3種主要短鏈脂肪酸減輕5-氟尿嘧啶誘發(fā)的THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)

席月， 陳述， 丁龍坤， 夏雯， 戴曉玥， 閆曼，張敏， 吳亮， 馬潔， 陰晴， 許化溪

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids， SCFAs)是腸道內(nèi)厭氧菌發(fā)酵膳食纖維的主要代謝產(chǎn)物，主要有乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉，占總量90%以上，通常以離子狀態(tài)存在[1-2]。SCFAs可促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖，減輕腸黏膜萎縮，維護(hù)腸黏膜的正常形態(tài)。臨床研究結(jié)果表明，通過增加膳食纖維或SCFAs攝入量，可以改善結(jié)直腸炎患者治療效果，但其確切機(jī)制仍不明晰[3]。

5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是目前常用的一類抗癌藥物，通過干擾DNA合成阻斷腫瘤細(xì)胞分裂增殖，廣泛用于乳腺癌、胃腸道腫瘤和頭頸部腫瘤等治療[4-5]。但是，在治療過程中有40%～80%患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重腸黏膜炎等不良反應(yīng)，甚至造成化療無法繼續(xù)[6]。5-FU可以誘發(fā)健康小鼠腸道強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，并致其腸黏膜中巨噬細(xì)胞NOD樣受體家族3(NLRP3)炎癥小體活性顯著升高，而以5-FU刺激NLRP3基因缺陷小鼠則僅出現(xiàn)輕微的腸黏膜炎癥反應(yīng)[7]。因此，通過下調(diào)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化，抑制腸黏膜中炎癥反應(yīng)可以減輕5-FU誘發(fā)的腸黏膜炎，改善小鼠對(duì)5-FU的耐受程度。目前，關(guān)于SCFAs對(duì)5-FU所誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響尚不清楚。因此，本研究探討乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉對(duì)5-FU所誘發(fā)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人單核巨噬THP-1細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室自行保種和培養(yǎng)；5-FU注射液(天津金耀氨基酸有限公司)；乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉均為國產(chǎn)分析純；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(以色列BI公司)；熒光定量PCR儀、免疫印跡系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；2×TaqPCR預(yù)混液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBR Green染料法)、總RNA提取試劑盒均為南京諾唯贊公司產(chǎn)品；引物由蘇州金唯智生物科技公司合成；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、活性氧檢測試劑盒為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒以及兔抗TLR9、NLRP3、Caspase-1、Beclin-1、LC3-Ⅱ、組蛋白H1、NF-κB p65、鼠抗β-肌動(dòng)蛋白抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔或鼠抗體(美國ABclonal生物科技公司)；ECL顯色液(美國Thermo公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2穩(wěn)定傳代至第6代后用于本研究。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/孔)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。

1.3 細(xì)胞分組及處理

將THP-1細(xì)胞分為5組，分別為對(duì)照組、5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組、5-FU+丁酸鈉組和5-FU組。5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細(xì)胞預(yù)先分別以100 μmol/L乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉處理24 h，再與5-FU組一并加入2.5 mmol/L 5-FU刺激細(xì)胞24 h，誘發(fā)炎癥反應(yīng)；對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)任何處理。收集細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR檢測THP-1細(xì)胞炎性相關(guān)因子mRNA表達(dá)

用Trizol試劑抽提THP-1細(xì)胞總RNA，以oligo(dT)為引物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)總體系共20 μL，包括SYBR Green Master預(yù)混液10 μL，上、下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，cDNA模板2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性3 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，通過公式2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 ELISA法測定細(xì)胞因子水平

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液各2 mL，4 ℃、1 000 r/min離心20 min；取上清液，按ELISA試劑盒檢測上清液中IL-1β、IL-6和IL-10含量。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度值，繪制相應(yīng)細(xì)胞因子檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測通路相關(guān)蛋白和自噬蛋白表達(dá)

1.6.1 TLR9、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)檢測 每孔細(xì)胞中加入120 μL RIPA裂解液(含1.2 μL PMSF)于冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；收集上清液。100 V恒壓電泳120 min；300 mA恒流90 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；加入兔抗TLR9、NLRP3、Caspase-1、LC3-Ⅱ、Beclin-1和鼠抗β-肌動(dòng)蛋白抗體，1 ∶1 000稀釋，于4 ℃孵育過夜；次日以TBST緩沖液洗滌3次，每次15 min；加入羊抗兔(鼠)IgG-HRP (1 ∶2 000)室溫孵育1 h；TBST洗滌3次；采用ECL顯色液曝光顯色，通過灰度掃描分析分析各目的蛋白表達(dá)量。

1.6.2 胞質(zhì)和胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測 按照試劑盒使用說明書操作，每孔加入150 μL細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑A(含1.5 μL PMSF)劇烈振蕩5 s后冰浴15 min；加入細(xì)胞質(zhì)蛋白抽提試劑B 10 μL劇烈振蕩5 s后冰浴1 min；4 ℃、12 000 r/min離心5 min；收集上清液即獲得細(xì)胞質(zhì)蛋白；吸盡殘余上清液，在沉淀中加入50 μL細(xì)胞核蛋白抽提試劑(含0.5 μL PMSF)，冰上裂解30 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液即獲得細(xì)胞核蛋白。蛋白質(zhì)印跡檢測同“1.6.1”。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測活性氧水平

采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針法檢測THP-1細(xì)胞中活性氧水平。無血清培養(yǎng)基按照1 ∶1 000稀釋DCFH-DA至終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞重懸于稀釋后的DCFH-DA探針溶液中，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，每隔5 min顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針，再以無菌PBS重懸細(xì)胞后進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3種SCFAs對(duì)5-FU誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，5-FU組IL-1β和IL-6表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)；與5-FU組比較，5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組IL-1β表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)；5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組IL-6表達(dá)量均顯著降低(P<0.01)，其中5-FU+乙酸鈉組IL-6表達(dá)量下降較其他兩組更顯著(P<0.01)；5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組IL-10及其mRNA表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)。見圖1。

①：對(duì)照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較；c：P<0.05，與5-FU+乙酸鈉組比較圖1 qRT-PCR和ELISA法檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)及含量

2.2 3種SCFAs對(duì)THP-1細(xì)胞TLR9、NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，5-FU組TLR9、NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。與5-FU組比較，5-FU+乙酸鈉組和5-FU+丙酸鈉組細(xì)胞TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；5-FU+乙酸鈉組、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細(xì)胞NLRP3和Caspase-1mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖2。

①：對(duì)照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較圖2 qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測TLR9、NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)

2.3 3種SCFAs對(duì)THP-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，5-FU組細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與5-FU組比較，5-FU+乙酸鈉組相比、5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；與5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組比較，5-FU+乙酸鈉組細(xì)胞Beclin-1表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與5-FU+乙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組比較，5-FU+丙酸鈉組組細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。

①：對(duì)照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較；c：P<0.05，與5-FU+乙酸鈉組比較；d：P<0.05，與5-FU+丙酸鈉組比較圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測THP-1細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)

2.4 3種SCFAs對(duì)THP-1細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路活化能力的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示(圖4)，與對(duì)照組比較，5-FU組胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平則明顯降低(P<0.01)。與5-FU組比較，5-FU+乙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；5-FU+丁酸鈉組細(xì)胞胞質(zhì)中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平則明顯升高(P<0.01)。與5-FU+乙酸鈉組比較，5-FU+丁酸鈉細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

①：對(duì)照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較；c：P<0.01，與5-FU+乙酸鈉組比較圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測THP-1細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中NF-κB p65蛋白水平

2.5 3種SCFAs對(duì)THP-1細(xì)胞活性氧生成能力的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖5)，與對(duì)照組相比，其余4組活性氧生成水平均顯著升高(P<0.01)。

與5-FU組比較，5-FU+丙酸鈉組和5-FU+丁酸鈉組THP-1細(xì)胞活性氧水平顯著降低(P<0.01)。

①：對(duì)照組；②：5-FU+乙酸鈉組；③：5-FU+丙酸鈉組；④：5-FU+丁酸鈉組；⑤：5-FU組；a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與5-FU組比較圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測THP-1細(xì)胞活性氧水平

3 討論

5-FU在干擾腫瘤細(xì)胞DNA合成的同時(shí)也對(duì)正常組織細(xì)胞的DNA合成造成干擾，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并釋放出大量雙鏈DNA(dsDNA)。在此過程中，細(xì)胞自身dsDNA作為一種重要的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)，是誘發(fā)炎癥反應(yīng)和自身免疫損傷的關(guān)鍵因素[8]。死亡細(xì)胞釋放出的自身dsDNA可以經(jīng)免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等)表面TLR9受體識(shí)別，并將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)激活相關(guān)DNA感受器，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)5-FU可以上調(diào)THP-1細(xì)胞TLR9表達(dá)，并促進(jìn)NF-κB p65蛋白入核，激活NLRP3炎癥小體，最終導(dǎo)致各種促炎因子表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高。由此提示，5-FU可能通過TLR9/NF-κB/ROS信號(hào)通路激活THP-1細(xì)胞NLRP3炎癥小體繼而引發(fā)強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。

自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種特殊死亡形式，對(duì)于維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)有重要意義，在饑餓或其他應(yīng)激如缺氧、活性氧、DNA損傷等刺激下被激活[10-11]。Beclin-1基因是第一個(gè)經(jīng)確認(rèn)的哺乳動(dòng)物自噬調(diào)控基因，其編碼產(chǎn)物Beclin-1是自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白[12]。LC3-Ⅱ是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位于自噬體膜上的自噬相關(guān)蛋白，其含量與自噬泡數(shù)量成正比[13]。巨噬細(xì)胞是宿主固有免疫的重要組成部分，其大量自噬發(fā)生雖然可以降低各種炎性細(xì)胞因子的釋放，但機(jī)體免疫防御能力也隨著巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少而降低。確保降低巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)仍維持一定水平的免疫力是目前腫瘤治療面臨的兩難局面[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種SCFAs均可不同程度地抑制THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平，同時(shí)降低THP-1細(xì)胞自噬水平以維持細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)過3種SCFAs孵育后，THP-1細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子(IL-1β)表達(dá)顯著降低，而Th2型細(xì)胞因子(IL-10)表達(dá)顯著升高，提示SCFAs在抑制巨噬細(xì)胞過度炎癥反應(yīng)的同時(shí)，還有利于組織的修復(fù)，這對(duì)于腫瘤化療患者極為有利。

在人體腸道中，SCFAs濃度可達(dá)70～140 mmol/L，并迅速經(jīng)血液吸收，其中主要包括乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉[16]。腸道中發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs不僅能為腸黏膜上皮細(xì)胞增殖提供能量，促進(jìn)細(xì)胞代謝和生長，還可調(diào)節(jié)人體腸道菌群組成，減少有害菌的生長，防止腸道功能紊亂[17]。更重要的是，SCFAs能夠抑制免疫細(xì)胞釋放各種促炎因子，抑制腸道內(nèi)過度的炎癥反應(yīng)，減輕結(jié)直腸炎患者腸道黏膜損傷[18-19]。已有研究結(jié)果表明，3種重要SCFAs(乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉)均能減少免疫細(xì)胞促炎因子釋放，抑制炎癥反應(yīng)，并且在較低濃度(1～1 200 mol/L)即可促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10大量生成；同時(shí)乙酸鹽和丁酸鹽還可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路活化發(fā)揮抗炎作用[20]。本文研究結(jié)果與上述研究一致，丙酸鈉和丁酸鈉能顯著下調(diào)THP-1細(xì)胞促炎因子IL-1β表達(dá)，3種SCFAs均顯著降低細(xì)胞促炎因子IL-6表達(dá)，并顯著上調(diào)抗炎因子IL-10表達(dá)，丙酸鈉還可降低細(xì)胞活性氧生成，而乙酸鈉和丁酸鈉可以顯著抑制NF-κB p65蛋白移位至細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)。

綜上所述，3種SCFAs均可降低5-FU誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞自噬水平；丙酸鹽和丁酸鹽可以通過抑制NLRP3炎癥小體激活下調(diào)IL-1β表達(dá)；乙酸鹽和丙酸鹽可以抑制細(xì)胞TLR9活化，而丁酸鹽對(duì)細(xì)胞TLR9表達(dá)無明顯影響，但可以顯著顯抑制NF-κB p65蛋白移位至細(xì)胞核內(nèi)。3種SCFAs均可體外抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制并不完全一致，可能是因?yàn)镾CFAs可以作為能量物質(zhì)影響細(xì)胞自噬，也可作為組蛋白去乙?；敢种苿┯绊慛LRP3炎癥體，具體原因還有待進(jìn)一步探討。