宣彬彬，孫寒曉，武嬌祥，周麗達，陳佳婕，譚美玉，殳 潔，李 陽，陶生策，盛慧明△

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院檢驗科，上海200336；2.上海交通大學系統生物醫(yī)學研究院系統生物醫(yī)學教育部重點實驗室，上海 200240

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是單鏈正義RNA病毒，屬于β類冠狀病毒，與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)同種屬[1-2 ]?，F有的研究結果顯示，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的傳染性和病死率都非常高，圍繞該病毒的診斷和治療亟待突破。尤其是對病毒感染免疫的研究將在實驗室診斷和疫苗的研發(fā)中發(fā)揮至關重要的作用。本文就上海首例COVID-19患者整個診治過程中的實驗室指標變化進行報道，為COVID-19的診斷治療提供信息。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院收治的上海首例COVID-19患者門診及住院治療期間的相關實驗室指標?；颊?，女，57歲，漢族。出生地湖北。因“發(fā)熱 5 d，伴干咳加重 2 d”于2020年1月16日收入上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院，經過治療后于2020年2月24日康復出院并隨訪。該患者在入院前6天(1月10日)即有臨床癥狀并曾于武漢中醫(yī)院就診，本研究中將此作為疾病發(fā)生第1天(D1)，以此類推，至2月24日出院為D46。本研究已獲醫(yī)院倫理批準和患者知情同意。

1.2體格檢查 患者體溫升高，38.2 ℃，胸悶，咽部不適，畏寒無寒戰(zhàn)，咳嗽，無咳痰，下肢乏力，背部及下肢肌肉酸痛，無呼吸困難，無盜汗，無胸痛，無鼻塞流涕，無頭暈、頭痛，無皮疹。查體：神志清醒，氣平，發(fā)育正常，營養(yǎng)良好，急性病容，表情正常，自主體位，正常步態(tài)，對答切題，查體合作。脈搏92次/分鐘，呼吸24次/分鐘，血壓105/65 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，心率92次/分鐘，律齊，各瓣膜聽診區(qū)未聞及病理性雜音和額外心音；無心包摩擦音。無水沖脈，無股動脈槍擊音，無毛細血管搏動征。肺部檢查：雙側胸廓呼吸運動對稱，雙側語顫對稱正常，雙肺叩診清音，雙肺下葉聞及濕啰音。肝脾肋下未及，雙腎區(qū)無叩擊痛，肢體無水腫及皮疹。X線片檢查結果：兩肺多發(fā)炎癥。

1.3檢測方法

1.3.1標本采集 患者的血液標本均由臨床護士采集，根據檢測項目不同采用不同抗凝劑真空采血管，并經過離心后留取標本進行檢測。咽拭子等呼吸道標本則由臨床醫(yī)生采集并及時送檢。

1.3.2儀器與試劑 美國BD公司FACS CantoTMⅡ流式細胞儀、MultitestTM6-color TBNK 試劑盒、絕對計數管；青島瑞斯凱爾12項細胞因子檢測試劑盒；深圳邁瑞B(yǎng)C-5390 全自動五分類血液細胞分析儀；德國西門子ADVIA 2400全自動生化分析儀；丹麥雷度ABL90血氣分析儀；北京熱景生物技術股份有限公司SARS-CoV-2 IgM抗體檢測試劑盒(膠體金免疫層析法)；北京新興四寰生物技術有限公司SARS-CoV-2 IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)。

1.3.3檢測項目 本次研究針對患者不同時間節(jié)點的標本進行檢測，包括血常規(guī)、凝血6項等常規(guī)項目檢測，并對患者的淋巴細胞亞群分布、炎癥指標及細胞因子進行連續(xù)監(jiān)測。此外，也將患者的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等標本送往上海市疾病預防控制中心病原生物檢定所病毒檢測實驗室進行SARS-CoV-2核酸檢測。該患者D8血漿標本在上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院PCR實驗室采用圣湘生物(長沙)新型冠狀病毒檢測試劑盒進行核酸檢測。并將患者血清標本送至上海交通大學系統生物學研究院通過蛋白芯片檢測患者血清中SARS-CoV-2的S1蛋白和N蛋白抗體表達情況。

2 結 果

2.1一般實驗室檢測結果 本研究收集該例患者在入院診治過程中不同時間點的血液標本并進行相關檢測(表1)。在感染早期，患者的白細胞略有降低，且淋巴細胞的數量低于正常值，血小板出現過程性消耗后逐步恢復(圖1A)。炎癥指標C反應蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)水平在疾病進展過程中持續(xù)保持升高的狀態(tài)，SAA水平變化差異較CRP水平更加明顯，繼發(fā)纖溶指標D二聚體水平有階段性升高，與血小板消耗相吻合(圖1B)。為了更好地探究淋巴細胞數降低對患者免疫功能的影響，將淋巴細胞亞群的百分比、絕對計數的結果也進行匯總，發(fā)現各細胞亞群數量均降低，并隨著患者病情的好轉逐漸恢復，而淋巴細胞亞群的百分比則呈波動狀態(tài)(圖1C)。對該患者外周血的細胞因子分泌情況的檢測發(fā)現，白細胞介素(IL)-6等水平均高于正常范圍，從折線圖中可以看出患者在D8存在病情加重的情況，除細胞因子的結果外，該患者的淋巴細胞亞群的分布變化也與這一病程相符(圖1C、D)。

表1 常規(guī)實驗室檢查結果

注：A表示白細胞相關檢測結果；B表示CRP、SAA及D二聚體檢測結果；C表示淋巴細胞亞群及其絕對計數；D表示細胞因子分泌情況。

2.2分子生物學檢測結果 鑒于患者在上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院就診時其臨床表現和流行病學特點提示可能為COVID-19的感染者。故在入院后對其采樣，送檢進行實時熒光定量PCR(qPCR)及測序分析，檢測結果如表2所示，在病情加重時可以在血液標本中檢測出病毒的存在。

2.3血清學病毒抗體結果 對患者不同時間點采取的血清標本，檢測其IgM和IgG含量。患者發(fā)病后1周左右(D8)就可見到IgM的表達，而IgG抗體則在D10才可以用膠體金法檢測出來(圖2A)。為了更好地了解患者血清中針對病毒抗體的種類，進行了蛋白芯片檢測。根據檢測結果可以看出，患者血清中抗S1蛋白抗體和抗N蛋白抗體的出現時間及含量存在差異，對抗S1蛋白抗體而言，無論是其IgM還是IgG的出現均早于抗N蛋白抗體，并且表達量也明顯較高(圖2B、C)。

表2 患者核酸檢測相關結果

注：A表示患者血清標本IgM和IgG膠體金免疫層析法檢測結果；B表示患者血清標本SARS-CoV-2的S1蛋白及N蛋白的抗體變化(顏色越深抗體檢測含量越高)；C表示蛋白芯片結果(D25):該蛋白芯片除包含SARS-CoV-2的S蛋白及N蛋白以外，其余為S蛋白的S1和S2部分切割成的200余條小肽，各蛋白質以斜三點點陣附著在蛋白芯片上。

3 討 論

COVID-19病毒潛伏期一般為3～7 d，但亦可長達14 d以上。臨床上以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現。但重癥病例多在1周后出現呼吸困難，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。在發(fā)病早期外周血白細胞總數正?；驕p低。多數患者CRP和紅細胞沉降率升高，降鈣素原水平正常。嚴重者D二聚體水平升高，外周血淋巴細胞進行性減少，與本次研究患者基本相符(圖1A、B)。在本次研究中，該患者于D1在武漢因口咽部不適就診，并在回上海后出現發(fā)熱癥狀并且咳嗽加重，故于D6前往上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院就診。經過對該名患者多個時間節(jié)點進行實驗室檢查，可以看出隨著其病程變化，各項指標的變化規(guī)律(表1、圖1)。

該名患者住院期間白細胞總數雖有波動但基本處于正常范圍之內，對疾病的診斷及監(jiān)測意義并不明確，但是淋巴細胞數持續(xù)處于下降的狀態(tài)；CRP與SAA水平在疾病期均高于正常范圍，并且與CRP水平相比，SAA水平的增高更加明顯，能夠更好地反映患者體內的炎癥狀況；血小板的數量在發(fā)病期間也明顯低于恢復期，其原因可能是在發(fā)病期間體內存在凝血激活，這也可與其D二聚體水平升高的表現相互印證(圖1A、B)。根據患者的病程發(fā)展，其在D8這一天有明顯的癥狀加重過程，包括出現D二聚體水平升高，各淋巴亞群數量明顯減低，血氣結果異常，并且總T細胞，CD4+和CD8+T細胞的數量大大減少，D8下午的檢測結果僅分別為267/μL，154/μL和93/μL，T細胞耗竭嚴重(圖1D)。說明COVID-19患者其淋巴細胞及各亞群數量的下降可能與其疾病程度密切相關。而與淋巴細胞亞群絕對計數相比，各淋巴細胞亞群百分比的變化卻并不能很好地體現這一點，整體來說變化幅度一般，沒有如CD3+T細胞絕對數那樣在D8明顯下降，且隨著疾病好轉不斷恢復上升。所以與淋巴細胞亞群相對比例比較，絕對計數的臨床價值更大?；颊叩募毎蜃咏Y果尤其是IL-6的數值在D8明顯升高，且患者D10的檢測結果提示其血氧飽和度僅為92.6%提示患者病情加重(表1)，故可推測細胞因子的相關指標變化可以更早地提示患者的免疫狀況，反映病情進展，在觀測患者疾病程度變化過程中存在預警性的臨床價值(圖1C)。目前有相關文獻認為，外周血中T細胞數量與血清IL-6、IL-10和TNF-α水平呈負相關，而該患者在D8表現為IL-6水平升高，T細胞數量明顯下降[3 ](圖1C、D)。而該患者雖然淋巴細胞數量明顯下降，IL-6水平明顯升高，但并未產生細胞因子風暴現象，疾病得到控制，并在治療下逐漸好轉至出院。

目前對于SARS-CoV-2實驗室檢查的確診方式還是病毒核酸檢測及DNA測序，常用的核酸檢測靶標有ORF1ab基因、N基因、E基因[4]。而病毒核酸檢測結果的準確性受多種因素影響，包括采樣方式、病毒載量、運輸保存及實驗操作等。本研究中患者D7結果中鼻咽拭子查出ORF1ab基因、N基因、E基因均為弱陽性，而痰液標本只有ORF1ab基因、N基因檢測出弱陽性，血液標本未檢出。為此D8重新采樣復查結果陽性，并且基因測序結果也與其相符。對血液標本進行ORF1ab基因、N基因檢測發(fā)現ORF1ab基因結果陽性(表2)。說明不同標本類型對檢測結果的影響不同，不同基因片段的檢測結果也存在差異。而結合患者在D8這一天存在癥狀加重的情況，提示可能出現一過性病毒血癥，導致可以在血液標本中檢測出SARS-CoV-2。

人體對于病原體感染的抵抗，主要依賴自身的免疫系統，隨著病毒感染，體內逐漸產生針對病原體的抗體對抗病毒損傷。IgM作為初次體液免疫應答中最早出現的抗體，能在短時間內起到對機體的保護作用，而IgG出現則略晚。根據膠體金免疫層析法研制生產的試劑盒由于其檢測快速的優(yōu)點可以作為核酸檢測的補充，為臨床診斷及治療提供依據。對于本次研究的患者而言，其在發(fā)病1周左右可以檢測出IgM抗體，而IgG抗體的檢出則要晚幾天。隨著患者臨床癥狀的好轉，IgG抗體的數量明顯增加，并且IgM抗體的含量仍然較高[5]，直到D46仍可檢出(圖2A)。而一般病毒的IgM抗體的持續(xù)時間為2周到1個月，SARS-CoV-2的IgM抗體持續(xù)時間較長的原因尚待探究，但應該警惕病毒感染由急性轉為慢性的可能。為了更進一步研究患者體內的抗體變化，將標本進行了蛋白芯片相關檢測。發(fā)現患者外周血中刺突蛋白S1對應的抗體，無論是IgM還是IgG均早于核心蛋白N對應的抗體。而N蛋白對應的抗體，IgM和IgG這兩種抗體出現的時間十分接近，并且含量較高(圖2B、C)。由此可見，SARS-CoV-2的S蛋白抗體在監(jiān)測病毒早期診斷上面的價值要優(yōu)于N蛋白抗體，并且已有相關研究證明SARS-CoV-2可以通過S蛋白與ACE2受體結合參與病毒侵入細胞內部的生物學過程[6]。而通過蛋白芯片的結果可以發(fā)現，S蛋白內的很多小肽也可以和患者血清標本中的抗體結合，說明SARS-CoV-2的S蛋白上存在豐富的抗原表位，在實際檢測中需要考慮S蛋白抗體假陽性的可能。

從上海首例COVID-19的整個收治過程中，對患者體內免疫細胞和細胞因子指標的變化有了一個動態(tài)、系統性的觀察，發(fā)現淋巴細胞亞群絕對計數及細胞因子結果對其疾病進程的發(fā)展有著重要的提示作用。血清抗體的動態(tài)觀察發(fā)現COVID-19患者體內產生的S1和N蛋白的IgM、IgG抗體的出現時間、持續(xù)時間及表達強度存在差異，但如何更好地診斷和治療SARS-CoV-2感染，仍有待繼續(xù)擴大樣本量進行更進一步的研究。