張維維 劉金倩 張全意

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科 山東 濱州 256603

生物標(biāo)志物是一種可以反應(yīng)正常生物過程、病理過程或治療干預(yù)的藥理學(xué)結(jié)果的指標(biāo)，可以被客觀測(cè)量和評(píng)估。為了降低膿毒癥患者的死亡率，早期診斷方法的研究對(duì)膿毒癥具有重要的臨床意義。目前，血液培養(yǎng)是膿毒癥微生物診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于樣本量小、確診時(shí)間長(zhǎng)和缺乏敏感性等原因，血液培養(yǎng)對(duì)膿毒癥的診斷并不理想，導(dǎo)致治療延遲和死亡率高[1-2]。現(xiàn)基于非編碼RNA在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的意義，多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在膿毒癥患者和正常人血液中存在表達(dá)差異，且和膿毒癥的嚴(yán)重程度或存活率相關(guān)，提示LncRNA可以作為膿毒癥診斷和預(yù)后的候選標(biāo)記物[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA GASL1s(LncRNA GASL1 ) 是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子。除了惡性腫瘤以外，GASL1還和慢性充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)以及顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)。但是目前尚無關(guān)于GASL1和膿毒癥關(guān)系的研究。在本部分研究中，我們通過收集檢測(cè)膿毒癥患者和檢測(cè)對(duì)照血液中LncRNA GASL1的表達(dá)差異，分析血液GASL1對(duì)膿毒癥患者的診斷價(jià)值。其次，通過在膿毒癥患者中分析GASL1和膿毒癥患者的特征、預(yù)后和并發(fā)癥的關(guān)系，研究血液GASL1對(duì)膿毒癥預(yù)后的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 病例來源于2018年1月至2018年12月我院重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)214例患者，其中伴有膿毒癥者134例，不伴有膿毒癥者80例。膿毒癥患者的納入標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)/危重病醫(yī)學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)診斷為敗血癥，患者年齡≥18歲。排除既往或患有實(shí)體癌，白細(xì)胞減少癥，惡性血液病，嚴(yán)重慢性心、肝、腎、肺疾病，HIV感染性疾病，干細(xì)胞移植，3個(gè)月內(nèi)用免疫抑制劑治療，懷孕或哺乳期者。所有參與本研究的患者在研究前對(duì)本次實(shí)驗(yàn)?zāi)康募斑^程均有充分的了解，患者表示自愿參與本次研究,并簽署知情同意書,符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求并經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過。按照年齡和性別匹配從我院的健康篩查中心納入120例健康對(duì)照者，并根據(jù)體檢結(jié)果對(duì)納入的健康對(duì)照者進(jìn)行資格篩選。

1.2 病例信息收集 在病案信息系統(tǒng)中查詢膿毒癥患者的人口學(xué)資料、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。同時(shí)收集了健康對(duì)照組的體檢信息資料，獲得上述基本信息。所有患者的生命體征每天監(jiān)測(cè)，常規(guī)治療作為敗血癥的指導(dǎo)方針。

1.2.1 Lnc RNA GASL1表達(dá)水平的檢測(cè) 血樣收集膿毒癥患者入院后24 h內(nèi)采集血樣，用于檢測(cè)LncRNA GASL1的表達(dá)水平。此外，在獲得知情同意后，每個(gè)健康對(duì)照者在健康篩查中心接受血液檢測(cè)，并采集血液樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1.2.2 急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)(acute physiology and chronic health valuation scoring system，APACHE)II和全身性感染相關(guān)性器官功能衰竭評(píng)分(sepsis related organ failure assessment，SOFA) APACHEⅡ由急性生理評(píng)分、年齡評(píng)分和慢性健康評(píng)分三部分組成，是目前臨床上ICU病房應(yīng)用最廣泛、最具權(quán)威的危重病病情評(píng)價(jià)系統(tǒng)[4]。SOFA的主要目的是評(píng)價(jià)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的發(fā)生、發(fā)展并評(píng)價(jià)發(fā)病率，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括六個(gè)器官的共11個(gè)指標(biāo)[5]，次研究采用的SOFA值為患者住院期間的最大SOFA。APACHEⅡ和SOFA分?jǐn)?shù)越高，患者的預(yù)后越差。

1.3 RT-PCR檢測(cè)血液中LncRNA GASL1基因水平表達(dá) 將取得血液樣品利用紅細(xì)胞裂解液H、離心、裂解液、去蛋白液等方提取RNA溶液。然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA，采用SYBRgreen試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。通過delta-delta CT方法計(jì)算相對(duì)mRNA達(dá)含量，并選擇β-actin內(nèi)參基因作為內(nèi)參，通過熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般情況 ICU膿毒癥患者和非膿毒癥患者的性別、年齡、BMI、WBC、APACHEⅡ、SOFA等資料及健康對(duì)照者的性別、年齡和BMI資料見表1。通過統(tǒng)計(jì)分析比較顯示膿毒癥患者、非膿毒癥患者和健康對(duì)照者的年齡、性別和BMI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膿毒癥患者和非膿毒癥患者APACHEⅡ評(píng)分的中位數(shù)、SOFA評(píng)分中位數(shù)的均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 研究對(duì)象的一般情況比較

2.2 血液LncRNA GASL1在不同組別患者中的表達(dá) 膿毒癥患者、非膿毒癥患者和健康對(duì)照者血液LncRNA GASL1的相對(duì)表達(dá)水平分別是(5.33±4.08)、(2.01±1.75)和(1.72±1.40)。方差分析結(jié)果表明血液GASL1在膿毒癥患者、非膿毒癥患者和健康對(duì)照者中的相對(duì)表達(dá)水平存在顯著性差異，P<0.05。對(duì)三組之間進(jìn)行兩兩比較顯示，膿毒癥患者血液中GASL1的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于非膿毒癥患者，P<0.01。非膿毒癥患者和健康對(duì)照者血液中的GASL1相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

與膿毒癥患者比較，**P<0.01。圖1 血液GASL1在膿毒癥、非膿毒癥和健康對(duì)照者中的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 血液LncRNA GASL1對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值 基于血液中GASL1在膿毒癥患者、非膿毒癥患者和健康對(duì)照者中的表達(dá)差異，我們使用ROC曲線分析血液GASL1對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值。相對(duì)于健康對(duì)照者，血液GASL1診斷膿毒癥的曲線下面積(area under curve, AUC)是0.866，AUC的95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)是0.831～0.902(P<0.05)，敏感度、特異度和截?cái)嘀捣謩e是0.885、0.735和1.995(圖2)。相對(duì)于非膿毒癥患者，血液GASL1診斷膿毒癥的AUC(95%CI)、敏感度、特異度和截?cái)嘀捣謩e是0.861(0.824～0.897)、0.695、0.900和2.96。

圖2 血液GASL1診斷膿毒癥的ROC曲線(膿毒癥vs.健康對(duì)照)

2.4 血液LncRNA GASL1在不同類型膿毒癥患者中的比較

2.4.1 血液LncRNA GASL1在不同APACHEⅡ評(píng)分患者中的表達(dá) 以APACHEⅡ評(píng)分的15分為界限將134例患者分為兩組，>15分和≤15分的患者分別有72例和62例，血液GASL1在APACHEⅡ>15分組和≤15分組膿毒癥患者中的相對(duì)表達(dá)水平分別是(6.34±3.30)和(4.53±4.13)。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，血液GASL1在APACHEⅡ>15分膿毒癥患者中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于APACHEⅡ≤15分膿毒癥患者，P<0.01，見圖3。

與>15分膿毒癥患者比較，**P<0.01。圖3 血液GASL1在不同APACHEⅡ評(píng)分患者中的表達(dá)水平

2.4.2 血液LncRNA GASL1在不同SOFA評(píng)分患者中的表達(dá)以SOFA評(píng)分的中位數(shù)2分為界限將134例患者分為兩組，SOFA評(píng)分>7分和≤7分的患者分別有67例和67例，血液GASL1在SOFA>7分組和SOFA≤7分組膿毒癥患者中的相對(duì)表達(dá)水平分別是(6.09±4.87)和(4.89±3.01)。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，血液GASL1在SOFA>7分膿毒癥患者中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于SOFA≤7分膿毒癥患者，P<0.05，見圖4。

與>7分組膿毒癥患者比較，*P<0.05。圖4 血液GASL1在不同SOFA評(píng)分患者中的表達(dá)水平

2.4.3 血液GASL1在膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者中的相對(duì)表達(dá)水平 按照疾病的嚴(yán)重程度，將134例膿毒癥患者分為膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者，膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克者分別有82、38和14例。血液GASL1在膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者中的相對(duì)表達(dá)水平分別是(4.49±3.62)、(6.58±2.65)和(7.23±6.01)。方差分析結(jié)果表明，血液GASL1在膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者中的相對(duì)表達(dá)水平存在顯著性差異，P<0.05。兩兩比較顯示，膿毒癥患者血液中的GASL1相對(duì)表達(dá)水平顯著低于嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者，P均<0.05。血液GASL1在嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者中的相對(duì)表達(dá)水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

與膿毒癥患者比較，*P<0.05,**P<0.01。圖5 血液GASL1在不同嚴(yán)重程度患者中的表達(dá)水平

3 討論

GASL1是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子[6]。除惡性腫瘤以外，GASL1還和CHF和顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)。在CHF中，GASL1過表達(dá)可能通過抑制TGF-β1的失活抑制心肌細(xì)胞凋亡而改善CHF[7]。在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中，GASL1通過靶向TGF-β1在體外調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖[8]。除了TGF-β1以外，GASL1對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路也具有調(diào)節(jié)作用，GASL1可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而抑制胃癌患者的腫瘤生長(zhǎng)[9]。同時(shí)TGF-β1和Wnt/β-catenin信號(hào)通路均與膿毒癥及其并發(fā)癥存在密切聯(lián)系[10]?；贕ASL1和TGF-β1、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系，提示GASL1可能也和膿毒癥及其相關(guān)并發(fā)癥相關(guān)。本研究的分析結(jié)果顯示，相對(duì)于健康對(duì)照者和ICU中的非膿毒癥患者，膿毒癥患者血液中GASL1表達(dá)水平升高，提示GASL1可能是膿毒癥的危險(xiǎn)因子。

膿毒癥是免疫系統(tǒng)對(duì)損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，患者常伴隨著炎癥、凝血、補(bǔ)體和代謝等數(shù)千種內(nèi)源性介質(zhì)活性的變化[11]。嚴(yán)重膿毒癥使患者的病死率增加，膿毒癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)約與急性心肌梗死導(dǎo)致的死亡人數(shù)類似[12]。及時(shí)診斷和準(zhǔn)確劃分膿毒癥嚴(yán)重程度可以指導(dǎo)醫(yī)師及時(shí)采取必要的治療措施，能顯著降低膿毒癥死亡率[13]。目前，從無菌體液標(biāo)本中檢測(cè)和分離病原微生物是診斷感染和膿毒癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]。然而，常規(guī)的血液培養(yǎng)可能需要6至5天的時(shí)間才能將一個(gè)有機(jī)體培養(yǎng)到可檢測(cè)的水平，對(duì)膿毒癥的診治不及時(shí)。生物標(biāo)記物旨在早期識(shí)別膿毒癥，以便盡快對(duì)患者實(shí)施支持性措施[15]?；谘褐蠫ASL1在膿毒癥患者、非膿毒癥患者和健康對(duì)照者中的表達(dá)差異，本研究使用ROC曲線分析血液GASL1對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值。相對(duì)于健康對(duì)照者或ICU病房中的非膿毒癥患者，血液GASL1均對(duì)膿毒癥有較好的診斷價(jià)值(AUC>0.8)。

在所有膿毒癥患者中，GASL1在APACHEⅡ或SOFA評(píng)分較高、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克患者中表達(dá)水平較高。APACHEⅡ和SOFA是目前臨床上ICU病房應(yīng)用最廣泛、最具權(quán)威的危重病病情評(píng)價(jià)系統(tǒng)[4]。APACHEⅡ和SOFA分?jǐn)?shù)越高，患者的預(yù)后越差。血液GASL1在APACHEⅡ>15分/SOFA>7分膿毒癥患者中的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于APACHEⅡ≤15分/SOFA≤7分膿毒癥患者，提示血液GASL1可能與膿毒癥患者的預(yù)后有關(guān)。嚴(yán)重膿毒癥是指合并出現(xiàn)器官功能障礙表現(xiàn)的膿毒癥。膿毒癥休克是膿毒癥的一個(gè)亞類，是指能顯著增加患者死亡率的潛在的循環(huán)和細(xì)胞/代謝異常[17]。嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克患者的死亡率較普通膿毒癥患者較高，嚴(yán)重膿毒癥的病死率仍高達(dá)20%～50%[16]。膿毒癥患者血液中的GASL1相對(duì)表達(dá)水平顯著低于嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者，該結(jié)果進(jìn)一步提示血液GASL1可能與膿毒癥患者的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，相對(duì)于健康對(duì)照者和ICU中的非膿毒癥患者，膿毒癥患者血液GASL1表達(dá)水平升高，提示GASL1可能是膿毒癥的危險(xiǎn)因子。且在所有膿毒癥患者中，GASL1在APACHEⅡ或SOFA評(píng)分較高、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克患者中表達(dá)水平較高。可將GASL1其作為臨床診斷膿毒癥及評(píng)估患者預(yù)后的指標(biāo)。這對(duì)膿毒癥患者的診治具有重要意義。