孫彥琳，程璧瑄，周利君，羅 昱，王 婧，萬會花，于 超

（花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室/國家花卉工程技術研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室/園林環(huán)境教育部工程研究中心/林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室/北京林業(yè)大學園林學院，北京 100083）

現代月季（Rosa spp.）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa L.）重要的觀賞植物類群。是由中國古老月季與歐洲的薔薇屬植物經過反復雜交，于1867年之后育成的一個龐大的品種群?，F代月季具有花型飽滿、花期長、花色豐富、花香迷人等優(yōu)點，具有極高的經濟價值和文化價值，是世界重要的觀賞植物[1]。

花色是觀賞植物最重要的觀賞性狀之一。對于花色表型的研究，傳統(tǒng)的研究方法是采用RHSCC（royal horticultural society color chart）或 ISCC-NBS色名表示法[2]。隨著現代科技的發(fā)展，儀器測色方法逐漸普及，依靠數字化技術實現色彩的數量化，使對顏色的描述轉變?yōu)榭陀^的定量描述，更加精準也便于交流，擴大了新品種選育和植物置景應用的前景[3-4]。

木本植物童期較長，通常需等到月季開花后才能對其花色進行分辨，使得現代月季的育種周期延長。前人通過觀察發(fā)現，月季嫩芽、嫩葉顏色較深的品種其花色往往也呈現出較深的顏色[5-6]，這說明月季新葉葉色與花色存在一定的相關性。然而前人研究僅停留在目視測色和對花色進行定性分析的水平，并沒有量化數據的支撐。此外，有學者對月季花瓣中花色素種類及其與花色的關系進行了詳盡的研究[7-10]，但對月季新葉色素與花色關系的研究尚未有報道。

本研究測量了月季新葉的SPAD值、花青苷含量，并采用CIELab系統(tǒng)對新葉和花的顏色進行定量描述。探究月季新葉葉色與花色的相關性，從月季早春嫩葉顏色推測開花花色，在一定程度上解決育種中存在的育種周期長、育種效率低等問題，也可為觀賞植物的早期選擇研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以“云蒸霞蔚”（Rosa' Yunzheng Xiawei'）ד太陽城”（R.'Sun City'）的183株F1代群體為試驗材料，材料均種植于北京林業(yè)大學小湯山實驗基地。所有植株生長環(huán)境相同、長勢一致。“云蒸霞蔚”為古老月季品種，“太陽城”為現代月季品種，遺傳背景復雜。二者表型及抗性均有較大區(qū)別，遺傳距離遠，其子代花色變異豐富，本試驗研究對象F1代群體花色包括了白、粉、紅、橙和黃5個色系，不同色系植株新葉色間存在差異，有黃綠色、綠色、紅色和紫紅色等，是開展花色與葉色研究的良好材料。

1.2 試驗數據測量

取供試植株健康新鮮、色澤均勻、無病菌無損傷、完全展開、葉色達到較穩(wěn)定階段的成熟新葉（月季新葉葉片從折疊到完全展開的48 h內），部位為植株地上部分15～20 cm之間，測定SPAD值和色彩參數，葉片處理后進行花青苷含量測定，并于盛花期測量花色數據。

1.2.1 SPAD值測定

使用TYS-A葉綠素儀對植株葉片SPAD值進行直接測定。先將葉片擦拭干凈，選取葉片的幾何中心、葉脈兩側且占比較大的顏色區(qū)域進行測量，每個植株測量3片新葉，每個葉片測量3次，計算平均值。

1.2.2 花青苷含量測定

每株取15～20片新葉，除去葉柄，用錫箔紙包裹后編號，迅速置于液氮中，后放入-80℃低溫冰箱保存，于次日進行花青苷含量的測定。將葉片充分研磨，用配置比例為甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1的浸提劑浸提樣品粉末里的花青苷，用超聲波清洗器超聲波震蕩輔助浸提并離心得到上清液，使用紫外可見光光度計（BioMate 3S）測定花青苷含量[11]。

1.2.3 葉片色差值測定

采用國際照明委員會推出的CIELab表色系統(tǒng)，用明度L*、色相a*、色相b*、色角度h及飽和度C等變量表示色彩。其中L*值反映顏色的明亮程度，0表示黑色，100表示白色。a*值反映紅色或綠色物質的濃度，a*＞0表示顏色偏紅，a*＜0表示顏色偏綠。b*值反映橙色或藍色物質的濃度，b*＞0表示顏色偏橙，b*＜0表示顏色偏藍。

對色差儀（NF333）進行黑白校準后，直接測量色彩參數L*、a*、b*值，每個植株測量3片新葉，計算平均值。之后根據a*、b*計算色彩屬性指標飽和度C∶C=（a*2+b*2）1/2，色度角h∶h=tan-1（b*/a*）。

1.2.4 花瓣色差值測定

每株采集盛花期（花被與花藥完全展開的時期）的新鮮花瓣3～5片，使用色差儀對花瓣顏色進行測定，測定位置選取每片花瓣十字交叉的中心，取平均值代表單個植株的花瓣色差值。

1.3 數據分析

試驗使用Excel 2016對數據進行整合與篩選，制表并且進行顯著性水平方差分析。使用SPSS 25軟件對月季新葉參數和花色參數進行相關性分析并計算回歸方程。

2 結果與分析

2.1 F1代植株新葉SPAD值、花青苷含量與色彩表型分布

F1代植株新葉SPAD值范圍為7.5～38.6，花青苷相對含量的范圍為0.14～3.37 μg/mg，新葉葉色隨著a*值從負值到正值的增大呈綠色-黃綠-紅色-紫紅色的變化。由圖1可知，a*值與新葉L*值、b*值呈顯著負相關關系，a*與b*的線性回歸方程為y=-0.703 5x+17.452（R2=0.63），a*與 L*的線性回歸方程為 y=-0.502 8x+34.186（R2=0.63）。

圖1 作圖群體葉色表型分布Figure 1 Leaf color distribution of the segregating population

2.2 F1代植株花色表型分布

本試驗采用于超[12]的分類方法，將F1代植株分為5個色系：紅色系、粉色系、橙色系、黃色系、白色系。根據CIELab空間表色系統(tǒng)對F1代的花瓣進行測定，5個色系的參數值的分布范圍如表1所示。

表1 F1代各色系花色CIELab參數統(tǒng)計分析Table 1 Statistical analysis on CIELab parameters of different petal color groups in F1population

利用箱線圖（圖2）對各色系的CIELab顏色系統(tǒng)參數進行分析發(fā)現，各色系L*、a*、b*值分布特征有一定的規(guī)律，可以將5個色系分開。黃色系、白色系L*值較大且分布集中，a*值低且有負值分布；白色系b*值偏低，但黃色系b*值分布較廣泛；紅色系的L*值小于其他色系，而a*值明顯高于其他色系；粉色系的L*值與a*值分布范圍相對寬泛，但是b*值明顯偏小；橙色系3個參數分布都較廣泛。

圖2 作圖群體各色系L*、a*、b*值箱線圖Figure 2 The box plot of different color groups of the segregating population according to L*，a*，b*

作圖群體在a*、b*色相坐標系中的分布如圖3A所示，5個色系呈分散分布但色系內明顯聚集，主要集中分布在第Ⅰ象限，部分黃色、白色系分布在第Ⅱ象限，而代表藍色、紫色的第Ⅲ、Ⅳ象限沒有分布。通過 L*、a*值散點圖（圖 3C）可以看出，L*與 a*呈負相關，擬合的線性回歸方程為y=-0.53x+86.494（R2=0.95）。L*、a*、b*值三維坐標圖（圖 3B）可以更加直觀地展示各個花色的分布規(guī)律，總體上各色系呈三維帶狀分布，粉色、紅色系分布距離更接近a*軸和L*軸下部，顏色越黃距離b*軸越近。

不同色系的明度L*與飽和度C之間的關系不同，根據被測植株的L*值和C值在二維坐標的分布，可將其分為兩個類群（圖3D）。第一類群包括白色和黃色系，L*值隨C值的增大而減小，斜率較小，散點分布幾乎平行于x軸（圖4A）；第二類群包括粉色、紅色和橙色系，L*值隨C值增大顯著減小，斜率較大（圖4B）。第一類群L*值與C值線性回歸擬合水平并不顯著（R2=0.20），第二類群的L*值與C值之間線性回歸擬合水平較顯著（R2=0.76），擬合函數為y=-0.541 4x+93.298。

圖3 作圖群體花色表型分布圖Figure 3 Flower color distribution of the segregating population

圖4 作圖群體L*值與C值關系Figure 4 Relationships between L*and C among segregating population

2.3 新葉SPAD值、花青苷含量、色差值與花瓣色差值相關性分析

在對F1代植株各色系新葉花青苷含量、SPAD值、色差值統(tǒng)計分析（表2）中得出，紅色系新葉花青苷平均含量最高，新葉L*均值較小、a*均值最大、C均值最小，說明其新葉色較紅、較暗、飽和度較低。而白色、黃色系花的參數值表現出相反的特征，新葉花青苷平均含量低、新葉亮度高，葉色偏綠、飽和度較高。粉色系與橙色系的花青苷含量和新葉L*、a*均值居于紅色和白黃色系之間。

表2 F1代植株各色系新葉花青苷含量、SPAD值、色差值統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis on SPAD value,anthocyanin content and CIELab parameters of different color groups in F1population

花瓣L*、a*、C值、新葉花青苷含量與新葉5個色差參數間都呈現極顯著相關（表3）。花瓣L*和a*與新葉花青苷含量的相關性最強，相關系數分別為-0.400和0.439，回歸方程分別為：y=-5.527 4x+80.829（R2=0.16）、y=11.091x+9.827 1（R2=0.19）。此外花瓣飽和度C與新葉花青苷含量也呈極顯著正相關；在葉色色差與花色色差值的相關性中，新葉L*值和花瓣L*值、新葉a*值和花瓣a*值之間均呈極顯著正相關，新葉a*值與花瓣L*值、新葉L*值與花瓣a*值、新葉C值和花瓣C值呈極顯著負相關。說明葉色越亮則花色越亮，葉色越紅則花色越紅，葉色越紅花色越暗，葉色越暗花色越紅?；ò晟钪蹬cSPAD值的相關性較弱，僅與花色b*、h間存在正相關和負相關關系。

表3 F1代植株新葉SPAD值、新葉花青苷含量、色差值與花瓣色差值之間的相關系數Table 3 Correlation coefficient between new leaf SPAD value,anthocyanin content,chromatic aberration and flower chromatic aberration in F1population

3 討論與結論

花色是月季重要的觀賞性狀，“云蒸霞蔚”ד太陽城”的F1代5個花色色系的植株在a*和b*二維象限圖中主要分布在第Ⅰ象限，部分白色和黃色系資源分布在第Ⅱ象限，而在代表紫色、藍色的Ⅲ和Ⅳ象限沒有分布。這是由于在月季資源中缺少合成飛燕草素苷的關鍵酶—F3’5’H，導致月季代謝途徑中只存在形成紅色的天竺葵素苷和矢車菊素苷兩條代謝通路，使整個月季資源中沒有真正的藍色花[13]。因此在月季花色的改良育種工作中，進一步豐富月季中花青素苷合成途徑的基因資源，建立飛燕草素苷生物合成途徑，對培育藍色月季具有重要意義。

在現代月季的研究、選育與生產工作中，研究者通常需等到月季開花后才能對其花色進行分辨，使得現代月季的育種周期延長，因此開展早期預選研究對縮短育種周期有重要意義。在植物發(fā)育中，不同器官之間存在相關性，林木早期選擇就是是利用幼年與后期性狀的相關性，對生長作出預測，從而縮短育種評定時間,提高選擇效率[14-15]。國內外學者對多個樹種開展了早期選擇研究,取得了重大進展[16-18]。在觀賞植物中也有對早期選擇的研究。孫凡雅等研究發(fā)現，觀賞海棠父本木質部與其花瓣花色苷含量的存在顯著相關性，可以利用木質部花色苷含量可以對雜交后代的花色、果色進行預選[19]。本實驗通過探討月季新葉花青苷含量、SPAD值、色差值與花色的相關性，能夠通過月季早春新葉推測花色，能夠在一定程度上對月季進行早期選擇。

圖5 作圖群體新葉花青苷含量與花瓣L*值、a*值關系Figure 5 Relationships between new leaf anthocyanin content with petal L*and a*among segregating population

程怡等[8]研究粉色月季品種‘仙境’發(fā)現花青苷對花色形成起直接作用，本實驗中新葉花青苷含量與花瓣L*和a*的關系是所有葉色參數與花色參數中關聯性最強的。在對新葉花青苷含量與花色的相關性分析中得出，花青苷含量與花瓣L*值呈顯著負相關，與a*和C呈顯著正相關，說明新葉花青苷含量越高，花色越紅、越暗、色彩飽和度越低；花青苷含量低，花色偏黃色和白色。在月季葉色和花色的相關性研究中，唐仕榮[5]發(fā)現月季嫩枝莖葉的顏色與開花花色存在一定的對應規(guī)律，如嫩枝莖葉為紅色，其花色多為紅色，且紅的程度決定花朵紅色的程度。王升等[6]對月季花色與幼嫩芽、葉的相關性進行分析也發(fā)現，月季嫩芽、嫩葉顏色較深的品種花色往往較深。本試驗通CIELab系統(tǒng)對花色與葉色進行量化描述，進一步驗證了前人的結論。試驗得出，新葉L*值和花瓣L*值、新葉a*值和花瓣a*值之間均呈顯著正相關，新葉a*值與花瓣L*值、新葉L*值與花瓣a*值以及新葉C與花色C值間呈顯著負相關。

綜上所述，新葉花青苷含量越低、L*值（亮度）越大（亮）、a*值越小（新葉色越綠）、C均值越大（色彩飽和度高）則花色L*值（亮度）越大（亮）、a*值越小，花色偏白色和黃色系。反之，花色偏紅色系和橙色系。