吳 瑕，何建春，趙峻英，馮 婭

重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 402360

大腸埃希菌是一種常見(jiàn)的條件致病菌，在某些條件下容易引起血流感染，最終導(dǎo)致膿毒癥或其他并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1]。然而，近年來(lái)由于臨床不合理用藥或經(jīng)驗(yàn)用藥導(dǎo)致高比例耐第3代頭孢菌素菌株不斷增加，甚至出現(xiàn)了一定比例耐頭孢吡肟菌株[2]，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大困擾。筆者團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行K-B法復(fù)核頭孢吡肟藥敏時(shí)，發(fā)現(xiàn)其抑菌圈內(nèi)有大小不等的菌落生長(zhǎng)，通過(guò)文獻(xiàn)得知其為異質(zhì)性耐藥[3]，并且異質(zhì)性耐藥菌株通常是細(xì)菌從敏感進(jìn)化到耐藥過(guò)程的中間階段菌株，如果不通過(guò)常規(guī)的K-B法，很難發(fā)現(xiàn)該類(lèi)型的菌株[4]。因此，該類(lèi)型的菌株將比敏感菌株更快進(jìn)化成耐藥菌株。本研究對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的大腸埃希菌進(jìn)行研究，并通過(guò)雙病例對(duì)照研究調(diào)查分析本院2015年1月至2018年12月血流感染中異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的流行病學(xué)情況，為指導(dǎo)臨床合理用藥從而預(yù)防和控制該類(lèi)菌株甚至耐藥菌株的出現(xiàn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集本院2015年1月至2018年12月血流感染中分離的248株大腸埃希菌，去除同一患者反復(fù)培養(yǎng)陽(yáng)性的重復(fù)菌株。根據(jù)大腸埃希菌對(duì)頭孢吡肟藥敏情況分為頭孢吡肟耐藥組、頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組、頭孢吡肟敏感組。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定、藥敏情況及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)確證 所選標(biāo)本均為血液標(biāo)本，并依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[5]進(jìn)行細(xì)菌的分離和培養(yǎng)，然后采用Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，采用其配套藥敏卡分析細(xì)菌對(duì)各類(lèi)抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，即藥敏試驗(yàn)。最后，依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。ESBLs檢測(cè)及確證：依據(jù)CLSI，采用雙紙片協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行確證。

1.2.2K-B法 在血平板上復(fù)蘇248株大腸埃希菌，并根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[5]進(jìn)行K-B法標(biāo)準(zhǔn)操作，貼上頭孢吡肟藥敏紙片，于35 ℃孵育24～48 h后，測(cè)量其抑菌圈直徑，若觀(guān)察到抑菌圈內(nèi)有菌落生長(zhǎng)則初步判斷為異質(zhì)性耐藥。相反，則為敏感、中介或耐藥。

1.2.3菌落譜型分析(PAP)實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)是判定異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。異質(zhì)性耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)菌在抗菌藥物最高非抑菌濃度到最低完全抑菌濃度之間的比值≥8倍[3]。將K-B法初篩為異質(zhì)性耐藥的菌株進(jìn)一步通過(guò)PAP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確證，PAP實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[6]，主要步驟為：配制梯度頭孢吡肟抗菌藥物，制備梯度頭孢吡肟抗菌藥物平板，細(xì)菌均勻涂布頭孢吡肟抗菌藥物平板并孵育，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次再計(jì)數(shù)，并進(jìn)行換算和作圖。將大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.4脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 該方法主要用于細(xì)菌同源性分型，是判定臨床菌株間是否發(fā)生同源性暴發(fā)最重要的方法。選擇MIC相同或相近的異質(zhì)性耐藥菌株共20株，通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的PFGE方法完成該實(shí)驗(yàn)[7]，最后再通過(guò)PFGE條帶分析這些臨床菌株間的同源性。

1.2.5相關(guān)耐藥基因的檢測(cè) 選擇頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組的菌株為研究對(duì)象，進(jìn)行相關(guān)耐藥基因檢測(cè)。首先,提取細(xì)菌的DNA，然后通過(guò)PCR法檢測(cè)其可能存在的相關(guān)耐藥基因，包括blaCTX-M、blaTEM、blaSHV、blaOmpF和blaOmpC等，其所需引物參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)。

1.2.6相關(guān)危險(xiǎn)因素分析 采用雙病例對(duì)照研究，通過(guò)本院臨床病歷系統(tǒng)和檢驗(yàn)科醫(yī)院管理系統(tǒng)收集248例感染大腸埃希菌患者的相關(guān)資料，包括患者基本情況、基礎(chǔ)疾病、并發(fā)癥、侵入性操作、先前抗菌藥物使用和患者轉(zhuǎn)歸等。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用多因素Logistic回歸(逐步前進(jìn)法)進(jìn)行因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥率及臨床分布特征 在248株菌株中，K-B法復(fù)核后發(fā)現(xiàn)，在K-B法抑菌圈內(nèi)有菌落生長(zhǎng)的菌株共78株，并將其初步判定為異質(zhì)性耐藥菌株，見(jiàn)圖1。然后再將這些菌株通過(guò)PAP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)其均為異質(zhì)性耐藥菌株。藥敏分析結(jié)果顯示，在248株菌株中，對(duì)頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥的菌株有78株(占31.5%)，對(duì)頭孢吡肟耐藥的菌株有63株(占25.4%)，對(duì)頭孢吡肟敏感的菌株有107株(占43.1%)。從科室分布來(lái)看，頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌主要來(lái)自外科(146株，占58.9%)，主要集中在泌尿外科(38株，占26.0%)、ICU(28株，占19.2%)和感染科(18株，占12.3%)。

2.2頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的PFGE分型 通過(guò)對(duì)比分析20株頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的PFGE條帶，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有相同或相似PFGE條帶，表明這些菌株間型別及來(lái)源不同，不存在同源性傳播，見(jiàn)圖2。

2.3頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥菌株耐藥基因的檢測(cè) 通過(guò)對(duì)78株頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有異質(zhì)性耐藥菌株均含blaOmpF和blaOmpC。在所有異質(zhì)性耐藥菌株中，有32株為產(chǎn)ESBLs菌株，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，有23株表達(dá)blaCTX-M(占71.9%)，9株表達(dá)blaTEM(占28.1%)，僅3株表達(dá)blaSHV(占9.4%)，有2株同時(shí)表達(dá)blaCTX-M和blaTEM(占6.2%)，有1株同時(shí)表達(dá)blaCTX-M和blaSHV(占3.1%)。

注：A表示對(duì)頭孢吡肟敏感；B表示對(duì)頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥；C表示對(duì)頭孢吡肟耐藥。

注：1～20為20株異質(zhì)性耐藥菌株的對(duì)應(yīng)編號(hào)。

2.4危險(xiǎn)因素分析

2.4.1單因素分析 頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較，年齡>60歲、入住ICU、尿路感染、低蛋白血癥、導(dǎo)尿管、頭孢菌素類(lèi)和產(chǎn)ESBLs差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；臨床轉(zhuǎn)歸顯示，總住院>30 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組比較，轉(zhuǎn)院患者、尿路感染、頭孢菌素類(lèi)和產(chǎn)ESBLs差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較，轉(zhuǎn)院患者、灌腸、頭孢菌素類(lèi)和產(chǎn)ESBLs差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；臨床轉(zhuǎn)歸顯示，患者病死率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4.2多因素分析 進(jìn)一步將上述單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量采用多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較，年齡>60歲、尿路感染、導(dǎo)尿管、頭孢菌素類(lèi)和產(chǎn)ESBLs是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組比較，尿路感染和產(chǎn)ESBLs是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較,轉(zhuǎn)院、粒細(xì)胞減少癥、灌腸和產(chǎn)ESBLs是頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表1 頭孢吡肟敏感、耐藥和異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的單因素分析[n(%)]

續(xù)表1 頭孢吡肟敏感、耐藥和異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的單因素分析[n(%)]

表2 頭孢吡肟敏感、耐藥和異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的Logistic回歸分析

3 討 論

大腸埃希菌是一種常見(jiàn)的條件致病菌，易引起血流感染等導(dǎo)致患者死亡，臨床常采用頭孢菌素等抗菌藥物進(jìn)行治療，導(dǎo)致出現(xiàn)越來(lái)越多的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，頭孢吡肟是一種常見(jiàn)的用于抗感染治療的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，也作為治療該類(lèi)菌感染的一個(gè)重要選擇，但近年來(lái)呈現(xiàn)耐藥率逐漸增高的趨勢(shì)[8]，導(dǎo)致臨床有時(shí)治療效果不佳或治療失敗。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血流感染患者分離出的大腸埃希菌除對(duì)頭孢吡肟耐藥外，從相當(dāng)比例病情惡化的患者分離的大腸埃希菌對(duì)頭孢吡肟產(chǎn)生了異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，臨床常誤認(rèn)為對(duì)頭孢吡肟敏感，而導(dǎo)致治療失敗。

從藥敏結(jié)果來(lái)看，本院大腸埃希菌對(duì)頭孢吡肟的耐藥率為25.4%，略低于2018年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[9],CHINET顯示，大腸埃希菌對(duì)頭孢吡肟的耐藥率為27.3%，但也低于本院大腸埃希菌對(duì)頭孢吡肟的異質(zhì)性耐藥率(31.5%)，說(shuō)明頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象存在且需要臨床特別注意，以防臨床治療失敗而無(wú)法找出其中的原因。從科室分布來(lái)看，頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌主要來(lái)自外科，并以泌尿外科和ICU檢出率最高，可能原因?yàn)槊谀蛲饪苹颊呓?jīng)常進(jìn)行尿路插管等操作損傷尿道而引起細(xì)菌上行感染入血，ICU患者常有非常嚴(yán)重的病情，加上各類(lèi)抗菌藥物的不合理使用，使得敏感菌被殺滅而未被殺死的耐藥亞群菌引起血流感染，所以應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這些科室耐藥菌株的監(jiān)測(cè)和防控[10]。從頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥菌株同源性來(lái)看，異質(zhì)性耐藥菌株P(guān)FGE條帶不一，說(shuō)明頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥菌株不是由于菌株間同源性傳播引起的。從耐藥基因檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，異質(zhì)性耐藥菌株主要表達(dá)blaCTX-M基因，與相關(guān)報(bào)道CTX-M型是目前我國(guó)最主要產(chǎn)ESBLs基因型結(jié)果相一致[11]，其次為T(mén)EM基因型。

進(jìn)一步通過(guò)雙病例對(duì)照研究進(jìn)行相關(guān)危險(xiǎn)因素分析，結(jié)果顯示，在頭孢吡肟耐藥組、頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組和頭孢吡肟敏感組兩兩比較中，既存在各自不同的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也存在其共同的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。首先，分析上述兩兩比較中的各自不同的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，從頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較來(lái)看，尿路感染和導(dǎo)尿管是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。尿路感染最常見(jiàn)的是大腸埃希菌感染，加上人為通過(guò)侵入性操作如導(dǎo)尿管入侵泌尿道引起尿路感染的細(xì)菌定居和繁殖，當(dāng)抗菌藥物作用于敏感細(xì)菌，而這些菌株隱蔽于導(dǎo)尿管等位置躲過(guò)抗菌藥物的作用或劑量不足，使得敏感菌株逐步變成耐藥菌株，再加上住院患者本來(lái)免疫力低下，使得引起尿路感染的細(xì)菌特別是耐藥菌就有機(jī)會(huì)入血液而引起耐藥菌血流感染，導(dǎo)致治療失敗[12]。這也與本研究發(fā)現(xiàn)的耐藥菌株主要來(lái)自泌尿外科相一致。另外，頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物的使用也是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且在頭孢吡肟耐藥組有更高的頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物使用比例(46.0%vs. 16.8%)，說(shuō)明頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物常用于臨床抗感染治療。長(zhǎng)期高頻率使用該類(lèi)抗菌藥物使得細(xì)菌在抗菌藥物的壓力下為了生存而發(fā)生基因突變，或產(chǎn)生耐藥基因，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥特性發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致患者體內(nèi)菌群失調(diào)，使臨床治療更加棘手[13]。臨床轉(zhuǎn)歸顯示，患者病死率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明患者發(fā)生頭孢吡肟耐藥后，臨床可能直接使用碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物，使得患者病情好轉(zhuǎn)。從頭孢吡肟耐藥組與頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組比較來(lái)看，尿路感染是頭孢吡肟耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。異質(zhì)性耐藥常直接被臨床或微生物工作者作為敏感菌株處理，因而其發(fā)生原因可能與上述一致。從頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥組與頭孢吡肟敏感組比較來(lái)看，轉(zhuǎn)院是頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其發(fā)生原因可能為很多患者在轉(zhuǎn)入本院前在其他更低一級(jí)醫(yī)院進(jìn)行了相關(guān)不合理的治療，如濫用抗菌藥物或使用的抗菌藥物不對(duì)、不足等，導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥菌株的出現(xiàn)，在轉(zhuǎn)入本院時(shí)已經(jīng)攜帶。另外，灌腸也是頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其原因可能是住院患者長(zhǎng)期使用抗菌藥物，一部分抗菌藥物進(jìn)入腸道逐步作用于大腸埃希菌，使得敏感大腸埃希菌在劑量不足的抗菌藥物壓力下變成異質(zhì)性耐藥菌株，當(dāng)患者進(jìn)行灌腸時(shí)，患者腸道黏膜受損，異質(zhì)性耐藥菌株乘機(jī)入血[14]。臨床轉(zhuǎn)歸顯示，患者病死率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，異質(zhì)性耐藥菌株常常被誤認(rèn)為是敏感菌株，未引起臨床注意，導(dǎo)致治療失敗。因此，通過(guò)常規(guī)的K-B法進(jìn)行異質(zhì)性耐藥的篩選顯得格外重要。

最后，分析上述兩兩比較中的共同獨(dú)立危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs是頭孢吡肟耐藥和異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的共同獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其可能原因?yàn)轭^孢吡肟是一種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，ESBLs又是一種能夠水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物最常見(jiàn)的酶，故而產(chǎn)ESBLs也是一種天然的耐頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物酶，因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)ESBLs的監(jiān)測(cè)，對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株的治療可以選擇其他種類(lèi)抗菌藥物或活性更高的碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物進(jìn)行治療，以減少異質(zhì)性耐藥菌的出現(xiàn)。

綜上所述，本院頭孢吡肟異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌比例較高，隨著臨床抗菌藥物(特別是頭孢菌素類(lèi))的不合理應(yīng)用，產(chǎn)ESBLs菌株的不斷出現(xiàn)，加上臨床對(duì)異質(zhì)性耐藥的關(guān)注度不夠，使得頭孢吡肟的異質(zhì)性耐藥和耐藥率逐年升高，給臨床治療帶來(lái)了困難。因此，臨床可以根據(jù)患者流行病學(xué)危險(xiǎn)因素并結(jié)合患者的病情，采取適當(dāng)?shù)姆乐未胧詼p少頭孢吡肟耐藥和異質(zhì)性耐藥大腸埃希菌的流行。本研究的不足之處在于未對(duì)異質(zhì)性耐藥的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深入研究。