼痛反應(yīng)來更好地實現(xiàn)對CM的治療效果。

綜上所述，鄭州百瑞動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復方阿莫西林乳房注入劑與對照用藥的臨床療效相近，兩者無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明本試驗中復方阿莫西林乳房注入劑(試驗用藥)能夠有效治療泌乳期奶牛臨床型乳房炎，可以進一步推廣與應(yīng)用。