李學(xué)峰 周世豪 王新花 龐益?zhèn)?王雁林 李清春 刁興華 劉海燕

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 山東 濱州 256603

一氧化氮(nitric oxide,NO)是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種介導(dǎo)血管舒張的主要神經(jīng)遞質(zhì)，與陰莖勃起功能障礙密切相關(guān)[1]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是調(diào)節(jié)NO濃度的關(guān)鍵酶。非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是NOS的內(nèi)源性抑制物，因而ADMA是體內(nèi)NO合成的抑制性調(diào)節(jié)物，90%以上的內(nèi)源性ADMA由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine-dimethylamine hydrolase，DDAH)水解代謝，因而體內(nèi)NO的濃度與DDAH的活性含量有關(guān)。DDAH有DDAH1和DDAH2兩種亞型，DDAH1主要分布在腎小管、肝臟，而DDAH2主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，與內(nèi)皮型NOS表達(dá)的組織一致[2-4]。利用干細(xì)胞治療可以明顯改善勃起功能障礙動物的勃起功能，脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)取材于睪丸附睪周圍的脂肪組織，操作簡單，技術(shù)成熟，分離成功率高，并發(fā)癥少，是理想的載體[5-6]。本研究應(yīng)用基因工程技術(shù)將DDAH2基因?qū)敫杉?xì)胞基因組中，使DDAH2在ADSCs持續(xù)表達(dá)，降低ADMA生成，提高NO生成，改善修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而期望在以后的臨床應(yīng)用上達(dá)到改善勃起功能的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性SD大鼠，體質(zhì)量為(100±30)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(滬)2017-0005。Ad-DDAH2-GFP(上海吉凱生物有限公司)，低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清、胰酶(Gibco公司)，DDAH2抗體(H-85)(santa cruz biotechnology公司，No. sc-32859)，β-Actin抗體(Epitmics公司)，PCR試劑盒(TaKaRa公司)。培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠ADSCs的分離培養(yǎng) 3月齡雄性SD大鼠，頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡30 min，超凈工作臺內(nèi)將大鼠固定。取雙側(cè)腹股溝區(qū)切口，充分分離切取皮下脂肪組織，將脂肪組織剪成盡可能小的組織小塊，加入2倍體積0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃震蕩消化30～45 min；加入DMEM完全培養(yǎng)基混勻后1 000 r/min離心10 min。棄除上層脂肪組織消化液，加入2倍體積DMEM完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻，并將液體于200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾；1 000 r/min離心10 min，棄除上清，用DMEM完全培養(yǎng)基充分懸浮細(xì)胞沉淀，細(xì)胞計數(shù)后接種至培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)換液。待細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%～90%時，棄除培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，滅菌PBS輕輕漂洗2次，加入1.5～2.0 mL 0.25%胰蛋白酶細(xì)胞消化液(含0.02% EDTA)，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待細(xì)胞形態(tài)變圓且開始從培養(yǎng)瓶壁脫落時即可終止消化；輕輕拍打瓶壁，加入1.5～2.0 mL完全培養(yǎng)基終止消化，并沿培養(yǎng)瓶壁順序充分吹打混勻制成單細(xì)胞懸液，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Ad-DDAH2-GFP對ADSCs轉(zhuǎn)染效率的測定 根據(jù)重組腺病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)將實驗分為MOI=0、MOI=20、MOI=40、MOI=60、MOI=80和MOI=100轉(zhuǎn)染組，每個轉(zhuǎn)染組又分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染組)和實驗組(Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染組)2個亞組，每組同時設(shè)3個復(fù)孔。將生長狀態(tài)良好的第4代大鼠ADSCs種于24孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞融合至60%～70%，將病毒原液滴度稀釋為1.0×108PFU/mL，棄除孔內(nèi)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染孔內(nèi)依次加入病毒稀釋液和無血清DMEM培養(yǎng)基，充分混勻，培養(yǎng)24 h后，將孔內(nèi)培養(yǎng)基更換為1ML DMEM完全培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，250 mL PBS重懸細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察各MOI值轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)各MOI值轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞狀態(tài)選取最佳MOI值。

1.2.3 DDAH2基因在ADSCs中的表達(dá) 在最佳MOI值轉(zhuǎn)染前提下，轉(zhuǎn)染ADSCs 48 h后，提取細(xì)胞mRNA、總蛋白，通過RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測DDAH2表達(dá)情況。實驗分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染組)、陰性轉(zhuǎn)染組(Ad-NC-GFP轉(zhuǎn)染組)和實驗組(Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染組)3個組，每組同時設(shè)立2個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs的分離和培養(yǎng) 原代細(xì)胞培養(yǎng)72～96 h后，大部分細(xì)胞貼壁生長，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞多呈多角形、短梭形，偶見長梭形細(xì)胞(圖1)。

2.2 大鼠ADSCs的生長曲線 第4代大鼠ADSCs的生長曲線呈“S”形(圖2)。細(xì)胞于第1～2天生長較緩慢，第3天后呈對數(shù)生長，第8天后生長速度減慢，并進(jìn)入平臺期，第9天后細(xì)胞生長速度呈下降趨勢。

圖2 第4代ADSCs的生長曲線

2.3 大鼠ADSCs的免疫表型鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，第4代ADSCs的CD29、CD90表達(dá)呈陽性，表達(dá)率分別為(95.83±0.53)%、(91.32±0.27)%，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD45表達(dá)呈陰性，表達(dá)率為(1.59±0.06)%，符合ADSCs免疫表型特征，這表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為ADSCs(圖3)。

圖3 第4代ADSCs的免疫表型檢測結(jié)果

2.4 Ad-DDAH2載體質(zhì)量檢測 pH值判定：腺病毒保存液pH值范圍在6.4～7.0之間。粘稠度判定：用20～200 μL規(guī)格移液器緩慢吸取50 μL腺病毒保存液體，無明顯粘稠感或吸液滯后現(xiàn)象。無菌檢測：將腺病毒加入HEK293細(xì)胞驗證，正常培養(yǎng)24 h后鏡檢，無任何細(xì)菌及真菌污染情況，同時參照空白細(xì)胞組，細(xì)胞間隙無明顯顆粒存在，培養(yǎng)基澄清透明。腺病毒滴度測定：以 10-6～10-12稀釋比病毒液轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞10 d后，致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)嚴(yán)重程度隨稀釋倍數(shù)的增加而減弱，Ad-DDAH2病毒滴度為2×1010PFU/mL，可滿足后續(xù)研究需求(圖4)。

A. 病毒液稀釋比為10-6；B. 毒液稀釋比為10-8；C. 毒液稀釋比為10-10； D. 毒液稀釋比為10-12；E. 空白對照組。圖4 腺病毒的滴度測定(倒置顯微鏡，×100)

2.5 Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs的效率 腺病毒轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞漿內(nèi)開始表達(dá)GFP，且陽性率隨MOI值增大而增加，48 h后GFP表達(dá)顯著增強(qiáng)。Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染效率隨MOI值的增大而增加，MOI=80～100時轉(zhuǎn)染效率雖然達(dá)到90%以上，但細(xì)胞CPE陽性率隨著MOI值增大而逐漸增加。MOI=80對ADSCs的生長無顯著影響，為Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs的最佳MOI值(圖5)。

2.6 DDAH2在ADSCs中的表達(dá) 通過PCR對DDAH2基因進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs 24 h后，DDAH2基因在mRNA水平顯著上調(diào)，見151bp陽性條帶(圖6A)，與空白對照組及陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明，腺病毒介導(dǎo)的DDAH2基因在大鼠ADSCs中有效表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h后，通過Western Blot技術(shù)于第3泳道130～250 kDa處檢測到約為25 kDa的條帶(圖6B)。這表明，DDAH2蛋白在ADSCs中有效表達(dá)，從而證實Ad-DDAH2-GFP構(gòu)建成功，并在ADSCs中穩(wěn)定表達(dá)。

A. MOI=0；B. MOI=20；C. MOI=40；D. MOI=60；E. MOI=80；F. MOI=100。圖5 不同MOI情況下Ad-DDAH2-GFP轉(zhuǎn)染ADSCs的效率(倒置顯微鏡，×200)

3 討論

NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種介導(dǎo)血管舒張的主要神經(jīng)遞質(zhì)，NO的濃度與DDAH的活性含量呈正相關(guān)。DDAH2對NO-cGMP通路的完整性具有重要的意義，因此，DDAH2基因治療是治療糖尿病、勃起功能障礙、慢性腎病的潛在可行方法[7-9]。

A. DDAH2mRNA在ADSCs中的表達(dá)；B. DDAH2蛋白在ADSCs中的表達(dá)。1. 空白對照組(PBS)；2. Ad-null-GFP組；3. Ad-DDAH2-GFP組。圖6 DDAH2在ADSCs中的表達(dá)情況

干細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，一直是生物學(xué)研究的熱點，其中ADSCs由于取材方便，增殖能力較強(qiáng)，干細(xì)胞性狀穩(wěn)定，受到廣大研究者的普遍認(rèn)可，基因修飾干細(xì)胞治療需要載體將目的基因轉(zhuǎn)移到干細(xì)胞內(nèi)，使干細(xì)胞在基因水平上發(fā)生改變，但不影響細(xì)胞的正常功能，再通過體內(nèi)回輸達(dá)到治療疾病的目的。腺病毒作為雙鏈DNA病毒，轉(zhuǎn)染率高，既可以轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞，也可以轉(zhuǎn)染靜止期細(xì)胞，對靶細(xì)胞病理性損害小，轉(zhuǎn)染后的基因，尤其是大片段基因能表達(dá)數(shù)天到數(shù)周，因此作為基因載體廣泛應(yīng)用于治療研究中[10-12]。

在本研究中，腺病毒載體在最佳MOI=80條件下，轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上，且干細(xì)胞毒性較小。DDAH2基因?qū)階DSCs基因組后，使DDAH2在ADSCs中持續(xù)表達(dá)，然后將轉(zhuǎn)染后的ADSCs注射到體內(nèi)。利用ADSCs能夠特異性遷移到損傷器官/組織，在不同條件下分化成不同的細(xì)胞類型，導(dǎo)入的基因可長期穩(wěn)定表達(dá)，植入體內(nèi)無免疫反應(yīng)等特點，可以修復(fù)損傷組織細(xì)胞。此外，DDAH2在基因水平上提高了NO生成，改善修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，增強(qiáng)局部抗氧化應(yīng)激的能力[13-16]。本研究成功將干細(xì)胞治療和基因治療結(jié)合起來，為臨床DDAH2基因修飾ADSCs治療提供指導(dǎo)意義。